专利名称：荧光PCR定性检测含有NptⅡ基因转基因作物探针序列及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种荧光PCR定性检测含有NptII基因转基因作物探针序列及试剂盒背景技术据国际农业生物技术应用咨询服务中心(ISAAA)统计，2001年全世界转基因作物种植面积为5260万公顷，十多个国家已种植转基因作物，其中99％的转基因作物种植在美国、阿根廷、加拿大和中国，已批准商品化转基因作物有大豆、玉米、油菜、棉花、番茄、马铃薯、甜椒、西葫芦、木瓜、甜菜、香石竹、矮牵牛、亚麻、烟草、西瓜、菊苣等，已批准商业化种植的已近90种。据估计，用这些转基因作物生产加工的食品全世界有近万种。
对转基因产品的安全性，特别是转基因食品对人和动物的健康及对生态环境的影响，自转基因技术出现以来，就一直是世界各国及联合国等国际组织关心的焦点问题，2000年联合国通过了“生物安全议定书”，该议定书对除了药物以外的所有进出境活性转基因生物有关过境、审批、检测、风险评估和管理、赔偿责任等做出了详细的规定，其中最重要的措施之一就是对转基因产品要进行检验，以明确其种类，确定是否为已批准的或已获得许可的转基因产品，以防止一些具有风险的转基因产品任意扩散，造成不可挽回的损失。2001年欧盟要求对转基因食品进行标识管理，并提出只要不是有意污染，食品中含有不超过1％的转基因产品(阈值)则不用标识，这样转基因产品检测不但需要定性，还需要定量检测。不同国家阈值大小不一样，从1-5％不等。我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，并于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管理三个配套管理办法。目前全世界36个国家和地区出台了各种转基因产品有关的法律法规。总之，转基因产品的研究、生产、销售都要在政府有关部门的许可和监督下，在特定的环境和地点进行。
虽然联合国所属机构(FAO、WHO等)及一些地区性国际组织在召集建立世界统一的检测技术和方法标准，但由于对于转基因产品的安全性、风险管理措施及其它利益等方面的不一致，目前各国尚难达成一致的意见。综合世界各国转基因产品的检测技术，根据检测目标主要分成下面三个类型检测插入的外源基因，检测外源基因表达物(RNA或蛋白质)，检测插入外源基因对受体生物基因表达的影响(主要检测外源基因对插入位点附近基因影响及对整个代谢产物的影响)。由于第三类型的检测成本高、所需时间长，并且被认为重要性较低，目前对这方面的检测在实际工作中较少涉及。在前两种类型的检测工作中所涉及的检测目标包括三种类型DNA、RNA和蛋白质。对于蛋白质的检测主要用血清学方法，由于有些转基因产品不表达蛋白质或表达量不稳定，血清学检测方法仅在个别转基因产品检测中应用。对于DNA和RNA的检测主要采用PCR及直接核酸杂交等基因诊断技术。基因扩增诊断方法到目前为止已经历了以下几个方面的发展PCR/电泳检测、传统杂交或测序；PCR-ELISA；实时荧光PCR。
在目前所见到的转基因作物中，转入的目的基因种类繁多，功能各异。为了使转入的基因成功表达，均需要插入一定的外源性调控序列。统计表明，35S启动子，FMV启动子，nos终止子，nptII，cry3A，bar和pat这七种基因片段，用做筛查目的靶核苷酸序列时则可覆盖绝大多数的GMO品种(详见附录一商品化的转基因作物品种含有的定性筛选基因)。NptII基因的英文名称为neomycin phosphotransferase type II(简写为NptII)，NptII基因作为一种抗卡那霉素基因，是转基因过程中的一种常用筛选基因。
发明内容
本发明的目的是提供一种荧光PCR定性检测含有NptII基因转基因作物探针序列及试剂盒。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案所述的荧光PCR定性检测含有Npt II基因转基因作物探针序列包括序列CACCCAGCCGgCCACAGTCGAT向上游延伸5个碱基、向下游延伸5个碱基的区域内形成的序列。上游引物序列AGGATCTCGTCGTGACCCAT下游引物序列GCACGAGGAAGCGGTCA.
