专利名称：Tat-wnk102穿膜蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种TAT-WNK102穿膜蛋白及其应用。
背景技术：
在多发性硬化等中枢神经系统脱髓鞘疾病发病过程中同时伴有自身OPC细胞的分化成熟及重新成髓鞘过程。目前对于如何促进多发性硬化发病人自身的重新成髓鞘过程的分子机制的研究是国内外研究的一个热点。多发性硬化发病过程中，崩解的轴突髓鞘内产生许多抑制性因子。这些抑制因子的受体LING0-1在新生的少突胶质细胞上表达并抑制其分化成熟和重新成髓鞘。利用拮抗具有LRR结构和免疫球蛋白结构域的Nogo受体作用蛋白I(LINGO-I)功能的抗体发现可以促使实验脱髓鞘大鼠功能部份恢复。但其下游信号转导通路不明。
发明内容
本发明目的之一在于提出一种TAT-WNK102穿膜蛋白。本发明的目的之二在于提供该蛋白在制备治疗中枢神经系统脱髓鞘疾病药物中的应用。研究表明激酶域无赖氨酸的丝苏氨蛋白激酶1 (WNKl)可介导LING0-1 (具有LRR 结构和免疫球蛋白结构域的Nogo受体作用蛋白1)对神经元轴突延伸的抑制。在少突胶质细胞分化成熟过程中LING0-1 WNKl的抑制性信号转导通路抑制了少突胶质细胞的成熟； 抑制LING0-1与WNKl结合的肽段；并观察到LING0-1与WNKl的相互作用被这种肽段抑制后促进培养的少突胶质细胞分化成熟，从而提示该融合蛋白可用于中枢神经系统脱髓鞘疾病的治疗。本发明提出TAT-WNK102蛋白可抑制LING0-1激活IihoA的信号转导。一种TAT-WNK102穿膜蛋白，其特征在于该蛋白为SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。上述的TAT-WNK102穿膜蛋白的制备方法，其特征在于该方法的具体步骤为将含有HIVl (艾滋病毒)的Tat (转录反式激活因子)蛋白中最小的一段转位穿膜结构域序列， 即 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Arg Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln序列，插入相应的WNKl的cDNA的N-末端，经体外大肠杆菌BL21菌株表达系统表达并经纯化，得到TAT-WNK102穿膜蛋白。上述的TAT-WNK102穿膜蛋白作为LING0-1与WNKl结合的抑制剂在抑制LING0-1 激活IihoA蛋白促进少突胶质细胞重新成髓鞘中的应用。上述的TAT-WNK102穿膜蛋白在制备治疗中枢神经系统脱髓鞘病变药物中的应用。
图1证明Nogo66蛋白做为基质抑制原代培养的大鼠OPC细胞分化成熟。我们发现在Nogo66基质上生长的OPC分化细胞数目明显减少。(B)
图2为图1中分化细胞比例的统计分析。数据来自三次独立实验，以均值士标准误表示。进 亍Student，s_t_检验比较，ρ < 0. 001。图3干扰了内源性WNKl的表达可以逆转Nogo66蛋白抑制OPC细胞分化成熟的作用。图4证明WNK102可与内源性的LING0-1结合。图5证明纯化的TAT-WNK102可以逆转Nogo66蛋白抑制OPC细胞分化成熟的作用。
具体实施例方式下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例1 制备TAT-WNK102融合蛋白
WNK102蛋白对应人类WNK-I分子氨基酸序列308-409，来自以全长结构 pEGFP-Nl-hffNK-1为模板的亚克隆。融合蛋白TAT-WNK102的产生是将含有HIVl的Tat蛋白中最小的一段转位结构域序列(MRGSHHHHHHGMARGYGRKKRRQRRRPQ)正确插入相应WNKl cDNA的N-末端。融合蛋白经体外BL21系统表达并用镍亲和层析柱按经典方法纯化。实施例2 =SD大鼠少突胶质细胞的培养
