专利名称：一种转基因棉花检测通用质粒标准分子及其构建方法
技术领域：
本发明属于转基因植物检测技术领域，具体涉及一种转基因棉花检测通用质粒标准分子及其构建方法。
背景技术：
随着转基因技术的飞速发展，越来越多的转基因产品问世并大规模商业化应用。世界各国都在完善对转基因产品的安全监管。核酸检测是对转基因产品进行安全监管的有效方法之一，在核酸检测过程中，为防止假阳性的出现，必须要有标准阳性物质作为参考。目前常用的来源于纯合转基因植物的标准阳性物质在制备、贮藏和测定等方面都受很多因子影响，而且并非所有的作物转基因品系都存在这类标准阳性物质， 从而影响到对转基因产品的分子检测。因此，标准阳性物质的缺乏已成为限制转基因产品检测的主要因子之一，急需研制标准阳性物质的替代品。Taverniers等于2001年提出“单靶标质粒分子”概念，即将不同目标DNA片段分别克隆到载体上用作标准分子 (Taverniers I, Windels P, Bocktaele E V, et al. Use of cloned DNA fragments for event specific quantification of genetically modified organisms in pure and mixed food products. Eur Food Res Tethnol，2001，213 (6) :417-424)。2002 年，日本科学家Kuribara提出了质粒标准分子的概念(Kuribara H, Shindo Y, Matsuoka T, et al. Novel reference molecules for quantitation of genetically modified maize and soybean. J AOAC Int, 2002,85 (5) :1077-1089)，质粒标准分子可以通过将需检测的基因片段克隆到克隆载体上而获得，操作很简单。另外，质粒标准分子还具有纯度高、稳定性好、 易于保存等优点。经验证质粒标准分子在GMO鉴定检测中是很好的标准阳性物质替代物， 如Corbisier等构建的检测M0N810的质粒标准分子经欧盟联合研究中心标准物质方法研究所测试，最终注册并命名为有证标准物质ERM-AD413 (Corbisier P，Broeders S，Charels D, et al.Certification of plasmidic DNA containing M0N8IOmaize DNA fragments, ERM-AD413. EC certification report,2007, EUR 22948，ISBN 978-92-79-07139-3)。 因此，构建阳性标准分子已经成为国际上转基因检测领域的研究热点。目前，国外已获得多种转基因产品检测用质粒标准分子(Debode F，Marien A，Janssen E. Design of multiplex calibrant plasmids,their use in GMO detection and the limit of their applicability for quantitative purposes owing to competition effects.Anal Bioana Chem，2010，396 :2151-2164)。我国也开展了许多阳性标准分子质粒构建方面的研究，成功构建了多种阳性标准分子。如上海交通大学建立的多种阳性标准分子(Yang L Τ, Guo J C,Pan A H,et al. Event specific quantitative detection of nine genetically modified maizes using one novel standard reference molecule.J Agri Food Chem, 2007,55(1) :15- ),东北农业大学构建的转基因水稻、玉米和大豆通用质粒标准分子(敖金霞，高学军，曲波，等.转基因大豆、玉米和水稻外源基因检测通用标准分子的构建[J]. 中国农业大学学报，2008，13(6) :19- )、吉林农科院构建的检测M0N89788的质粒标准分
3子(李飞武，邵改革，邢珍娟，等.转基因大豆M0N89788检测质粒标准分子的构建与应用。 安徽农业科学，2010，38 (23) :12330-12333)，中国农业科学院油料作物研究所构建的转基因作物筛查用阳性标准分子等(胡尚杰，吴刚，武玉花，等。转基因作物筛查用阳性质粒分子的构建及应用研究。中国油料作物学报，2010,32 ) :173-179)。转基因抗虫棉已大规模商业化应用，目前市场上种植的抗虫棉主要有孟山都公司的转Bt基因的抗虫棉，以及中国农业科学院生物技术研究所研发的转Bt或CPTI的抗虫棉。上海交通大学构建的转基因棉花质粒分子主要是针对Bt设计的，尚未有检测转基因棉花的通用质粒标准分子。