所述的试剂盒组成为核酸提取试剂核酸扩增试剂NptII PCR反应液(定性)18s-rRNA PCR反应液Taq酶(5U/ul)UNG(1U/ul)纯化水对照品NptII阳性对照品18s-rRNA阳性对照品基因组全序列见附录二本发明的具体原理是利用一对靶核苷酸序列的特异性引物、一个特异性荧光探针，采用耐热DNA聚合酶(Taq酶)、四种核苷酸单体(dNTP)等成分，并应用PCR技术实现靶核苷酸序列的核酸片段扩增。同时结合荧光探针检测技术，该探针能与引物扩增区域中间的一段模板发生特异性结合，随着PCR过程的进行，荧光信号发生相应的变化，使用在线监测的荧光PCR检测仪，即可同时实现对靶核苷酸序列的扩增及自动检测，根据收集记录的荧光信号，判定待测样本中靶核苷酸序列的存在。为排除假阴性的出现，本试剂盒系列还包括植物共有的18s-rRNA基因检测系统，用于检测样本DNA的提取和PCR反应过程。
图1荧光PCR定性检测含有NptII基因转基因作物扩增1中，1、为转基因蕃茄，2、为转基因油菜种子，3、为转基因马铃薯4、为转基因棉花。阴性样品有0.1％Fluka大豆标准品，0％大豆，番茄等具体实施方式
引物、探针设计对GMO中选用的多种NptII基因序列(包括NptII基因的天然序列以及人工改建序列)进行比较，选择其中缺乏二级结构且保守的基因区设计多对引物。引物长度一般为20个碱基左右，GC含量为50％-60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。根据上述原则设计出的引物、探针如下上游NptII730u，NptII757u，nptII850u，nptII-u下游NptII897r，nptII952r，nptII850r，npftII-r探针nptIIprobe，nptII890FdB最优引物、探针序列如下引物上游引物NptII730uAGGATCTCGTCGTGACCCAT下游引物NptII897rGCACGAGGAAGCGGTCA探针序列NptII890FdBFam-CACCCAGCCGgCCACAGTCGAt-TAMRA反应体系的建立及优化反应体系的建立和优化中所采用的靶区域模板以如下方法获得用已确证的转入该基因的转基因油菜籽为材料，以Promega Purificationkit提取基因组核酸，再分别用上述检测序列区域中的最长的扩增片段的引物进行PCR扩增。扩增产物用1×TE进行10倍梯度稀释，选取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共5个稀释度为系列阳性模板，并取其中Ct值23至27之间者作为以后反应体系优化时的模板。
引物、探针的筛选引物筛选实验中将上述上游引物和下游引物结合特异的探针，任意配对进行实验。荧光PCR仪采用PE7700荧光PCR仪。所采用的PCR反应体系如下表所示。
PCR反应体系
PCR条件的选择依据本公司以往的经验，PCR条件的选择如下94℃3min；
在同样的模板量、同样的反应条件下，以NptII序列的特异荧光探针信号所获得的Ct值和Rn值为指标(这两者能反映扩增片断的量和质)，比较不同引物对组合的扩增情况。选择Ct值和Rn值高者，做为待选的DNA/PCR检测的引物对。
从多次重复实验中选定下述最佳引物/探针组合为最佳组合上游引物NptII730u；下游引物NptII897r；探针NptII890FdB。
用选出的最佳上下游引物对进行PCR反应体系的优化。
引物和探针浓度的优化实验中将引物浓度从0.1umol/L至0.8umol/L以0.1umol/L递增，探针浓度从0.025umol/L至0.2umol/L以0.025umol/L递增。对引物和探针不同浓度的配比进行了比较。最佳引物和探针终浓度结果如下
探针名称NptII890FdB 最佳终浓度0.1μM。
镁离子浓度的优化实验中将镁离子浓度从1.0mmol/L至2.5mmol/L以0.5mmol/L递增。
从多次重复实验中选定2.5mmol/L MgCl2为试剂盒反应体系镁离子浓度。
Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的优化Taq酶用量(以单位U计)的优化实验结果，选定2U Taq酶作为试剂盒中使用Taq酶量。