取SD新生大鼠脑，分离双侧大脑皮质，D. Hanks液冲洗，吸管吹打制成细胞悬液，200 目细胞筛网过滤，ISOXg离心5 min，弃上清，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，以(1. 0-2. 0)*106密度种植于0. 025%多聚赖氨酸预处理的75c m2培养瓶5%C02培养 8-lld,待细胞融汇并形成明显分层，开始OPCs振荡分离和纯化(将培养瓶置于恒温空气浴振动摇床、37度、150r/min，振荡池以去除小胶质细胞等。D. Hanks液冲洗，换液；5%C02孵箱平衡 2h ；230r/min,16-18h, 280r/min, l_2h;收集细胞悬液，离心 400 X g 5 min，含 10% 胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，以l*104/cm2密度种植于多聚赖氨酸预处理的盖玻片上)。4-8h后，待细胞贴壁即更换为无血清培养基，成分为DMEM/F12，含胰岛素5mg/L、转铁蛋白 100mg/L 黄体酮 6ug/L、腐胺 16mg/L、亚硝酸钠 5ug/L、PDGF 20ng/ml bFGF 20ng/ ml。此后每2天半量换液。OPC细胞分化培养基为Neurobasal加B27(l :50)加T3(30nM)。 实施例3 取实施例2中纯化的SD大鼠少突胶质细胞，接种于预先涂有GST-Nogo66 蛋白或GST蛋白的35mM培养板，三小时后更换为新鲜的含2%B27的Neurobasal-A培液 (Gibco),。培养5天，细胞用抗-MBP抗体做免疫组化并在在共聚焦显微镜下观察并拍照。 见图1和图2，用Nogo66蛋白做为基质培养原代培养的大鼠OPC细胞，的确会抑制OPC细胞在其分化培养基中的分化成熟。在Nogo66基质上生长的OPC分化细胞数目明显减少。图2 为图1中分化细胞比例的统计分析。数据来自三次独立实验，以均值士标准误表示。进行 Student，s_t_ 检验比较，ρ < 0. 001。实施例4:取实施例2中纯化的SD大鼠少突胶质细胞随即根据说明手册用 Neucleitransfector (ΑΜΑΧΑ公司)电转染相应质粒(WNK1干扰质粒及对照质粒)，接种于预先涂有GST-Nogo66蛋白或GST蛋白的35mM培养板，三小时后更换为新鲜的含2%B27的Neurobasal-A培液(Gibco)，。转染后5天，细胞用抗-MBP抗体做免疫组化并在在共聚焦显微镜下观察并拍照。见图3可知，用Nogo66蛋白做为基质培养原代培养的大鼠OPC细胞，会抑制OPC细胞在其分化培养基中的分化成熟，而干扰了内源性WNKl的表达可以逆转此作用。提示WNKl可能也参与了 LING0-1的激活导致的抑制OPC细胞分化成熟信号的转导。(Figurel)图中显示用Nogo66蛋白做为基质培养原代培养的大鼠OPC细胞(培养之前分别电转了绿色荧光蛋白标记的WNKl的干扰质粒与干扰对照质粒)，在分化培养基中的分化5天后做MBP染色，对照组OPC细胞分化较差表现为突起生长较短，突起融合成片的较少，MBP染色较浅。而干扰了 WNKl之后的OPC细胞分化很好，其分枝较长且分枝之间也可见融合成片，MBP染色呈强阳性。实施例5:LING0-1胞内段(LING0_1IC)(氨基酸580-620)对应的cDNA序列被正确亚克隆至并插入pEGFP-ΝΙ载体表达LING0-1-IC-GFP蛋白。WNKl (氨基酸308-410)被亚克隆至PKH3载体表达HA-WNKl (102)蛋白。四3细胞培养于含10%胎牛血清DMEM培养液中，37°C、5%C02孵箱内。瞬时转染前，以40%细胞融合率接种于带60 mm培养板上培养 12小时后进行转染，常规采用LipofectamindOOO转染，严格按照操作手册步骤进行。将各上述两种质粒按摩尔比1:1共转，37°C、5%C02孵育4小时后更换为新鲜培液，继续培养48小时后分别加入后用PBS清洗两次加入RIPAI组织裂解液(20mM Tris-HCI,pH 7.5， 137mM NaCI,50mM NaF,0. 02%NaN3,1%ΝΡ-40,2mM EDTA,2mM benzamidine,ImM PMSF,2pg/ ml pepstatin A,2pg/ml leupeptin,4 pg/ml antipain,2pg/ml aprotinin,2mM DTT)。 细胞经手工冰上勻浆，勻浆液于4°C 14, 000 rpm离心10 min，取上清。免疫共沉淀和 Western blot检测取500 μ 1上述细胞裂解液，加IP抗体(5 μ g每反应)，在4°C翻转鮮育 1-3 h 后力口入 20 μ 1 protein G-agarose (Roche Molecular Biochemicals)悬液，继续于4°C翻转孵育12 h。