转基因产品中Te9基因检测用的检测方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于转基因植物产品的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测转基因产品中Te9基因的检测方法。方法包括PCR扩增反应液和上游引物Te9-F：5’-TTTGAGAATGAACAAAAGGACCATAT-3’；下游引物Te9-R：5’-GG?TTTTCGCTATCGAACTGTGA-3’；Taqman-MGB探针Te9-MGBP：FAM-ATTCATTAACTCTTCTCCATCC-MGB。转基因产品中Te9基因的检测方法包括转基因植物产品DNA的提取、Te9基因的实时荧光PCR扩增和使用荧光定量PCR仪随机软件分析扩增结果并进行结果判定。其优点是快速、特异性强、灵敏度高、操作简便。
【专利说明】转基因产品中Te9基因检测用的检测方法和试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于转基因植物产品的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测转基因产品中Te9基因的检测用检测方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002]在发展中国家，人口增长和食物短缺的矛盾日益尖锐，同时伴随着耕地减少、生物种植和生存环境的恶化，转基因技术是解决这些问题的最有效途径，转基因技术不仅极大地提高了作物育种的效率，育成了一些具有突出特点的新品种，而且转基因作物无论是在产量、品质还是抗逆能力等方面都有显著的优势，更突出的是转基因技术可极大地降低农业生产的成本，缓解不断恶化的农业生态环境。自1983年第一例转基因植株问世以来，世界已在35个科120多个种中获得了转基因植株，主要集中在大豆、玉米、油菜、棉花、马铃薯、西瓜、西葫芦和木瓜上。
[0003]在享有转基因技术带来的巨大实惠的同时，转基因产品潜在的生态安全、食品安全问题也日益引起人们的关注，各国纷纷制定相应的法律法规对转基因产品进行监管。除美国、加拿大、阿根廷和中国香港特区实行自愿标识制度外，国际上大多数国家如欧盟各国、匈牙利、瑞士、波兰、日本、韩国等均制定了强制性标识制度。我国于2001年、2002年颁布实施《农业转基因生物安全管理条例》及《农业转基因生物标识管理办法》，启动了农业转基因生物的监督监管机制。我国政府规定，凡是列入标识管理目录并用于销售的农业转基因作物，应当加以标识，未标识和不按规定标识的，不得进口和销售，因此，必须对转基因产品进行有效的检测。
[0004]目前转基因产品的检测，主要采用蛋白检测和DNA检测的方法。两类方法，对于不同产品中转基因成分的检出和定量检测，各有优、缺点。以DNA为测试对象的方法与以蛋白为测试对象的方法相比，在产品成分复杂的情况下，目标DNA可以有效提取，受产品机制的影响较小；此外，DNA比较稳定，不像蛋白质组成那样易受加工工艺的影响。Te9基因为来源于豌豆二磷酸核酮糖羧化酶基因的终止子，可作为转基因植物产品的筛选基因，利用荧光PCR技术检测具有灵敏、特异的优点。
【发明内容】
[0005]本发明属于转基因植物产品的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测转基因产品中Te9基因的检测用方法，以克服基于蛋白的检测方法在某些产品检测中的局限性，为转基因产品检测提供有效工具，从而加强转基因产品的监督监管，确保产品标签的一致性，保护消费者的知情权和选择权。
[0006]本发明的主要原理为:针对保守序列设计一组引物(上游引物:Te9_F:5，-tttgagaatgaacaaaaggaccatat-3 ;下游引物 Te9_R:5，-ggttttcgctatcgaactgtga-3?；Taqman-MGB 探针 Te9_MGBP:FAM_attcattaactcttctccatcc_MGB。)。进行核算检测时，模板DNA经加热至94-95°C—定时间后，DNA双链解离，引物及Taqman-MGB探针与模板特异性集合。MGB探针的5端标记有报告集团，3端由非荧光淬灭集团，同时还连接有MGB修饰集团(MinorGroove Binder)。当探针完整的时候,报告集团所发射的突光能被淬灭集团吸收,仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中，遇到与模板结合的探针时，其3’一 5’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告集团原理淬灭集团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。随着PCR循环的增加，目的片段成指数增长，荧光信号也同步增强，荧光信号的强弱直接反映模板数量。
[0007]本发明涉及的转基因产品中Te9基因的检测方法，其中的试剂包括如下:
[0008](I) PCR扩增反应液A
