专利名称：一种培养超高细胞浓度丁酸梭菌的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是提供了一种培养超高细胞浓度丁酸梭菌的方法，涉及一种显著促进丁酸梭菌持续生长的含碳有机物组成成分。
背景技术：
丁酸梭菌，又名酪酸菌，它是一种专性厌氧芽胞杆菌，具有调节人体或动物胃肠道菌群组成、预防和治疗各种腹泻、促生长、调节免疫力等多重功效。近年来国内外对丁酸梭菌的研究主要集中在医学方面，饲料方面的研究也逐渐升温。丁酸梭菌菌剂的活性与其数量密切相关，为推进其应用，关键是要解决菌种的高密度培养问题。由于丁酸梭菌在生长过程中会产生大量有机酸类代谢产物，导致培养液的 PH值迅速下降；当培养液的pH值降至4.5以下时，菌体的生长繁殖就会受到抑制。因此， 采用传统的菌种生产工艺，菌种的数量得不到保证，且生产成本高。高密度培养技术广泛地应用于各种微生物的生产中，它是指采用一定的工艺技术，维持微生物生长的适宜条件，延长微生物的指数增殖过程，从而得到高浓度的细胞。要实现丁酸梭菌的高密度培养，必须解除其代谢产物有机酸对丁酸梭菌自身生长的抑制作用。有针对性地解除这种抑制，实现丁酸梭菌的高密度培养，已成为研究和开发丁酸梭菌微生态制剂的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一种培养超高细胞浓度丁酸梭菌的方法，有效提高培养物中的丁酸梭菌浓度，提高丁酸梭菌产品的质量。本发明在常规液体培养基中添加尿素作为调节培养基pH的生理碱性盐，并将尿素在液体培养基中的浓度控制在1.0-3.0 g/L范围内。用尿素作为生理碱性盐替代碳酸钠等缓冲剂缓解培养基PH快速下降，不仅能够增加培养物中的丁酸梭菌T4浓度，而且能够提高丁酸梭菌T4的质量。如果添加的尿素浓度低于1. 0 g/L,由于浓度较低，会导致体系缓冲能力不足，丁酸梭菌T4产生的有机酸使培养基pH迅速下降，使丁酸梭菌T4自身的生长受到抑制。当尿素添加量高于3. 0 g/L,由于尿素本身水解后生成NH4+,高浓度的NH4+对发酵产酸菌的生长同样表现出抑制效应。实验显示，在丁酸梭菌T4液体培养基中添加l.(T3.0 g/L的尿素， 是促进丁酸梭菌"Γ4生长的优化控制方法。本发明研究确定一种能够有效缓解培养基pH快速下降、改善细菌絮体形态和促进丁酸梭菌T4快速持续生长的生理碱性盐。一方面可以缓解培养基pH快速下降对丁酸梭菌T4生长产生的抑制，另一方面还可以改善细菌絮体形态、促进丁酸梭菌T4的持续生长。
本发明的工作原理是
在厌氧条件下，丁酸梭菌T4利用大分子有机化合物作为碳源和能源进行自身生长和代谢，其代谢末端产物包含丁酸和氢气等，丁酸在溶液中会离解出氢离子使培养基氢离子浓度升高，培养物的PH持续下降。当PH低于丁酸梭菌T4自身所能承受的阈值时，丁酸梭菌T4的生长和代谢便会受到抑制。当向培养基中添加尿素时，尿素首先在丁酸梭菌T4尿素水解酶的作用下水解出 CO2和NH4+,由于1分子的尿素产生1分子的(X)2和2分子的NH4+,因此，尿素水解后培养体系的氢离子浓度降低，PH升高。根据尿素的这种特性可将其作为一种促进发酵产酸菌生长的生理碱性盐，缓解丁酸梭菌T4产酸时pH下降过快而对自身生长产生的抑制作用。另外， 尿素还能够改善丁酸梭菌T4絮体形态，从而支持丁酸梭菌T4的持续稳定生长。因此，添加尿素对丁酸梭菌T4的生长具有双重促进作用。本发明的有益效果是
添加尿素作为生理碱性盐可在较高程度上缓解因培养物pH快速降低而对丁酸梭菌T4 生长产生的抑制作用，同时，能够改善丁酸梭菌T4絮体形态，使丁酸梭菌T4在发酵产酸的条件下持续生长，最终达到较高的细胞浓度。促进了工业化生产出超高细胞浓度丁酸梭菌 T4菌液。
图1是添加不同缓冲剂对丁酸梭菌T4细胞浓度的影响。图2是添加不同缓冲剂对培养基pH的影响。