12000 rpm离心2 min，弃上清，免疫沉淀物用IP bufe (r20 mM Tris-HCI pH 7.5,2 mM EGTA，150 mM NaCl, l%NP-40, ImM DTT)洗三次，弃上清。 然后重悬在2X蛋白质电泳上样缓冲液中，进行1 的SDS-PAGE电泳。湿法将蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂奶粉的TBS-T (10 mM Tris-HCI(pH 7. 5 )，150 mM NaCl, 0.1% Tween-20)溶液封闭膜2_;3hr，一抗4°C结合过夜，用TBS-T室温洗膜四次， 每次15min。用二抗于室温结合2-!3hr，再用TBS-T洗膜四次，每次15min。用吸水纸吸尽多余的液体，用SuperSignal ECL试剂显色。用Kodark X-ray底片压片，曝光30秒至5分钟后显影。参见图4可知WNK102可以和LING0-1结合。在293细胞中共表达HA 标记WNK102及对照肽段与GFP标记的LING0-1。用GFP抗体IP后用HA抗体IB发现只有 WNK102肽段特异的与LING0-1结合。实施例6 取实施例2中纯化的SD大鼠少突胶质细胞，接种于预先涂有 GST-Nogo66蛋白或GST蛋白的35mM培养板，三小时后更换为新鲜的含2%B27的 Neurobasal-A培液(Gibco)，同时加入纯化好的TAT-WNK102蛋白(IOOnM)或者对照 TAT-control P印蛋白(IOOnM)0培养5天，细胞用抗-MBP抗体做免疫组化并在在共聚焦显微镜下观察并拍照。参见图5可知，用Nogo66蛋白做为基质培养原代培养的大鼠OPC细胞，会抑制OPC细胞在其分化培养基中的分化成熟，给予镍柱纯化的TAT-WNK102蛋白可以逆转此作用，显著促进在Nogo66蛋白基质上培养的大鼠OPC细胞分化成熟。中枢神经系统脱髓鞘疾病(CNS demyelinating diseases)，主要表现为髓鞘结构
5完整性受到破坏可引起严重的中枢神经系统病变。例如多发性硬化症是一种发生在中枢神经系统的自身免疫性疾病，自身产生攻击少突胶质细胞的抗体，以大脑和脊髓炎症和神经脱髓鞘变化为特征，好发于青壮年时期，发病高峰为2 2岁至2 6岁。全球约有患者3 O O 多万名，在我国青壮年人群中也越来越多见。在多发性硬化发病过程中同时伴有自身OPC 细胞的分化成熟及重新成髓鞘过程，表现为病人运动功能有所恢复。目前对于如何促进多发性硬化发病人自身的重新成髓鞘过程的分子机制的研究是国内外研究的一个热点。中枢神经系统内，神经元存在于胶质细胞形成的环境中，胶质细胞包绕神经元轴突形成髓鞘。轴突的髓鞘内可分离出许多抑制性因子，这些成分通称为髓鞘相关抑制因子 (Myelin Associated Inhibitory Factors, MAIFs)。已经证明 MAIFs 通过与神经元上的特异性受体复合体相互作用(Nogo 66受体(Nogo 66 receptor,即Nogo receptor, NgRl)和LINGO-I受体)，中枢神经损伤时，髓鞘崩解，大量释放MAIFs。最初认为它们是形成中枢神经系统损伤后轴突再生障碍的主要来源，现在证明它们也可能是神经系统退行性疾病中抑制新生少突胶质细胞重新成髓鞘的重要因素。在MS病人的CNS白质病灶区还是存在少突胶质前体细胞(OPC)的，且在脱髓鞘的轴突附近，问题的关键是由于MAIFs的存在这些OPC并不能分化成熟形成新的髓鞘。那么，调控OPC对MAIFs的反应使之参与髓鞘形成应该是代表一种新的治疗MS策略。既然已经知道MAIFs是神经系统退行性疾病中抑制新生少突胶质细胞重新成髓鞘的重要因素，那么拮抗OPC上MAIFs的受体功能会不会促进OPC重新成髓鞘？ Mi Sha小组从LING0-1在少突胶质细胞上表达这一现象切入，首先在离体培养的少突胶质前体细胞上详细研究了 LING0-1的功能，发现应用削弱其功能的dominant-negative LINGO-U LING0-1 RNAi或可溶的胞外段LING0-1 (LINGO-I-Fc)会导致少突胶质前体细胞分化成熟并增强髓鞘化能力。相反地，过表达LING0-1将激活IihoA从而抑制少突胶质细胞的分化和形成髓鞘的能力。在少突胶质细胞和神经元共培养体系中，施加LINGO-I-Fc可以获得高度髓鞘化并具有明显toavier氏结的神经轴突。进一步，Mi Sha等构建了 LING0-1 基因敲除小鼠，并在电镜水平证实该基因敲除小鼠CNS中发育早期即出现过成熟的髓鞘化神经轴突。综合这些离体和在位的实验观察结果可以初步得出拮抗LING0-1信号通路对CNS髓鞘形成至关重要。利用LING0-1基因敲除或者拮抗LING0-1功能的抗体造成 LING0-1功能缺失，可以促使实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE experimental autoimmune enc印halomyelitis)大鼠功能部份恢复。并且在电子显微镜下观察发现轴突明显的重新成髓鞘。研究人员从而提出针对LING0-1或其途径的对抗治疗是一种治疗中枢神经系统CNS 脱髓鞘疾病的新方法。因此少突胶质细胞分化成熟的负调控因子LING0-1的拮抗剂或针对其信号通路上的分子调控物是富有前景的治疗CNS脱髓鞘疾病的药物。近期我们的研究通过酵母双杂交筛选发现一种丝苏氨酸激酶分子WNKl (WNK lysine deficient protein kinase 1)的激酶域片段 WNK1( 123-510)可以直接与 LING0-1 胞内段结合。WNKl可能介导了 LING0-1抑制少突胶质细胞分化成熟的过程。我们的结果明确了 WNKl也会影响到少突胶质细胞的突起生长分化成熟，我们在体外培养的OPC细胞内干扰内源性WNKl的表达，发现会显著促进OPC细胞的分化成熟，表现为突起生长分枝极大增加和少突胶质细胞成熟标志抗原MBP染色阳性细胞比例的显著增加(图3)，提示WNKl在少突胶质细胞的突起生长分化成熟中也发挥着抑制作用。我们寻找到可抑制LING0-1与WNKl结合的小肽段WNK102，并将其与穿膜肽TAT融合表达；我们观察到LING0-1与WNKl的相互作用被合成的TAT- WNK102蛋白抑制后会促进培养在Nogo66 基质上的少突胶质细胞分化成熟(图5)，这是促进脱髓鞘模型大鼠重新成髓鞘并促进其功能恢复的关键。因此我们提出TAT-WNK102穿膜蛋白可应用于多发性硬化疾病的治疗。
权利要求
1.一种TAT-WNK102穿膜蛋白，去特征在于该蛋白为SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。
2.一种根据权利要求1所述的TAT-WNK102穿膜蛋白的制备方法，其特征在于该方法的具体步骤为将含有艾滋病毒HIVl的转录反式激活因子Tat蛋白中最小的一段转位穿膜结构域序列，即Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Arg Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln 序列，插入相应的 WNKl 的 cDNA 的 N-末端，经体外大肠杆菌BL21菌株表达并经纯化，得到代号为TAT-WNK102穿膜蛋白。
3.一种根据权利要求1所述的TAT-WNK102穿膜蛋白作为LING0-1与WNKl结合的抑制剂在抑制LING0-1功能并促进少突胶质细胞重新成髓鞘中的应用。
4.一种根据权利要求1所述的TAT-WNK102穿膜蛋白在制备治疗中枢神经系统脱髓鞘病变药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种TAT-WNK102穿膜蛋白及其应用。该该蛋白为SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。本发明的TAT-WNK102穿膜蛋白能抑制LINGO-1与WNK1的结合；并且当LINGO-1与WNK1的相互作用被这种肽段抑制后，能促进培养的少突胶质细胞分化成熟，从而得出该TAT-WNK102穿膜蛋白可用于制备治疗中枢神经系统脱髓鞘疾病的药物。
文档编号C12N15/70GK102382806SQ20111032423
公开日2012年3月21日 申请日期2011年10月21日 优先权日2011年10月21日
发明者张照环, 徐晓辉, 黄海 申请人:上海大学