发明内容
本发明的目的在于提供一种转基因棉花检测通用质粒标准分子，满足转基因棉花检测需求。本发明的目的还在于提供一种转基因棉花检测通用质粒标准分子的构建方法。一种转基因棉花检测通用质粒标准分子，所述质粒标准分子含有棉花内标准基因 sadl，抗虫基因CrylAb/CrylAc融合基因，抗虫基因CPTI，抗除草剂基因CP4，标记基因Kan， 调控序列35S启动子和Nos终止子序列。一种转基因棉花检测通用质粒标准分子的构建方法，按照如下步骤进行(1)通过GenBank数据库和文献查询，获得棉花内标准基因SadI，抗虫基因 CrylAb/CrylAc融合基因，抗虫基因CPTI，抗除草剂基因CP4，标记基因Kan，调控序列35S 启动子和Nos终止子的核苷酸序列；(2)根据获得的目的基因的核苷酸序列，设计引物，PCR获得目的基因片段；其中， SEQ ID NOl和SEQ ID N02组成的引物对扩增抗虫棉获得棉花内标准基因sadl，SEQ ID N03 和SEQ ID N04组成的引物对扩增抗虫棉获得抗虫基因CrylAb/CrylAc融合基因，SEQ ID N05和SEQ ID N06组成的引物对扩增抗虫棉获得抗虫基因CPTI，SEQ ID N07和SEQ ID N08 组成的引物对扩增抗除草剂棉花获得抗除草剂基因CP4，SEQ ID N09和SEQ ID NOlO组成的引物对扩增抗虫棉获得Nos终止子序列；(3)将步骤⑵获得的棉花内标准基因MdI PCR产物与T-载体连接形成中间载体 pGhsadl ；(4)采用Overlapping PCR技术，以步骤⑵获得的抗虫基因CrylAb/CrylAc融合基因和抗虫基因CPTI的PCR产物为模板进行PCR扩增，获得CrylAb/CrylAc-CPTI融合基因片段，并与T-载体连接形成中间载体pCPTI-Bt ；(5)采用Overlapping PCR技术，以步骤⑵获得的抗除草剂基因CP4和Nos终止子部分序列的PCR产物为模板进行PCR扩增，获得CP4-NOS融合基因片段，并与T-载体连接形成中间载体pCP4-Nos ；(6)采用EcoRl和Kpnl双酶切载体pCAMbia2300和中间载体pCPTI_Bt，分别回收 8742bp和1222bp的DNA条带，经连接酶连接后形成中间载体p2CB ；(7)采用HindIII和sail双酶切中间载体pGhsadl和p2CB分别回收824bp和 9964bp的DNA条带，经连接酶连接后形成中间载体p2CBS ；(8)采用BamHI和SalI双酶切中间载体pCP4_Nos和p2CBS，分别回收1584bp和 10808bp的DNA条带，经连接酶连接后形成质粒标准分子pMCS。
所述载体pCAMbia2300包含标记基因Kan和调控序列35S启动子。所述抗虫棉为转基因棉花GK312。转基因棉花检测通用质粒标准分子在检测转基因棉花中的应用，采用所述质粒标准分子为模板，做定性PCR检测，扩增出与棉花内标准基因sadl，抗虫基因CrylAb/CrylAc 融合基因，抗虫基因CPTI，抗除草剂基因CP4，标记基因Kan，调控序列35S启动子和Nos终止子序列。本发明的有益效果本发明构建的质粒标准分子纯度高、稳定性好、易于保存，能够有效扩增出棉花内标准基因sadl，抗虫基因CrylAb/CrylAc融合基因，抗虫基因CPTI，抗除草剂基因CP4，标记基因Kan，调控序列35S启动子和Nos终止子的部分序列，能够作为各种转基因棉花检测的标准阳性对照。
图1为质粒标准分子的元件组成示意图；图中，kan代表标记基因Kan，35S代表调控序列35S启动子，CPTl代表抗虫基因 CPTI，Bt代表抗虫基因CrylAb/CrylAc融合基因，CP4代表抗除草剂基因CP4，NosT代表Nos 终止子的部分序列，sadl代表棉花内标准基因sadl，pVSlsta代表pVSl质粒的sta区域， pVSlrep代表pVSl的复制区域，pBR322bom代表pBR322载体的bom位点，pBR322ori代表 PBR322载体的复制起始位点，addA代表细菌内表达的卡那基因。图2为目的片段的克隆电泳图；图中，M-Marker、l-sadl基因片段、2-cptI基因片段、3_Bt基因片段、4-cptI和Bt 融合基因片段、5-Nos终止子片段、6-cp4基因片段、7-cp4基因和nos终止子融合基因片段。图3为质粒标准分子酶切鉴定电泳图；图中，M-MarkerU-BamHI 和 Mil 双酶切、2EcoRI 和 HindIII 双酶切、3_HindIII 和 SalI 双酶切、4-XhoI 酶切、5_HindIII 酶切。