dNTPs浓度的优化dNTPs浓度的优化实验中选定0.2mmol/L作为试剂盒dNTPs的终浓度。
综合以上反应体系优化实验结果，优化后的PCR反应体系见下表。
优化后的PCR反应体系
18s-rRNA基因检测
18s-rRNA基因是存在于所有植物中的一种基因，所以本试剂盒选用它作为内标基因，用于监测DNA提取及荧光PCR整个过程，18s-rRNA体系的建立同上，引物、探针序列如下上游引物序列18s-rRNA1403ucctgagaaacggctaccat下游引物序列18s-rRNA1449rcgtgtcaggattgggtaat探针序列18s-rRNA1423fbFAM-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-TAMRA对于所有植物DNA均应该扩增。按本试剂盒的方法提取DNA，其Ct值在9至25之间。
DNA提取方法的建立推荐使用传统的植物DNA提取方法CTAB法(具体见附件二)。也可根据样品特性选用方法。
核酸提取试剂亦可采用Promega公司的Wizard Magnetic DNA Purification Systemfor Food试剂盒(Cat FF3750，200tests)。
NptII试剂盒组成
试剂盒中各组分配方NptII PCR反应液取合格25mmol/L MgCl2、100mmol/L dATP、100mmol/L dUTP、100mmol/L dGTP、100mmol/L dCTP、50umol/L NptII上游引物、50umol/L NptII下游引物、50umol/L NptII探针、10×PCR缓冲液、1U/ul UNG和纯化水，按以下配方配制PCR反应液。
MgCl22.5mMdNTPs(u) 200uMTaq酶(检测时另加)(2U)NptII上游引物0.2uMNptII下游引物0.2uMNptII探针0.1uM模板(检测时另加) (5ul)水终体积(ul) 40ulCTAB法样本处理试剂配方CTAB缓冲液 20g CTAB/L，1.4M NaCl，0.1M Tris/HCl，20mMEDTA(ph＝8.0)CTAB沉淀缓冲液 5g CTAB/L，0.04M NaCl沉淀溶解液 1.2M NaCl18s-rRNA PCR反应液取合格25mmol/L MgCl2、100mmol/L dATP、100mmol/L dUTP、100mmol/L dGTP、100mmol/L dCTP、50umol/L 18s-rRNA上游引物、50umol/L 18s-rRNA下游引物、50umol/L 18s-rRNA探针、10×PCR缓冲液、1U/ul UNG和纯化水，按以下配方配制PCR反应液。
试剂成份 终浓度10×buffer 1×MgCl22.5mMdNTPs(u) 200uMTaq酶(检测时另加)(2U)18s-rRNA上游引物 0.2uM18s-rRNA下游引物 0.2uM18s-rRNA探针 0.1uM模板(检测时另加) (5ul)水终体积(ul)40ul其中，UNG是UNG酶(尿嘧啶-N-糖苷酶)Uracil-N-glycosylase纯化水的制备用自来水一次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，收取电阻率≥18.0MΩ.cm的水，贮于无菌瓶中。
阳性对照品的制备取相应的阳性样品，CTAB法样本处理试剂提取DNA，将上述制备好的DNA，用比检测反应扩增片段更长的引物扩增(用dTTP而非dUTP)，采用Promega公司的Wizard PCRPreps DNA Purification System试剂盒纯化上述PCR产物中的目的核酸片段，再用1.5％琼脂糖凝胶电泳的方法对纯化的扩增产物进行粗略定量，然后用Promega公司的PGEM-TEasy Vector SystemII试剂盒将目的片段与T载体相连接；再将连接产物转化入JM109感受态细胞，然后用X-Gal和IPTG琼脂平板筛选克隆目的菌落，PCR反应鉴定之。用LB液体培养基进行质粒的扩增。最后用Promega公司的Wizard Plus Minipreps DNAPurification System试剂盒进行质粒的提纯，仍以1.5％琼脂糖凝胶电泳的方法对提纯的质粒进行纯度检测，合格者为阳性对照品母液。用1X TE进行大量稀释。