[0009]包括10父？0?反应缓冲液、0.1-0.411111101/1dNTP、2_4mmol/L硫酸镁、1-2U Taq 酶、
0.2-0.6ymol/L 上游引物、0.2-0.6 μ mol/L 下游引物、0.2-0.6ymol/L Taqman-MGB 探针；
[0010]其中IOXPCR反应缓冲液含有100mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、500mmol/L氯化钾和I %曲拉通X-100 ;
[0011]上游引物Te9-F:5，-tttgagaatgaacaaaaggaccatat-3?；下游引物 Te9-R:5，-ggttttcgctatcgaactgtga-3，；Taqman_MGB 探针 Te9_MGBP:FAM_attcattaactcttctccatcc-MGBo
[0012]其中上游引物、下游引物、Taqman-MGB探针的体积比为:1:1:1;
[0013]其中dNTP内的四种脱氧 核糖核酸的混合物的质量比为dTTP: dATP: dGTP: dCTP = 1:1:1:1。
[0014]⑵阳性对照DNA
[0015]上面所述PCR扩增反应液A，每管24 μ L的最佳组成为:2.5μ L IOXPCR反应缓冲液、2 μ L 2.5mmol/LdNTP(四种脱氧核糖核酸的混合物)、2 μ L 25mmol/L硫酸镁、I μ L1(^11101/1上游引物、14 1^ 1(^11101/1下游引物、14 1^ 10ymol/L Taqman-MGB探针、0.3 μ LTaq 酶、14.2μ L ddH20。
[0016]使用上述试剂盒检测转基因植物产品中Te9基因的方法，依次包括下列步骤
(1)-(3):
[0017](I)待检样品DNA的提取
[0018]DNA提取可采用DNA提取试剂盒。
[0019](2)转基因植物产品中Te9基因的实时荧光PCR扩增
[0020]A.在装有24 μ L PCR扩增反应液A的反应管中加入I μ L待检样品DNA，混匀。
[0021]B.将PCR反应管放入荧光PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:
[0022]95 0C 3min，l 个循环；
[0023]95°C 30s, 60°C 30s，共 40 个循环。
[0024](3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例对本发明做进一步说明。
[0026]实施例1
[0027]按下述方法检测转基因油菜GT73，使用MSlxRFl、MSIxRF2、MS8xRF3转基因油菜品系做阴性对照:[0028]包括10XPCR 反应缓冲液、0.2mmol/L dNTP、2mmol/L 硫酸镁、1.5U Taq酶、0.4ymol/L 上游引物 Te9-F:5，-tttgagaatgaacaaaaggaccatat-3，；下游引物 Te9_R:5，-ggttttcgctatcgaactgtga-3，；Taqman-MGB 探针 Te9_MGBP:FAM-attcattaactcttctccatcc-MGB。其中 10XPCR 反应缓冲液含有 10Ommol /I, ρΗ8.8 的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、500mmol/L氯化钾和1%曲拉通X-100 ；
[0029]按照以下程序进行检测:
[0030](I)待测转基因植物样品DNA的提取
[0031]采用安比奥试剂盒(GenoDNAPlant Mini Kit)
[0032]A.充分研磨
[0033]B.最多每75mg鲜料或 15mg干材料样品中加400 μ g Buffer API, 0.5 μ I RNaseA,充分混匀；
[0034]C.在65°C培养lOmin，期间上下颠倒离心管2-3次；
[0035]D.力[]130μ1 Buffer AP2,混匀，冰上放置 5min, 14000rpm 离心 5min ;
[0036]E.将上清转入新的1.5ml离心管内，加1.5倍体积的Buffer AP3/E,颠倒3-4次，混匀；
[0037]F.把溶液小心转入2ml收集管的吸附柱内，1000Orpm离心lmin，如果一次离不完，
可多次加样直至过柱完成，倒掉收集管中的液体；
[0038]G.加 500 μ I Buffer AWl, 1000Orpm 离心 lmin,倒掉收集管中的液体；
[0039]H.加 500 μ I Buffer AW2, 1000Orpm 离心 lmin,倒掉收集管中的液体;
[0040]1.重复8步一次；
[0041]J.14000rpm离心3min,将离心柱转移至一干净1.5ml离心管内；
[0042]K.小心加50-100 μ I Buffer AE至吸附柱滤膜上,室温静置l_5min, 1000Orpm离心lmin ;4°C保存。也可等同采用CTAB法。
[0043](2)待测转基因植物样品DNA的实时荧光PCR扩增
[0044]A.在PCR反应管中加入24 μ L PCR反应液A和I μ L样品DNA，混匀。