具体实施例方式首先配制丁酸梭菌T4的基础培养基，其组成为(g/L)葡萄糖10，酵母粉2，蛋白胨 2，NaCl 4,MgS04 ·7Η20 0. 1，FeSO4 · 7Η20 0. 1，L-半胱氨酸 0. 5，微量元素液[MnSO4 ‘ 7Η20 0. 01，CaCl2 · 2Η20 0. 01, ZnSO4 · 7Η20 0. 05，NaMoO4 0· 01，H3BO3 0· 01，CoCl2 · 6Η20 0. 2， AlK(SO4)2 0.01] 10 mL，维生素液[抗坏血酸0.025，钴铵素0.01，叶酸0.01，肌酸0.025] 10 mL，刃天青(0. 1%) 1 mL，初始pH调节为7. 2。将配制好的丁酸梭菌T4培养基放入500 mL具塞锥形瓶内在124°C下灭菌20 min，待培养基冷却至室温后，通过0.45 ym滤膜加入不同浓度的缓冲剂，以不加入缓冲剂的空白作为对照，考察不同类型缓冲剂对丁酸梭菌T4 生长的影响。实验在温度37 °C，转速120 rpm的摇床中进行，每5 h取样分析细胞浓度及 pH，结果见图1和图2。从图1可以看出，添加缓冲物质能不同程度的增加细菌的细胞浓度。在本实验中， 丁酸梭菌T4接种后没有表现出明显的延迟期，接种后细胞浓度即开始增长。在最初的5 h 内，添加缓冲物质与不添加缓冲物质对细胞浓度的影响不大，其细胞浓度均在0. 4 g/L左右，这是因为在最初的5 h内，培养基中的pH变化较小，所有培养基中的pH均维持在6. 0 以上，已知丁酸梭菌T4适宜生长的pH在7. 2^4. 5之间，因此，此时丁酸梭菌T4生长基本不受PH的限制。在5 10内，添加缓冲物质的培养基中的细胞浓度增加明显，其中添加尿素对细胞增长的促进最显著，培养至10 h时，丁酸梭菌T4细胞浓度达到1.11 g/L，与不加缓冲物质的空白相比，其细胞浓度提高了 1倍。培养10 h后，不加缓冲物质的空白中细胞增长趋于停止，至培养结束的25 h止，细胞浓度仅增加了 0.09 g/L。添加缓冲物质的培养基中细菌细胞浓度在10 h后仍然能够保持一定的增长速度，至培养结束的25 h时，添加尿素的培养基中细胞浓度可达到1. 7 g/L，是空白的2. 61倍。从图2可以看出，添加缓冲物质能在一定程度上减缓培养基pH的降低。培养至5 h时，不添加缓冲物质的培养基pH已从初始的7. 2降至6. 0，添加缓冲物质的培养基pH均在6. 7以上，其中以添加尿素的效果最显著，培养基的pH维持在6. 86。5 10h时不添加缓冲剂的空白PH迅速降至4. 0，添加磷酸盐缓冲液的培养基pH降至5. 4，而添加碳酸盐和尿素的培养基PH维持在6.0以上。至培养结束的25 h时，除了添加碳酸钠作缓冲剂的培养基，其它体系的PH均降低到3. 5以下，如此低的pH必然会对丁酸梭菌T4的生长产生强烈的抑制作用，使丁酸梭菌T4生长基本处于停滞状态，发酵结束。总体来看，添加缓冲剂能使培养基的PH较长时间的停留在4. 0以上，这样能给丁酸梭菌T4生长提供更足够的生长时间。其中，以碳酸钠对PH的缓解效果最佳，但添加碳酸钠并不能获得最高的细胞浓度，反而以添加尿素的效果最佳。这可能是因为尿素除了能够作为生理碱性盐调节培养基的PH，还能够改善细菌絮体形态，促进丁酸梭菌T4持续生长。综合图1和图2的结果，添加缓冲剂减缓培养基pH降低能有效促进丁酸梭菌T4 生长，但仅从控制PH角度促进丁酸梭菌T4生长其细胞浓度增加有限，表现在添加碳酸钠后，丁酸梭菌T4生长结束时培养基pH仍能保持在4. 5左右，而此时细胞浓度仅能达到0. 9 g/L。而采用尿素作为缓冲剂时，虽然培养基的pH最终也会降低到3. 5以下，但是细胞浓度的升高幅度远远高于采用碳酸钠作为缓冲剂时的升高幅度。因此，在丁酸梭菌T4液体培养基中添加1. 0 3. 0 g/L的尿素，是促进丁酸梭菌T4生长的优化控制方法。另外，添加尿素后获得的批式培养的细胞浓度可达到连续培养或在线PH控制获得的丁酸梭菌T4细胞浓度，这在丁酸梭菌T4的产业化生产上具有非常重要的意义。
权利要求
1.一种培养超高细胞浓度丁酸梭菌的方法，其特征在于在常规丁酸梭菌培养基中添加尿素作为生理碱性盐促进丁酸梭菌生。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于将尿素在液体培养基中的浓度控制在 l.(T3. 0 g/L 范围内。
全文摘要
本发明提供了一种培养超高细胞浓度丁酸梭菌T4的方法。其特征在于在常规丁酸梭菌T4培养基中采用尿素作为生理碱性盐促进丁酸梭菌T4生长；并将尿素在液体培养基中的浓度控制在1.0~3.0g/L范围内。本发明的优点在于既能在一定程度上缓解因培养基pH降低过快而对丁酸梭菌T4生长产生的抑制作用，同时又可以促进丁酸梭菌T4持续生长，最终达到较高的细胞浓度。促进了工业化生产出超高细胞浓度丁酸梭菌T4液。
文档编号C12N1/20GK102329761SQ201110324228
公开日2012年1月25日 申请日期2011年10月24日 优先权日2011年10月24日
发明者王兴祖 申请人:沈阳建筑大学