一种微生物种属分析方法
【专利摘要】本发明提供一种微生物种属分析方法，所述的方法依次包括下列步骤：a）设计通用引物；b）以样本DNA为模板，使用步骤a）所述的通用引物扩增得到含有不同微生物基因片段的混合物，并回收产物；c）将步骤b）的产物克隆连入载体，转化感受态细胞，筛选得到阳性克隆；d）以步骤c）所述的阳性克隆为模板进行菌落PCR，回收产物；e）将步骤d）所述的产物进行测序。该方法较常规通用引物克隆测序法灵敏度和检出率明显提高，且采用的是蓝白斑筛选阳性克隆，速度快、效率高、准确性强，并可用于鉴定真菌，本发明为微生物群落多样性分析、食品微生物的检测和临床病原菌的检测提供了一种快速有效的方法。
【专利说明】一种微生物种属分析方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物检测和分析【技术领域】，具体地说，是一种微生物种属分析方法。【背景技术】
[0002]通用引物克隆测序法是利用通用引物克隆得到目的基因并对目的基因基因进行测序以鉴定微生物种属的方法，属于微生物种属分析的常规方法。例如在细菌性感染的病原学快速、准确诊断中，由于16S rRNA在细菌及其他微生物的进化过程中高度保守，被称为细菌的“分子化石”，为所有细菌共有，同时其保守性又是相对的，在保守区之间存在着9或
10个变异区(V1、V10)，不同细菌的科、属、种间都有不同程度的差异，故16S rRNA即可以作为细菌分类的标志，因此我们可以根据细菌16S rDNA的特点，在16S rDNA保守区设计PCR通用引物，用一对通用引物在适宜的PCR反应条件下就可以将所有细菌的相应基因片段全部扩增出来，再将回收的PCR产物进行测序即可鉴定细菌种属。通用引物克隆测序法克服了依赖于细菌的形态学、代谢产物、酶活性和表面抗原等表型特征进行细菌分类的传统微生物检测方法耗时长、阳性率低等缺点，因此被广泛应用于临床病原菌的检测和鉴定、环境微生物群落多样性分析和食品微生物的检测和鉴定等多个领域。
[0003]然而，DNA测序的成功有赖于高质量的模板DNA，在大多数情况下，不理想的测序结果都是由于DNA模板纯度不够所致。当DNA存在杂质如非特异性条带、RNA、蛋白质或其它金属离子等成分污染时，可能抑制DNA聚合酶的活性，从而使测序结果的信:噪比降低，一些序列无法判读。常规的 通用引物克隆测序法在使用通用引物PCR扩增后回收的产物是含有不同微生物相应基因片段的混合物，因而直接测序会导致有些序列无法测出，即有些微生物无法被鉴别出来，影响微生物群落多样性分析、食品微生物或者临床病原菌检测结果的准确性。
[0004]此外，真菌的种属分析尚无敏感性、特异性以及鉴定速度令人满意的方法。常用的真菌检测方法有传统生物学方法和血清学方法。传统生物学方法耗时长，检出率较低，部分真菌不能明确种属；血清学方法主要是针对真菌胞壁或胞内成分——烯醇化酶、beta-葡聚糖、甘露糖和Cand-Tec抗原等，但无法提供真菌种属。现有的血清学抗体检测特异性不高，免疫功能抑制者可呈假阳性。因而在微生物种群分析中，真菌的种属分析仍然是一个难点，缺乏有效的方法。
[0005]综上所述，亟需一种灵敏度高、特异性强、检测速度快且可以有效鉴定真菌的微生物种属分析方法。但是目前关于这类方法还未见报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种微生物种属分析方法。
[0007]本发明的再一的目的是，提供一种上述方法的用途。
[0008]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:
一种微生物种属分析方法，所述的方法依次包括下列步骤:a)设计通用引物；
b)以样本DNA为模板，使用步骤a)所述的通用引物扩增得到含有不同微生物基因片段的混合物，并回收产物；
c)将步骤b)的产物克隆连入载体，转化感受态细胞，筛选得到阳性克隆；
d)以步骤c)所述的阳性克隆为模板进行菌落PCR，回收产物；
e)将步骤d)所述的产物进行测序。
[0009]所述的感受态细胞是β -半乳糖苷酶缺陷型大肠杆菌感受态细胞。
[0010]所述的载体是pMD19T载体。
[0011]为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是:
如上所述的方法在非治疗目的的微生物种属分析中的应用；
如上所述的方法在非治疗目的的从微生物群落中检测和鉴定微生物种属中的应用； 如上所述的方法在环境微生物群落多样性分析中的应用；
如上所述的方法在食品微生物检测中的应用。
[0012]本发明优点在于:
1、本发明的方法在常规通用引物克隆测序法中增加了PCR产物连入载体、导入感受态细胞、筛选获得阳性克隆再菌 落PCR的步骤，然后再测序，灵敏度和检出率明显提高，为微生物群落多样性分析、食品微生物的检测和临床病原菌的检测提供了一种快速有效的方法;
2、本发明的方法采用的是蓝白斑筛选阳性克隆，筛选速度快，效率高，准确性强；
3、本发明的方法能敏感、快递的进行真菌的种属分析。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]附图1是pMD19T载体图谱。
【具体实施方式】
[0014]下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0015]实施例1
一、病例来源和标本收集
收集2011年6月-2012年4月于本院PI⑶和新生儿科、Cl⑶住院，疑症为脓毒症的患儿139例。男78例，女61例。患儿入院时均存在感染中毒症状，重症出现弥散性血管内凝血(DIC)及循环衰竭。于入院24h内，经严格无菌操作采集静脉血0.5ml (ADC抗凝)，装入灭菌的Eppendorf管中，置_20°C冰箱冻存待行PCR检查，同时行血培养及相关检查。