图4为质粒标准分子的PCR验证电泳图；图中，I-IOObp Marker、2-以pMCS为模板扩增CP4、3_以标准物质扩增CP4、4_以 PMCS为模板扩增nptll、5-以标准物质扩增nptll、6-以pMCS为模板扩增&idl、7-以标准物质扩增sadl、8-以pMCS为模板扩增35s、9_以标准物质扩增35s、10_以pMCS为模板扩增Bt、11-以标准物质扩增Bt、12-以pMCS为模板扩增nos、13-以标准物质扩增nos、14-以标准pMCS为模板扩增cptl、15-以标准物质扩增cptl。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分(J.萨姆布鲁克D. W.拉塞尔著，科学出版社)或参阅所用试剂盒的说明书。以下实施例中使用的植物材料为转基因棉花GK312，抗除草剂转基因棉花，非转基因棉花。以下实施例中使用的限制性内切酶购自百灵克生物技术有限公司，克隆载体 pMD-18T、T4DNA连接酶、Taq酶、DNA分子量标准购自宝生物工程有限公司；pCAMbia2300购
5自CAMbia公司(http://www.cambia.org) ；PCR产物回收试剂盒、质粒提取试剂盒、TOPO 10 感受态细胞购自全式金生物工程有限公司；其他常规生化试剂购自拜耳迪生物工程有限公司；引物和测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。实施例1引物设计通过GenBank和文献查询获得棉花内标准基因&idl、抗虫基因CrylAb/CrylAc融合基因，抗虫基因CPT1，抗除草剂基因CP4和Nos终止子的基因序列，设计5对引物(序列如表1所示)，分别用于扩增MdI、抗虫基因CrylAb/CrylAc融合基因，抗虫基因CPTl，抗除草剂基因CP4和Nos终止子。棉花内标准基因sadl的特异序列扩增引物由SEQ ID NOl和SEQ ID N02组成；抗虫基因CrylAb/CrylAc的特异序列扩增引物由SEQ ID N03和SEQ ID N04组成；抗虫基因CPTl的特异序列扩增引物由SEQ ID N05和SEQ ID N06组成；抗除草剂基因CP4的特异序列扩增引物由SEQ ID N07和SEQ ID N08组成；Nos终止子的特异序列扩增引物由SEQ ID N09和SEQ ID NOlO组成。表 1
引物名称序列(5’ ---3’ )SEQ ID NOlgtcgacaatgccatcgcctcgaaatctSEQ ID N02aagcttgctagcacctgtctcatcacgagttSEQ ID N03acgaagacgacgaataatgaatccaactggagaggccatgatSEQ ID N04ggtaccaactgcttgagtaacccagaagttgtSEQ ID N05gaattcatgcgtatggacctgaaacacctSEQ ID N06ttattcgtcg tcttcgtcacgagatSEQ ID N07ggatccatggctcacggtgcaagcagccgtccagcaaSEQ ID N08agcagccttagtgtcggagagttcgatct
SEQ ID N09cactaaggctgcttgagatcgttcaaacatttggcaataSEQ ID NOlOgtcgacttatcctagtttgcgcgct实施例2特异性序列扩增和中间载体的构建1、CPTl-Bt融合基因片段的扩增(1)以SEQ ID N05和SEQ ID N06为引物，以转基因棉花GK312基因组DNA为模板进行 PCR 扩增，反应条件为94°C 5m, 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s，30 个循环；72°C 5m。扩增产物如图2所示，为270bp。(2)以SEQ ID N03和SEQ ID N04为引物，以转基因棉花SK312基因组DNA为模板进行 PCR 扩增，反应条件为94°C 5m, 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 45s，30 个循环；72°C 5m。扩增产物如图2所示，为952bp。(3)以SEQ ID N05和SEQ ID N04为引物，以步骤(1)和(2)的PCR产物为模板进行 PCR 扩增，反应条件为94°C 5m, 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 60s, 30 个循环；72°C 5m。扩增产物如图2所示，为1222bp。将步骤(3)的PCR产物回收后与T-载体连接，并进行测序，阳性克隆命名为 pCPTl-Bt。