专利名称：一种用于牛源性无乳链球菌或停乳链球菌生长的培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌的培养基，确切讲是一种用于牛源性无乳链球菌或停乳链球菌生长的培养基。这种培养基主要用于牛源性无乳链球菌或停乳链球菌的规模化培养，该培养基用于奶牛乳房炎疫苗生产领域。
背景技术：
奶牛乳房炎长期一来一直是影响奶牛业发展的三大疾病中最主要的一种常见多发病，给奶牛业造成巨大的经济损失。据Jones等(1984)报道，奶牛乳房炎造成的损失大约70%是由隐性乳房炎导致的奶产量下降而引起的。目前，全世界约有2. 2亿头奶牛，其中约有1/3的奶牛患有各种类型乳房炎，每年因乳房炎造成的损失高达350亿美元，仅美国的损失就达20亿美元(Charls等，1997)。近年来，随着人民生活水平的提高和饮食习惯的改变，奶类消费需求呈较快增长趋势。然而，由于目前在治疗奶牛乳房炎方面大量滥用抗生素和化药，造成乳中药物残留日益严重，给乳房炎的预防与治疗提出了新的难题。因此，研制有效的药物和疫苗显得越来越重要。奶牛乳房炎是一种由多种病原微生物感染引起的乳腺疾病，据报道有150多种微生物，参见《奶牛疾病学》[M]. William C. Rebhun.赵德明， 沈建忠，译.北京中国农业大学出版社，1999.，但从国内外学者大量研究结果可以看出， 较常见的约有20多种，其中临床上以葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌感染引起的乳房炎较为常见，约占总致病菌的90% -95%以上，参见“奶牛乳房炎病原菌区系分布及发病规律研究进展” [J].《动物医学进展》李宏胜等.，2005，26(6) :146-149。因此，国内外学者对奶牛乳房炎常见病原菌的研究主要还是针对链球菌、葡萄球菌和大肠杆菌。近年来国内外学者对奶牛乳房炎疫苗的研究焦点主要集中在灭活苗和亚单位苗等方面。目前国内外已有应用灭活的金葡菌和链球菌制成的佐剂灭活苗临床应用的报道，表明有一定的免疫效果，参见 Riekerink R. G. M. 0. , Barkema H. W. , Veenstra S. , etal. Prevalence of contagious mastitis pathogen sinbulk tank milk in Prince Edward Island. Can. Vet. J. ,2006, 47(6) :567-572. ；Watson DL, McColl ML, Davies HI. Field trial of a staphylococcal mastitis vaccine in dairy herds :clinical, subclinical and microbiological assessments. Aust Vet J. 1996，74 (6) :447_450 ；李宏胜等，奶牛乳房炎多联苗的研制及临床应用效果观察，中国兽医科学，2007，37 (4) :277-283。但由于葡萄球菌和链球菌免疫原性较弱，抗原性复杂等原因，因此，疫苗普遍存在免疫效果不够理想，免疫持续期较短等缺陷， 急需进行改进提高。然而，要提高乳房炎疫苗的免疫效果，必须提高单位体积中的细菌抗原量，增强细菌的毒力和免疫原性以达到有效刺激机体产生抗体的目的。而提高细菌抗原含量的唯一办法就是提高细菌培养量，因此，筛选最佳的牛源性无乳链球菌和停乳链球菌培养基，大幅度的提高培养基中单位体积的细菌数量是解决这一难题的唯一办法。目前，对于奶牛乳房炎链球菌的培养常用的培养基主要是普通营养肉汤和THB培养基。普通营养肉汤培养基的组成为牛肉浸出粉5g、蛋白胨10g、氯化钠5g，将这些物质溶于IL蒸馏水中，调节PH值为7. 8 士 0. 1，于121 °C下灭菌20分钟，备用，《实用医学培养基手册》王钦升等主编，人民军医出版社，1999。试验结果表明，无乳链球菌和停乳链球菌在普通营养肉汤中生长周期长达 20-21h,生长高峰期的细菌数量只有6. OX IO8-L OX IO9CFU,因此，不适宜奶牛乳房炎停乳链球菌和无乳链球菌的规模化培养。