稀释的质粒，用合格试剂盒进行检测，取Ct值在28～30者，留置大量，用做配试剂盒，也用做暂定的企业标准品。
自备设备及试剂水浴锅，离心机；氯仿、异丙醇(-20℃预冷)、70％乙醇(-20℃预冷)适用仪器PE Gene Amp7700荧光PCR检测仪或其次她合适的荧光PCR仪保存与有效期测试样本处理试剂置室温保存，其他试剂置-20℃保存，避免反复冻融。自检定合格之日起有效期为12个月。连续生产的三批试剂盒检定合格之日起在试剂盒要求的储存温度下保存，每个月按成品检定规程检测一次，一直到14个月时，各项指标均合格，因此确定试剂盒有效期为12个月。
使用方法样本核酸提取1.1 CTAB法提取DNA1.1.1 称取100mg充分粉碎后的植物样品放入2ml离心管中，加800ul CTAB缓冲液，混匀后于65℃温育30分钟；1.1.2 15500g离心10分钟，转移上层液至含400ul氯仿的管中，混匀30秒，再以15500g离心10分钟直至液相分层，吸取上层液至干净离心管中；1.1.3 加入2V CTAB沉淀缓冲液，室温下温育60分钟；1.1.4 混合液以15500g离心5分钟，弃上清；1.1.5 加入500ul沉淀溶解液溶解沉淀，并加入500ul氯仿，混匀30秒后以15500g离心10分钟；1.1.6 转移上清至另一新管中，加入0.6倍体积异丙醇，充分混匀后15500g离心10分钟，弃上清液；1.1.7 加入70％乙醇500ul于含有沉淀的小管中，小心混匀洗涤管壁后离心10分钟(15500g)，弃上清；1.1.8 室温干燥，然后将DNA溶解在100ul无菌去离子水中(如果样本DNA当天不使用，请于-20℃保存)。
1.2 Promega法提取DNA的步骤(备选)
原方法样本称取量为200mg。根据本公司的经验，此量极难混匀，故将样本称取量改为100mg，其后的试剂用量和操作步骤则完全按原方法进行。
2.试剂配制(PCR前准备区)从试剂盒中取出各管试剂，室温融化，2000rpm离心5秒。
a)设NptPCR所需要的管数为n(n＝样本数×2+1管空白对照+1管NptII阳性对照品)；b)设18s-rRNA PCR所需要的管数为m(m＝样本数×2+1管空白对照+1管18s-rRNA阳性对照品)；每个测试反应体系配制如下表
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，充分混合均匀，向设定的n个PCR反应管中分别加入NptII PCR反应液各35ul；向设定的m个PCR反应管中分别加入18s-rRNA PCR反应液反应液各35ul，一同转移至样本处理区。
2.1 加样(样本处理区)若样本DNA保存在-20℃，先置室温解冻。
在各设定的PCR反应管中，分别加入上述样本DNA溶液、纯化水(空白对照)和相应阳性对照品各5ul，盖好PCR反应管盖，转移至检测区，置于定量PCR检测仪上并记录样本摆放顺序。
2.2. PCR扩增(检测区)2.2.1 循环条件设置37℃5min；95℃3min；95℃15sec，60℃1min，40个循环。反应体系设为40ul。
(不同的荧光PCR仪循环条件可能略有调整)2.2.2 仪器检测通道选择所有PCR反应管荧光信号收集设为Fam荧光通道。
具体设置方法请参照仪器使用说明书。
3. 质控标准Npt空白对照的检测结果应为阴性；
NptII阳性对照品的Ct值≤32.0；18s-rRNA空白对照的检测结果应为阴性；18s-rRNA阳性对照品的Ct值≤30.0；上述指标有一项不符合者，应重做PCR扩增。
4. 结果判断4.1. 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，使阴性对照品成阴性结果为准。
4.2. 待测样本18s-rRNA Ct值应该≤17.0，如果不在此范围，则需重新提取样本DNA，重做PCR扩增。
4.3. 将同一样品两个平行管的Ct值取平均值，做为判断用的待测样品Ct值。
4.4. 待测样本NptII测定Ct值等于40.0者，报NptII基因序列阴性(其他荧光PCR仪对阴性的表示也可能为0.0或空白无数值)。
4.5. 待测样本NptII测定Ct值≤34.0，报NptII基因序列阳性。
4.6. 如果34.0＜待测样本NptII基因测定Ct值＜40.0，需重新做PCR扩增。