[0045]B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:
[0046]95°C 3min, I 个循环；
[0047]950C 30s, 600C 30s，共 40 个循环。
[0048](3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。
[0049]实施例2
[0050]按下述方法检测转基因大豆M0N89788，使用MSlxRFl、MSIxRF2、MS8xRF3转基因油菜品系做阴性对照:
[0051]包括10XPCR 反应缓冲液、0.2mmol/L dNTP、2mmol/L 硫酸镁、1.5U Taq酶、0.4ymol/L 上游引物 Te9-F:5，-tttgagaatgaacaaaaggaccatat-3，；下游引物 Te9_R:5，-ggttttcgctatcgaactgtga-3，；Taqman-MGB 探针 Te9_MGBP:FAM-attcattaactcttctccatcc-MGB。其中 10XPCR 反应缓冲液含有 10Ommol /I, ρΗ8.8 的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、500mmol/L氯化钾和1%曲拉通X-100 ；
[0052]按照以下程序进行检测:
[0053](I)待测转基因植物样品DNA的提取[0054]采用安比奥试剂盒(GenoDNAPlant Mini Kit)
[0055]A.充分研磨
[0056]B.最多每75mg鲜料或 15mg干材料样品中加400μ g Buffer ΑΡΙ,Ο.5μ I RNaseA,充分混匀；
[0057]C.在65°C培养lOmin，期间上下颠倒离心管2-3次；
[0058]D.力[]130μ1 Buffer AP2,混匀，冰上放置 5min, 14000rpm 离心 5min ;
[0059]E.将上清转入新的1.5ml离心管内，加1.5倍体积的Buffer AP3/E,颠倒3-4次，混匀；
[0060]F.把溶液小心转入2ml收集管的吸附柱内，1000Orpm离心lmin，如果一次离不完，
可多次加样直至过柱完成，倒掉收集管中的液体；
[0061]G.加 500 μ I Buffer AWl, 1000Orpm 离心 lmin,倒掉收集管中的液体；
[0062]H.加 500 μ I Buffer AW2, 1000Orpm 离心 lmin,倒掉收集管中的液体;
[0063]1.重复8步一次；
[0064]J.14000rpm离 心3min,将离心柱转移至一干净1.5ml离心管内；
[0065]K.小心加50-100 μ I Buffer AE至吸附柱滤膜上，室温静置l_5min, 1000Orpm离心lmin;4°C保存。也可等同采用CTAB法。
[0066](2)待测转基因植物样品DNA的实时荧光PCR扩增
[0067]A.在PCR反应管中加入24 μ L PCR反应液A和I μ L样品DNA，混匀。
[0068]B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:
[0069]95°C 3min, I 个循环；
[0070]950C 30s, 600C 30s，共 40 个循环。
[0071](3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。
【专利附图】
【附图说明】
[0072]图1油菜GT73荧光PCR产物的曲线图。图中坐标轴以外实横线以上为阳性样品，以下为阴性样品或空白对照。
[0073]图2大豆M0N89788荧光PCR产物的曲线图。图中坐标轴以外实横线以上为阳性样品，以下为阴性样品或空白对照。
【权利要求】
1.一种转基因产品中Te9基因的检测方法，其特征在于其中的引物和探针:
上游引物 Te9-F 5’ -TTTGAGAATGAACAAAAGGACCATAT-3’ ；
下游引物 Te9-R:5’ -TTACTGTGTTTTTTATTCGGTTTTCG-3’。
探针 Te9-MGBP:F AM-ATTCATTAACTCTTCTCCATCC-MGB
2.一种使用权利要求一所述的快速检测转基因产品中Te9基因的方法，其特征是依次包括下列步骤: (1)待检样品的DNA提取； (2)转基因产品中Te9基因的实时荧光PCR扩增: 在装有24 μ L的PCR扩增反应液的反应管中加入I μ L的待检样品DNA，混匀。按照下述步骤完成PCR扩增。
，95 0C 3min，l 个循环；
， 950C 30s, 600C 30s，共 40 个循环。 (3)使用扩增曲线分 析PCR 产物。
【文档编号】C12Q1/68GK103484528SQ201210202227
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年6月13日 优先权日:2012年6月13日
【发明者】王述柏, 高宏伟, 周茜, 孙敏 申请人:青岛农业大学, 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心