[0016]二、血培养检测
使用临床常规血培养方法检测病原菌，该方法为常规方法，具体可参见文献=HashairiF， Hasan H， Azlan K， Deris ZZ.An eight-year review of blood culture andsusceptibility among sepsis cases in an emergency department in NortheasternMalaysia.Trop Biomed.2011，28 (3): 599-605.三、血清学检测
使用临床常规血清学方法检测真菌，该方法为常规方法，具体可参见文献=PersatF，Renque S，Derouin Fj Michel-Nguyen A，Dicot S，Sulahian A.Contribution of the(I 一 3)-β -d-Glucan Assay for Diagnosis of Invasive Fungal Infections.J ClinMicrobiol.2008，46 (3): 1009-1013.四、本发明的通用引物克隆测序法检测 I实验材料 1.1仪器
高速离心机，低温平板离心机(Eppendorf),超净台，超声破碎仪，普通热循环仪(Eppendorf或Bio-Rad), Bio-Rad水平电泳仪,凝胶成像仪，生化培养箱，金属浴，水浴锅，测序仪(ABI )，计时器，微量加样枪。
[0017]1.2 耗材
10μ1、200μ1、1000μ1 tip头，1.5ml微量离心管，200μ1薄壁管，96孔板，封板膜。
[0018]I.3 试剂
Qiagen (Cat.N0.51304), TAKARA (EX tag HS)试剂，琼脂糖，6*loading buffer,BigDye3.l、5*sequencing buffer>P0P7 胶、10*buffer、HiDi 购于 ABI 公司，X-gal (20mg/ml), IPTG (200mg/ml)，蛋白酶 K，无水乙醇，70% 酒精，100% 酒精，NaAC (PH5.2),0.5M EDTA(PH8.0)，胶回收试剂盒(Bio-basic或赛百盛)，TAKARA pMD19T载体试剂盒(pMD19T载体图谱见图1)，DNA提取试剂盒，β -半乳糖苷酶缺陷型大肠杆菌Τ0Ρ10感受态细胞。
[0019]1.4培养基
LB培养液:胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl IOg ；
1.5%琼脂LB固体培养基:称取1.5g琼脂粉放入300ml锥形瓶，加100mlLB, 15 lbf/in2高压灭菌20min，稍冷却，制备 平皿。
[0020]2实验方法
2.1样本DNA的提取
按照DNA提取试剂盒的说明书进行以下操作:
①取外周血(应先高速离心12000rpm，5min，富集)，取200μ1加入20μ1蛋白酶K，超声20min ；
②加入200μ1AL，60°C金属浴IOmin ；
③加入200μ1无水乙醇，充分混匀；
④将混合液转移至离心管柱，8000-12000rpm,Imin ；
⑤弃滤液，换全新离心管，加入500μ1ffl, 8000-12000rpm, Imin ；
⑥弃滤液，换全新离心管，加入500μ1W2,8000-12000rpm,
⑦将离心管柱转移至全新1.5ml EP管，加50μ1 AE洗脱DNA。
[0021]2.2 PCR
2.2.1设计引物
通过Internet检索GenBank中常见细菌16S rDNA序列、真菌26S rDNA序列，在其保守区选择两对通用引物，在16S rDNA的保守区选择细菌通用引物，引物所在的基因位置分别为27-1492，扩增产物长度为1465bp ;在263 rDNA的保守区选择真菌通用引物，细菌及真菌引物所在的基因位置26S rDNADl/D2，扩增产物长度为600bp。通用引物序列如下:
【权利要求】
1.一种微生物种属分析方法，其特征在于，所述的方法依次包括下列步骤: a)设计通用引物； b)以样本DNA为模板，使用步骤a)所述的通用引物扩增得到含有不同微生物基因片段的混合物，并回收产物； c)将步骤b)的产物克隆连入载体，转化感受态细胞，筛选得到阳性克隆； d)以步骤c)所述的阳性克隆为模板进行菌落PCR，回收产物； e)将步骤d)所述的产物进行测序。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的感受态细胞是半乳糖苷酶缺陷型大肠杆菌感受态细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的载体是PMD19T载体。
4.如权利要求1-3任一所述的方法在非治疗目的的微生物种属分析中的应用。
5.如权利要求1-3任一所述的方法在非治疗目的的从微生物群落中检测和鉴定微生物种属中的应用。
6.如权利要求1-3任一所述的方法在环境微生物群落多样性分析中的应用。
7.如权利要求1-3任一所述的方法在食品微生物检测中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103509851SQ201210202522
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月19日 优先权日:2012年6月19日
【发明者】曹清, 李本尚, 丁丽霞, 周云芳, 李璧如, 潘淑华, 王希华 申请人:上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心