THB培养基的组成为牛肉浸出粉10g、胰蛋白胨20g、氯化钠2g、葡萄糖2g、磷酸氢二钠0. 4g和碳酸氢钠2g。将这些物质溶于IL蒸馏水中，调节PH值为7. 8 士 0. 1，于121°C 下灭菌20分钟，备用，《实用医学培养基手册》王钦升等主编，人民军医出版社，1999。试验结果表明，无 乳链球菌在THB培养基中生长周期为12h，生长高峰期的细菌数量可达1. 3 X IO9-L 5 X IO9CFU ；停乳链球菌在THB培养基中生长周期为14h，生长高峰期的细菌数量可达1.4X 109-1.6X 109CFU，细菌产量明显高于普通营养肉汤。但为了进一步提高无乳链球菌和停乳链球菌规模化生产中单位体积中的细菌抗原量，降低生产成本，还必须对该培养基进行改进。中国发明专利申请200610038811. 6公开了一种致奶牛乳房炎链球菌培养液的配制方法及其用途，属于动物疫病诊断和防治领域。将IOg蛋白胨、5g酵母粉、IOg氯化钠、5g 葡萄糖和0. 5g叠氮钠溶于IL水中，用氢氧化钠溶液调整pH至7. 2，再加入无菌0. 1 %结晶紫水溶液1. 3ml和溴甲酚紫水溶液1. 5ml，在121°C下灭菌，最后于4°C保存备用。该培养液属于选择性培养基，奶牛乳房炎链球菌可在该培养基上生长，而葡萄球菌和肠道菌不能在该培养基上生长。因此，该培养液主要用于快速鉴别致奶牛乳房炎的链球菌，同时还可用于抗生素敏感性试验。中国发明专利申请200610038812. 0公开了一种致奶牛乳房炎葡萄球菌培养液的配制方法及其用途，属于动物疫病诊断和防治技术领域。先将IOg蛋白胨、5g酵母粉、IOg 丙酮酸钠、12g甘氨酸、5g氯化锂完全溶解于980ml水中，再用氢氧化钠溶液调pH至7. 3，然后，于121°C下灭菌冷却至50°C 士 10°C时加入无菌亚碲酸钾溶液IOml和7ml吐温80， 4°C保存。该培养液属于选择性培养基，奶牛乳房炎葡萄球菌可在该培养基上生长，而链球菌和肠道菌不能在该培养基上生长。因此，该培养液主要用于快速鉴别致奶牛乳房炎的葡萄球菌，同时还可用于乳房炎葡萄球菌的药敏试验。中国发明专利申请200610038813. 5公开了一种致奶牛乳房炎大肠杆菌培养液的配制方法及其用途，属于动物疫病诊断和防治领域。先将IOg蛋白胨、1.5g三号胆盐、IOg 乳糖、5g氯化钠和5g柠檬酸钠溶于IOOOml水中，再用氢氧化钠溶液调整pH值至7. 2，再向溶液中加入无菌结晶紫水溶液0. 5ml和0. 4%酚红水溶液4ml，在121°C下灭菌，最后置于4°C保存。该培养液属于选择性培养基，奶牛乳房炎大肠杆菌可在该培养基上生长，而链球菌和葡萄球菌不能在该培养基上生长。因此，该培养液主要用于快速鉴别致奶牛乳房炎的大肠杆菌，同时还可用于药敏试验。
发明内容
本发明提供一种可明显缩短细菌培养时间，大大提高细菌生产量，提高细菌毒力和免疫原性，节约生产成本的牛源性无乳链球菌和停乳链球菌生长的培养基。本发明的牛源性无乳链球菌培养基组份为1000ml牛肉浸出液、胰蛋白胨17-23g、酵母浸出粉2-5g、氯化钠2-5g、磷酸氢二钠0. 3-0. 5g、碳酸氢钠2_3g、乳清50_60ml 和500g/L的葡萄糖溶液20-25ml。其最佳组分为1000ml牛肉浸出液、胰蛋白胨20g、酵母浸出粉3g、氯化钠3g、磷酸氢二钠0. 4g、碳酸氢钠2. 5g、乳清50ml和500g/L的葡萄糖溶液 22ml。本发明的牛源性停乳链球菌培养基组份为1000ml牛肉浸出液、胰蛋白胨 17-23g、酵母浸出粉2-5g、氯化钠2-5g、磷酸氢二钠0. 3-0. 5g、碳酸氢钠2_3g、犊牛血清 20-25ml、乳清50-60ml和500g/L的葡萄糖溶液20_25ml。其最佳组分为1000ml牛肉浸出液、胰蛋白胨20g、酵母浸出粉3g、氯化钠3g、磷酸氢二钠0. 4g、碳酸氢钠2. 5g、犊牛血清 20ml、乳清50ml和500g/L的葡萄糖溶液22ml。本发明的牛源性无乳链球菌培养基制备方法是按量称取各组份，将胰蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、磷酸氢二钠，碳酸氢钠溶于牛肉浸出液中，调整PH值至7.7士0. 