如再次扩增结果NptII基因测定Ct值仍＜40.0，报NptII基因序列阳性。
如再次扩增结果NptII基因测定Ct值等于40.0，则报NptII基因序列阴性。
试剂盒使用注意事项有关实验室管理规范请严格按照行业行政主管部门颁布的有关基因扩增检验实验室的管理规范执行。
实施例1选取转基因及非转基因的农产品如大豆、玉米、油菜、番茄、土豆，以Promega磁珠法提取基因组DNA，具体为称重100mg植物材料，置于2ml离心管中；加入500ul LysisBuffer A和5ul RNase A，与材料混匀；加入250ul Lysis Buffer B，混匀，室温放置10分钟；加入750ul沉淀缓冲液，混匀后高速离心(13000×g)10分钟；吸取上清于干净的2ml离心管中，加入50ul磁粉液，混匀；混合液中加入0.8体积异丙醇，混匀，室温放置5分钟；将离心管置于磁架上1分钟，去澄清液；取出离心管，再加入250ul Lysis Buffer B，混匀后置于磁架上1分钟，去澄清液；用1ml 70％乙醇清洗磁粉，置于磁架上1分钟，去澄清液；步骤重复2次；取出离心管，于65℃干浴锅中干燥5分钟或室温下干燥15-30分钟；离心管中加入100ul去离子水，混匀后于65℃干浴锅中孵育5分钟，再移至磁架上1分钟，吸取澄清液于0.5ml干净离心管中，做为DNA模板备用。
用该试剂盒做荧光PCR检测，具体为40ul反应体系中，加入植物基因组DNA 5ul，进行荧光PCR检测，具体反应条件同前。经检测，上述转入NptII基因的转基因作物均呈阳性扩增，其检测灵敏度均可达到0.1％；而非转基因的农产品如普通玉米、白玉米等均无扩增信号，提示该引物对具有良好的灵敏度和特异性(具体见图一)。
试剂盒灵敏度为0.1％GMO，将0.1％的标准品做5倍稀释后，仍可检测到目标片段。
试剂盒精密性测试公司中3位技术熟练的操作人员在3个不同时间，各做3次精密性检测实验(总计9次)，每次平行处理10份精密性参比品。对每10次所得的Ct值用Microsoft Excel分析软件进行统计学处理，得出平均值和10个Ct值的CV值，实验结果显示，Ct值的CV值在5.0％以下，表明该试剂盒有良好的精密性。
试剂盒特异性测试该试剂盒对阴性大豆、玉米、油菜、马铃薯标本均无非特异性扩增，表明该试剂盒具有良好的特异性。
对于所有植物DNA均应该扩增。按本试剂盒的方法提取DNA，其Ct值在9至25之间。
发明效果经过反复筛选，得到最佳组合为上游引物NptII730u；下游引物Npt897r；探针NptII890FdB。
以0.1％转基因油菜籽提取的DNA做模板，得到的Ct值在29.0-33.0之间，这是目前不同荧光测定仪器的可靠检测下限；而0.1％的检测灵敏度已经达到了目前国际同类产品的检测标准。
该试剂盒中的引物探针还可以用作杂交探针检测含有NptII基因的转基因作物。
PCR-ELISA的方法学原理简介该实验要设计一对PCR引物和一条探针，它们均与模板DNA链互补，且探针的结合部位在引物结合部位之间。将PCR的一条引物5’端标记上荧光素(Fluorescein)，进行PCR扩增，得到的扩增产物带有荧光素标记。同时将探针的5’端标记上生物素(Biotin)，酶联板上包被有亲和素(Avidin)，通过生物素与亲和素的亲和作用，将探针包被在酶联板上。检测时，将扩增产物变性成单链，在酶联板上与探针进行特异的结合，洗板，再加入辣根过氧化物酶偶联的荧光素抗体，通过显色剂显色，在酶标板上读取OD值，根据OD值判断样品的阴阳性。
实施例将上述探针NptII890FdB的5’端标记生物素，3’端不做标记；将引物NptII730u的5’端标记上荧光素。预先将探针包被在有亲和素的酶联板上。
按常规方法(CTAB法或磁珠法)提取样本中的DNA。由10×PCR缓冲液、dNTPs、Mg2+、Taq酶、上下游引物、H2O，以及DNA模板组成PCR反应体系，进行扩增。
扩增结束后，将扩增产物变性成单链，加到包被了探针的酶联板上，如果有特异性扩增，扩增产物中的一条链与探针杂交，洗板，加入酶联荧光素抗体，洗板，加入显色剂，显色10分钟，停止显色，在酶标仪上读取OD值，根据OD值判断样本的阴阳性。下表是一次的实验结果
实验结果表明只要含有NptII基因序列的转基因作物经该系统检测结果均为阳性，而不含有NptII基因序列的作物经该系统检测均为阴性。