2、CP4-Nos融合基因片段的扩增(1)以SEQ ID N07和SEQ ID N08为引物，以抗除草剂转基因棉花DNA为模板进行 PCR 扩增，反应条件为94°C 5m, 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 60s，30 个循环；72°C 5m。扩增产物如图2所示，为1389bp。(2)以SEQ ID N09和SEQ ID NOlO为引物，以pBI121为模板进行PCR扩增，反应条件为94°C 5m, 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s, 30 个循环；72°C 5m。扩增产物如图 2 所示， 为 195bp0(3)以SEQ ID N07和SEQ ID NOlO为引物，以步骤(1)和(2)的PCR产物为模板进行 PCR 扩增，反应条件为94°C 5m, 94°C 30s, 58°C 30s，72°C 60s，30 个循环；72°C 5m。扩增产物如图2所示，为1584bp。将步骤(3)的PCR产物回收后与T-载体连接，并进行测序，阳性克隆命名为 pCP4-Nos。3、棉花内标基因Mdl基因片段的克隆以SEQ ID NOl和SEQ ID N02为引物，以SK312基因组DNA为模板进行PCR扩增， 反应条件为94°C 5m, 94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s, 30 个循环；72°C 10m。扩增产物如图 2 所示，为824bp。将PCR产物回收后与T-载体连接，并进行测序，阳性克隆命名为piihsadl。实施例3质粒标准分子的构建(I)EcoRl 和 Kpnl 双酶切 pCAMbia2300 和 pCPTl-Bt，分别回收 8742bp 和 1222bp 的DNA条带，经连接酶连接后形成中间载体p2CB。(2)HindIII 和 sail 分别双酶切 pGhsadl 和 p2CB,分别回收 824bp 和 9964bp 的 DNA条带，经连接酶连接后形成中间载体P2CBS。(3)BamHI 和 SalI 分别双酶切 pCP4_Nos 和 p2CBS，分别回收 1584bp 和 10808bp 的 DNA条带，经连接酶连接后得到质粒标准分子pMCS。构建的质粒标准分子pMCS的简要图谱如图1所示。图中P2300表示用于构建质粒标准分子的载体，SadI表示棉花内标准基因&idl的特异序列，CPTI表示抗虫基因豇豆胰蛋白酶基因，Bt表示抗虫基因CrylAb/CrylAc融合基因片段，CP4表示抗除草剂基因，Nos 表示Nos终止子，35S表示35S启动子，Kan表示标记基因卡那基因。构建的质粒标准分子pMCS 用 BamHI+Sall，EcoRI+Hindlll, Hindlll+Sall，双酶切， ιοΙ，HindIII单酶切鉴定，结果如图3所示，均与预测的条带大小一致。
7
实施例4转基因棉花的定性检测为了验证构建的质粒标准分子是否能应用于转基因棉花的定性检测，发明人以常用的转基因棉花定性检测用引物(如表2所示)，以质粒标准分子、转基因抗除草剂棉花的标准物质(转基因成分为1%)为模板进行PCR扩增，反应条件为94°C 5m，94°C 30s， 58°C 30s, 72°C 60s, 30 个循环；72°C 5m ；本实施例所用的的转基因棉花定性检测用引物序列如下序列SEQ ID NOll和SEQ ID N012组成的引物对，扩增CP4基因片段；序列SEQ ID N013和SEQ ID N014组成的引物对，扩增npt基因片段；序列SEQ ID N015和SEQ ID N016组成的引物对，扩增Sadl基因片段；序列SEQ ID N017和SEQ ID N018组成的引物对，扩增35S启动子片段；序列SEQ ID N019和SEQ ID N020组成的引物对，扩增CrylAb/CrylAc融合基因片段；序歹Ij SEQ ID N021和SEQ ID N022组成的引物对，扩增Nos终止子片段；序歹Ij SEQ ID N023和SEQ ID N024组成的引物对，扩增CPTl基因片段；扩增结果显示(图4)，序列SEQ ID NOll和SEQ ID N012组成的引物对，在扩增模板为质粒标准分子和转基因抗除草剂棉花的标准物质时，获得498bp的一致的扩增条带，且扩增模板为质粒标准分子时条带亮度大；序列SEQ ID N013和SEQ ID N014组成的引物对，在扩增模板为质粒标准分子和转基因抗除草剂棉花的标准物质时，获得ISObp的一致的扩增条带，且扩增模板为质粒标准分子时条带亮度大；序列SEQ ID N015和SEQ ID N016组成的引物对，在扩增模板为质粒标准分子和转基因抗除草剂棉花的标准物质时，获得107bp的一致的扩增条带；序列SEQ ID N017和SEQ ID N018组成的引物对，在扩增模板为质粒标准分子和转基因抗除草剂棉花的标准物质时，获得l%bp的一致的扩增条带；序列SEQ ID N019和SEQ ID N020组成的引物对，在扩增模板为质粒标准分子和转基因抗除草剂棉花的标准物质时，获得340bp的一致的扩增条带，且扩增模板为质粒标准分子时条带亮度大；序列SEQ ID N021和SEQ ID N022组成的引物对，在扩增模板为质粒标准分子和转基因抗除草剂棉花的标准物质时，获得180bp的一致的扩增条带，且扩增模板为质粒标准分子时条带亮度大；序列SEQ ID N023和SEQ ID NOM组成的引物对，在扩增模板为质粒标准分子和转基因抗除草剂棉花的标准物质时，获得270bp的一致的扩增条带。表2 质粒标准分子定性和定量检测引物
权利要求
1.一种转基因棉花检测通用质粒标准分子，其特征在于，所述质粒标准分子含有棉花内标准基因SadI，抗虫基因CrylAb/CrylAc融合基因，抗虫基因CPTI，抗除草剂基因CP4，标记基因Kan，调控序列35S启动子和Nos终止子序列。
2.一种如权利要求1所述转基因棉花检测通用质粒标准分子的构建方法，其特征在于，按照如下步骤进行(1)通过GenBank数据库和文献查询，获得棉花内标准基因&idl，抗虫基因CryIAb/ CryIAc融合基因，抗虫基因CPTI，抗除草剂基因CP4，标记基因Kan，调控序列35S启动子和 Nos终止子的核苷酸序列；(2)根据获得的目的基因的核苷酸序列，设计引物，PCR获得目的基因片段；其中，SEQ ID NOl和SEQ ID N02组成的引物对扩增抗虫棉获得棉花内标准基因sadl，SEQ ID N03和 SEQ ID N04组成的引物对扩增抗虫棉获得抗虫基因CrylAb/CrylAc融合基因，SEQ ID N05 和SEQ ID N06组成的引物对扩增抗虫棉获得抗虫基因CPTI，SEQ ID N07和SEQ ID N08组成的引物对扩增抗除草剂棉花获得抗除草剂基因CP4，SEQ ID N09和SEQ ID NOlO组成的引物对扩增抗虫棉获得Nos终止子序列；(3)将步骤( 获得的棉花内标准基因MdIPCR产物与T-载体连接形成中间载体 pGhsadl ；(4)采用OverlappingPCR技术，以步骤( 获得的抗虫基因CrylAb/CrylAc融合基因和抗虫基因CPTI的PCR产物为模板进行PCR扩增，获得CrylAb/CrylAc-CPTI融合基因片段，并与T-载体连接形成中间载体pCPTI-Bt ；(5)采用OverlappingPCR技术，以步骤( 获得的抗除草剂基因CP4和Nos终止子部分序列的PCR产物为模板进行PCR扩增，获得CP4-N0S融合基因片段，并与T-载体连接形成中间载体pCP4-Nos ；(6)采用EcoRl和Kpnl双酶切载体pCAMbia2300和中间载体pCPTI_Bt，分别回收 8742bp和1222bp的DNA条带，经连接酶连接后形成中间载体p2CB ；(7)采用HindIII和sail双酶切中间载体pGhsadl和p2CB分别回收824bp和9964bp 的DNA条带，经连接酶连接后形成中间载体p2CBS ；(8)采用BamHI和SalI双酶切中间载体pCP4_Nos和p2CBS,分别回收1584bp和 10808bp的DNA条带，经连接酶连接后形成质粒标准分子pMCS。
3.根据权利要求2所述转基因棉花检测通用质粒标准分子的构建方法，其特征在于， 所述载体pCAMbia2300包含标记基因Kan和调控序列35S启动子。
4.根据权利要求2所述转基因棉花检测通用质粒标准分子的构建方法，其特征在于， 所述抗虫棉为转基因棉花GK312。
5.权利要求1所述转基因棉花检测通用质粒标准分子在检测转基因棉花中的应用， 其特征在于，采用所述质粒标准分子为模板，做定性PCR检测，扩增出与棉花内标准基因 sadl，抗虫基因CrylAb/CrylAc融合基因，抗虫基因CPTI，抗除草剂基因CP4，标记基因Kan， 调控序列35S启动子和Nos终止子序列。
全文摘要
本发明公开了属于转基因植物检测技术领域的一种转基因棉花检测通用质粒标准分子及其构建方法。该质粒标准分子含有棉花内标准基因sadI，抗虫基因CryIAb/CryIAc融合基因，抗虫基因CPTI，抗除草剂基因CP4，标记基因Kan，调控序列35S启动子和Nos终止子的部分序列。该质粒标准分子稳定性好、易于保存，能够作为各种转基因棉花检测的标准阳性对照。
文档编号C12N15/63GK102433377SQ20111032437
公开日2012年5月2日 申请日期2011年10月22日 优先权日2011年10月22日
发明者唐巧玲, 王志兴, 王旭静 申请人:中国农业科学院生物技术研究所