1，灭菌后再在前述溶液中加 入乳清和的灭菌葡萄糖溶液。本发明的牛源性停乳链球菌培养基制备方法是按量称取各组份，将胰蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、磷酸氢二钠，碳酸氢钠溶于牛肉浸出液中，调整PH值至7.7士0. 1，灭菌后再在前述溶液中加入犊牛血清、乳清和的灭菌葡萄糖溶液。相关的试验结果表明，用本发明的两种培养基分别培养无乳链球菌和停乳链球菌时细菌生长均良好，两种链球菌4h就进入生长对数期，无乳链球菌IOh左右达到生长高峰期，停乳链球菌12h左右达到生长高峰期。两种链球菌生长周期比常用的普通营养肉汤均缩短一半左右，比THB缩短2h左右。用本发明的两种培养基培养的无乳链球菌和停乳链球菌生长高峰期细菌数量比THB培养基细菌数量均提高1/3左右、比普通营养肉汤提高3倍左右。采用本发明的两种培养基进行无乳链球菌和停乳链球菌规模化培养可以大大节约时间，提高细菌抗原浓度和免疫原性，增强疫苗免疫效果，同时还可降低生产成本。
图1为不同培养基对无乳链球菌生长的影响曲线。图2为不同培养基对停乳链球菌生长的影响曲线。
具体实施例方式以下结合实施例解说本发明。无乳链球菌培养基的制备称取胰蛋白胨17_23g、酵母浸出粉2_5g、氯化钠2_5g、 磷酸氢二钠0. 3-0. 5g，碳酸氢钠2-3g，将前述各组份溶于IOOOml牛肉浸出液中，用2M氢氧化钠溶液调整PH值至7. 7士0. 1，分装三角瓶，121°C 20分钟灭菌，溶液放凉后，向溶液中以无菌方式加入乳清50-60ml和500g/L的灭菌葡萄糖溶液20_25ml，摇勻后备用。停乳链球菌培养基的制备称取胰蛋白胨17_23g、酵母浸出粉2_5g、氯化钠2_5g、 磷酸氢二钠0. 3-0. 5g，碳酸氢钠2-3g，将前述各组份溶于IOOOml牛肉浸出液中，用2M氢氧化钠溶液调整PH值至7. 7士0. 1，分装三角瓶，121°C 20分钟灭菌，溶液放凉后，向溶液中以无菌方式加入犊牛血清18-25ml、乳清50-60ml和500g/L的灭菌葡萄糖溶液20_25ml，摇勻后备用。菌种无乳链球菌W04152和停乳链球菌T2009，系从兰州、天津、西安等地奶牛场采集的临床型乳房炎病乳，经分离鉴定，筛选出的毒力强的优势血清型地方菌株。菌种的活化取冻干保存的无乳链球菌(W04152)和停乳链球菌(T2009)，开启后接入含2%血清和5%乳清的普通营养肉汤中，37°C培养16-18h后，涂片镜检纯粹后，接入70ml/L羊血琼脂斜面，37°C培养16_18h，将菌苔刮入含20%甘油、2%血清和5%乳清的的营养肉汤中，混合均勻后，分装冻存管Iml/支，作为母种，加盖，贴签，注明菌种名称， 置-70°C冰箱保藏。 种子液的制备将-70°C冰箱保藏的无乳链球菌和停乳链球菌母种取出后，分别接种于本发明的无乳链球菌和停乳链球菌培养液中，置37°C温箱，无乳链球菌培养10h，停乳链球菌培养12h，镜检纯粹后，即为两种链球菌的种子液。将前述配制好的无乳链球菌和停乳链球菌培养基分别置入500ml三角瓶中，装量为300ml/瓶，再将牛源性无乳链球菌和停乳链球菌种子液分别以0. 08亿/ml的接种量接种于装有两种发明培养基的三角瓶中，在37°C下静止培养2h，然后在转速为120r/min的摇床上振荡培养，在培养的对数生长期内(4-llh)，检测培养基PH，在细菌培养过程中不断补加2M NaOH调节PH值，使其保持在7.2士0. 1，无乳链球菌培养至IOh停止培养，停乳链球菌培养至12h停止培养，收获菌液。本发明的两种培养基与其它培养基使用效果对比将与前述相同的牛源性无乳链球菌和停乳链球菌种子液分别以0. 08亿/ml的接种量接种于装量为300ml的营养肉汤、本发明的两种培养基和THB的三种培养基摇瓶中，在 37°C下静止培养2h，然后在转速为120r/min的摇床上振荡培养至24h，其间每隔2h取样， 用平板计数法测菌浓度。