本发明的优点1.本试剂盒对于转入NptII基因的转基因作物检测灵敏度可达0.1％，说明本试剂盒具有良好的灵敏度。
2.本试剂盒对于非转基因的农产品如大豆、玉米等均无扩增信号，说明本试剂盒具有良好的特异性。
3.由于本试剂盒采用了荧光PCR作为检测方法，整个反应均闭管进行，避免了其他核酸检测方法如PCR-电泳等易于形成气溶胶污染而造成假阳性。
4.由于本试剂盒采用了植物内源基因18S-rRNA作为内标，避免了假阴性的产生。
5.由于本方法对PCR产物实行了实时监测，大大节省了检测时间，节约了人力物力。
备注英文字母表示的引物探针的名称、引物探针的序列、基因的名称等大小写通用；“Ct值”的英文全称为“Threshold Cycles”，意指荧光值超过阈值时所处的循环数。在不同荧光PCR仪上有不同的名称，但含义是一样的。
附录一
附录二GTTTCGCATG ATTGAACAAG ATGGATTGCA CGCAGGTTCT CCGGCCGCTT GGGTGGAGAG GCTATTCGGCTATGACTGGG CACAACAGAC AATCGGCTGC TCTGATGCCG CCGTGTTCCG GCTGTCAGCG CAGGGGCGCCCGGTTCTTTT TGTCAAGACC GACCTGTCCG GTGCCCTGAA TGAACTGCAG GACGAGGCAG CGCGGCTATCGTGGCTGGCC ACGACGGGCG TTCCTTGCGC AGCTGTGCTC GACGTTGTCA CTGAAGCGGG AAGGGACTGGCTGCTATTGG GCGAAGTGCC GGGGCAGGAT CTCCTGTCAT CTCACCTTGC TCCTGCCGAG AAAGTATCCATCATGGCTGA TGCAATGCGG CGGCTGCATA CGCTTGATCC GGCTACCTGC CCATTCGACC ACCAAGCGAAACATCGCATC GAGCGAGCAC GTACTCGGAT GGAAGCCGGT CTTGTCGATC AGGATGATCT GGACGAAGAGCATCAGGGGC TCGCGCCAGC CGAACTGTTC GCCAGGCTCA AGGCGCGCAT GCCCGACGGC GAGGATCTCGNptII730uTCGTGACCCA TGGCGATGCC TGCTTGCCGA ATATCATGGT GGAAAATGGC CGCTTTTCTG GATTCATCGA TGG CGGACCGCTA TCAGGACATA GCGTTGGCTA CCCGTGATAT TGCTGAAGAGNptII890FdBCTTGGCGGCG AATGGGCTGA CCGCTTCCTC GTGCTTTACG GTATCGCCGC TCCCGATTCG CAGCGCATCGNptII897CCTTCTATCG CCTTCTTGAC GAGTTCTTCT GAGCGGGACT
序列表<110>国家出入境检验检疫局动植物检疫实验所深圳市匹基生物工程股份有限公司<120>荧光PCR定性检测含有NptII基因转基因作物探针序列及试剂盒<130><160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>1cacccagccg gccacagtcg at 22<210>2<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>2aggatctcgt cgtgacccat 20<210>3<211>17<212>DNA<213>人工合成<400>3gcacgaggaa gcggtca17<210>4<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>4tgcgcgcctg ctgccttcct 20<210>5<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>5cctgagaaac ggctaccat 19<210>6<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>6cgtgtcagga ttgggtaat 19