从图1可以看出，牛源性无乳链球菌在本发明无乳链球菌培养基中生长良好，4h 就进入生长对数期，IOh左右达到生长高峰期；在THB培养基中无乳链球菌生长高峰期在 12h左右，细菌量少于本发明培养基。而在普通营养肉汤中，无乳链球菌生长缓慢，10h-12h 才进入生长对数期，20h才达到生长高峰期且细菌量明显少于其它两种培养基。从图2可以看出，牛源性停乳链球菌在本发明停乳链球菌培养基中生长良好，4h 就进入生长对数期，12h左右达到生长高峰期，而在THB培养基中生长高峰期在14h左右，细菌数量少于本发明培养基。在普通营养肉汤中，停乳链球菌生长缓慢，10h-12h才进入生长对数期，20h左右才达到生长高峰期且细菌数量明显少于其它两种培养基。本实验结果表明，适宜的培养基对细菌的生长有明显的促进作用。营养肉汤不适宜牛源性无乳链球菌和停乳链球菌生长，最佳的培养基为本发明的培养基。本发明培养基主要特点是在培养基中添加胰蛋白胨，用来补充碳源和氮源，添加乳清用来提高细菌的毒力和免疫原性，配置简单即缩短了培养时间，也提高了单位体积中细菌数量和细菌的免疫原性，增强了疫苗免疫效果，同时还降低了生产成本，适宜无乳链球菌和停乳链球菌大规模发酵生产使用。
权利要求
1.一种牛源性无乳链球菌培养基，其特征在于培养基的组份为1000ml牛肉浸出液、 胰蛋白胨17_23g、酵母浸出粉2-5g、氯化钠2-5g、磷酸氢二钠0. 3-0. 5g、碳酸氢钠2_3g、乳清50-60ml和500g/L的葡萄糖溶液20_25ml。
2.权利要求所述的牛源性无乳链球菌培养基，其特征在于培养基的组份为1000ml牛肉浸出液、胰蛋白胨20g、酵母浸出粉3g、氯化钠3g、磷酸氢二钠0. 4g、碳酸氢钠2. 5g、乳清 50ml和500g/L的葡萄糖溶液22ml。
3.一种牛源性停乳链球菌培养基，其特征在于培养基的组份为1000ml牛肉浸出液、 胰蛋白胨17_23g、酵母浸出粉2-5g、氯化钠2-5g、磷酸氢二钠0. 3-0. 5g，碳酸氢钠2_3g、犊牛血清20-25ml、乳清50-60ml和500g/L的葡萄糖溶液20_25ml。
4.权利要求3所述的牛源性停乳链球菌培养基，其特征在于培养基的组份为1000ml 牛肉浸出液、胰蛋白胨20g、酵母浸出粉3g、氯化钠3g、磷酸氢二钠0. 4g、碳酸氢钠2. 5g、犊牛血清20ml、乳清50ml和500g/L的葡萄糖溶液22ml。
5.权利要求1至4所述的任一牛源性无乳链球菌培养基制备方法，其特征在于按量称取各组份，将胰蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、磷酸氢二钠，碳酸氢钠溶于牛肉浸出液中，调整pH值至7.7士0. 1，灭菌后再在前述溶液中加入乳清和的灭菌葡萄糖溶液。
6.权利要求5所述的牛源性停乳链球菌培养基制备方法，其特征在于按量称取各组份，将胰蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、磷酸氢二钠，碳酸氢钠溶于牛肉浸出液中，调整PH值至7. 7士0. 1，灭菌后再在前述溶液中加入犊牛血清、乳清和的灭菌葡萄糖溶液。
全文摘要
本发明公开一种用于牛源性无乳链球菌或停乳链球菌生长的培养基。本发明的牛源性无乳链球菌培养基组份为1000ml牛肉浸出液、胰蛋白胨17-23g、酵母浸出粉2-5g、氯化钠2-5g、磷酸氢二钠0.3-0.5g、碳酸氢钠2-3g、乳清50-60ml和500g/L的葡萄糖溶液20-25ml。本发明的牛源性停乳链球菌培养基组份为1000ml牛肉浸出液、胰蛋白胨17-23g、酵母浸出粉2-5g、氯化钠2-5g、磷酸氢二钠0.3-0.5g、碳酸氢钠2-3g、犊牛血清20-25ml、乳清50-60ml和500g/L的葡萄糖溶液20-25ml。
文档编号C12R1/46GK102352335SQ20111032440
公开日2012年2月15日 申请日期2011年10月21日 优先权日2011年10月21日
发明者严作廷, 李宏胜, 李新圃, 杨峰, 王玲, 罗金印, 苗小楼, 陈炅然 申请人:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所