权利要求
1.一种荧光PCR定性检测含有NptII基因转基因作物探针序列，其特征在于所述的探针序列包括序列CACCCAGCCGgCCACAGTCGAT向上游延伸5个碱基、向下游延伸5个碱基的区域内形成的序列。
2.根据权利要求1所述的一种荧光PCR定性检测含有NptII基因转基因作物探针序列，其特征在于所述的探针序列为CACCCAGCCGgCCACAGTCGAT。
3.一种根据权利要求2所述的一种荧光PCR定性检测含有NptII基因转基因作物探针序列做成的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒的组成为核酸提取试剂核酸扩增试剂NptII PCR反应液(定性)18s-rRNA PCR反应液Taq酶(5U/ul)UNG(1U/ul)纯化水对照品NptII阳性对照品18s-rRNA阳性对照品其中，NptII PCR反应液的上游引物序列为AGGATCTCGTCGTGACCCAT下游引物序列GCACGAGGAAGCGGTCA其中18s-rRNA上游引物序列cctgagaaacggctaccat，下游引物序列cgtgtcaggattgggtaat，探针序列TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT。
4.一种根据权利要求3所述的一种荧光PCR定性检测含有NptII基因转基因作物探针序列做成的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒的组成为组成成份(48tests/盒) 体积CTAB法核酸提取试剂CTAB缓冲液 40ml×1管CTAB沉淀缓冲液 40ml×1管沉淀溶解液 24ml×1管核酸扩增试剂NptIIPCR反应液(定性) 1ml×2管18s-rRNA PCR反应液 1ml×2管Taq酶(5U/ul) 40ul×1管UNG(1U/ul) 10ul×1管纯化水 100ul×1管对照品NptII阳性对照品 30ul×1管18s-rRNA阳性对照品 30ul×1管试剂盒中各组分配方NptII PCR反应液为10×buffer 1×MgCl22.5mMdNTPs(u) 200uMTaq酶(检测时另加)(2U)NptII上游引物0.2uMNptII下游引物0.2uMNptII探针0.1uM模板(检测时另加) (5ul)水终体积(ul) 40ul18s-rRNA PCR反应液试剂成份 终浓度10×buffer 1×MgCl22.5mMdNTPs(u) 200uMTaq酶(检测时另加)(2U)18s-rRNA上游引物 0.2uM18s-rRNA下游引物 0.2uM18s-rRNA探针 0.1uM模板(检测时另加) (5ul)水终体积(ul) 40ulCTAB法样本处理试剂配方为CTAB缓冲液 20g CTAB/L，1.4M NaCl，0.1M Tris/HCl，20mM EDTA(ph＝8.0)CTAB沉淀缓冲液 5g CTAB/L，0.04M NaCl沉淀溶解液 1.2M NaCl
5.一种根据权利要求2所述的一种荧光PCR定性检测含有NptII基因转基因作物探针序列其特征在于所述的探针用作杂交探针检测含有NptII基因转基因作物。
全文摘要
一种荧光PCR定性检测含有Npt II基因转基因作物探针序列及试剂盒，所述的探针序列包括序列CACCCAGCCGgCCACAGTCGAT向上游延伸5个碱基、向下游延伸5个碱基的区域内形成的序列。所述的试剂盒组成为核酸提取试剂；核酸扩增试剂，所述的核酸扩增试剂包括Npt II PCR反应液、18s－rRNAPCR反应液、Taq酶(5U/ul)、UNG(1U/ul)；对照品等。本试剂盒对于含有NptII基因转基因作物检测灵敏度可达0.1％，本试剂盒还具有良好的特异性。由于本试剂盒采用了植物内源基因18S－rRNA作为内标，避免了假阴性的产生，由于本方法对PCR产物实行了实时监测，大大节省了检测时间，节约了人力物力。
文档编号C12Q1/68GK1485438SQ0213129
公开日2004年3月31日 申请日期2002年9月24日 优先权日2002年9月24日
发明者朱文斯, 朱水芳, 黄茜华 申请人:深圳市匹基生物工程股份有限公司, 国家出入境检验检疫局动植物检疫实验所