低氧诱导因子3α基因作为牛优良超数排卵性状分子标记的鉴定方法及其应用的制作方法

专利名称：低氧诱导因子3α基因作为牛优良超数排卵性状分子标记的鉴定方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及牛低氧诱导因子3d基因片段的克隆以及其在牛超数排卵性状标记辅助选择中的应用。
背景技术：
Mapletoft 等(Mapletoft RJ 等，Assisted reproductive technologies incattle a review. Rev Sci Technol 2005, 24 :393-403)报道,超数排卵在人类及动物胚胎移植领域是最有意义的技术之一，已被应用多年。此技术更是全世界范围内牛胚胎生产及胚胎移植的重要组成部分。全世界范围内每年有超过50万枚胚胎是通过此技术获得的。在牛胚胎移植过程中，多选择正常发育的桑葚胚(Morula)档次以上的可用胚胎(优质的桑葚 胚和囊胚)进行移植。因此，利用此技术获得更多的可用胚胎，对牛胚胎生产和移植具有重要的意义。Mapletoft 等(Mapletoft R J 等，Recent advances in the superovulationin cattle. Reprod Nutr Dev 2002,42 :601-611)报道，遗传因素可能是影响超数排卵效果的因素之一。Fauser 等(Fauser B C 等，Predictors of ovarian response progress towards individualized treatment in ovulation induction and ovarianstimulation. Hum Reprod Update 2008,14 :1-14)报道,候选基因的单核苷酸遗传多态性可能成为预测卵巢反应的首选因素。Maynard M A等报道(Maynard M A等，Multiple splice variants of the humanHIF-3 a locus are targets of the von Hippel-Lindau E3 ubiquitin ligase complex.J Biol Chem. 2003,278 :11032-11040)低氧诱导因子3a (HIF-3 a )在人胎盘和心肌中具有很高的表达量。Genbacev O等报道(Genbacev O等，Human cytotrophoblast expressionof the von Hippel-Lindau protein is down-regulated during uterine invasion insitu and upregulated by hypoxia in vitro. Dev. Biol. 2001,233 :526-536)由于通过母体血液经胎盘提供给胎儿的氧气量很有限，胚胎便逐渐暴露在低氧环境下，这时HIF-3 α不会再发生降解，并大量聚集在细胞核内发挥生物学作用。Toshiharu Yamashita等(Toshiharu Yamashita 等，Abnormal Heart Development and Lung Remodeling in MiceLacking the Hypoxia-Inducible Factor-Related Basic HeIiχ-Loop-HeIix PAS ProteinNEPAS. Molecular and cellular Biology. 2008,4(28) :1285-1297)也报道，在胚胎和新生儿阶段，HIF-3 α表达也发生显著的变化。Formenti F等(Formenti F等，"Regulation ofhuman metabolism by hypoxia-inducible factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107(28)12722-12727)证明在哺乳动物中，缺失HIF可以导致胎儿的死亡。同时，其在调节人体新陈代谢中也起着核心作用。因此，低氧诱导因子3a (HIF3A)基因可以被选定为候选基因，其单核苷酸遗传多态性可能为动物繁殖和生产性能的辅助选择提供分子标记。

发明内容
本发明的目的在于克隆牛低氧诱导因子3 α (HIF3A)基因片段，鉴定其特定的突变位点以作为牛优良超数排卵性状相关基因多态性的检测方法，为牛标记辅助育种提供一种有意义的分子标记。本发明通过以下技术方案实现一种通过特异性引物和PCR(Polymerase Chain Reaction)方法获得的牛超数排卵性状相关基因低氧诱导因子3 a (HIF3A)的379bp序列，如表SEQ ID N0:1所示。所获得HIF3A基因片段的DNA下列中有如表SEQ ID NO : I所述的C278-G278的碱 基突变，导致Alw44I_RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)多态性的产生。一种筛选适用于牛优良超数排卵性状相关的分子标记的方法，按照以下步骤制备:通过设计特异性引物一对，正向引物HIF3A-F :5’-CTGGGCAGTTGCTACTGTTCCTAT-3’和反向引物HIF3A-R :5’ -AGTCCCGTCCAGGATTGGT-3’，从牛血液中提取基因组DNA，进行PCR扩增。由于PCR产物片段的DNA序列第278位存在C-G的碱基突变，导致Alw44I_RFLP多态性的产生，利用限制性内切酶Alw44I可进行此突变位点的检测。PCR产物片段的酶切产物可利用2%琼脂糖凝胶电泳检测，将检测结果所示的不同基因型与牛超数排卵性状关联分析。具备特定的基因型的个体将得到更好超数排卵效果O以下对本发明作详细的描述一、牛低氧诱导因子3 a (HIF3A)基因片段的克隆利用生物学软件01igo6. O设计一对特异性引物。建立PCR反应条件，具体情况如下HIF3A-F5，-CTGGGCAGTTGCTACTGTTCCTAT-3 ’(正向引物)HIF3A-R5，-AGTCCCGTCCAGGATTGGT-3 ’(反向引物)为较快地获得良好的结果，本发明选择Biomiga公司的2XBench TopTaqMaster mix进行PCR扩增。具体反应体系为2XMaster Mix (产品包装盒内提供，其中含Taq DNA Polymerase 0. 05 units/ μ 1,4mM MgCl2,0. 4mM dNTPs) 10. 0 μ I,正向引物与反向引物(浓度为均为lOpmol/μ I)各0. 5μ 1，基因组DNA 0. 5 μ I (含10_50ngDNA)，二馏水8. 5 μ I。PCR反应条件为94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，共35个循环，72°C最后延伸5分钟。二、RLFP诊断方法的建立用引物HIF3A-F和HIF3A-R扩增牛基因组DNA得到379bp的特异扩增片段(SEQID N0:1)。测序结果发现，在该379bp片段中，由于第278bp处存在C —G的突变，从而导致Alw44I酶切位点(G~TGCAC)的产生，其中，278_279bp间为Alw44I酶的多态性切点。PCR扩增产物经Alw44I酶切产生三种基因型，经2%琼脂糖凝胶电泳可明显判别不同带型。其中CC型只有379bp —条带，CG型含有379bp、278bp、IOlbp三条带，GG型有IOlbp和278bp两条带(图2)。三、标记性状关联分析
以申请人所拥有的实验群体为实验对象进行超数排卵性状测量，利用SPSS19.0软件进行不同基因型与不同个体间的性状关联分析。本发明的效果是如下I、牛HIF3A基因部分DNA序列的克隆PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示为特异性PCR产物，如图I所示。将PCR产物回收测序，结果显示产物长度为379bp。测序结果显示该片段278bp处存在C、G两个等位基因，部分测序峰如图3所示。2、针对牛HIF3A基因部分DNA片段PCR-RFLP诊断方法的建立用本发明设计的特异性引物扩增牛基因组DNA得到的379bp特异扩增片段。测序的结果发现在该379bp片段存在的突变会导致Alw44I酶切位点(G~TGCAC)，其中第278bp-279bp处为酶切位点。扩增产物经过限制性内切酶Alw44I酶切可产生三种基因型， 即CC型、CG型和GG型，具体图片如图2所示。3、对标记性状进行关联分析本发明中牛HIF3A基因的扩增序列Alw44I多态位点与牛超数排卵性状的关联分析结果表明，此酶切位点不同基因型所对应的个体的一些超数排卵性状存在显著或极显著的差异。


图I是HIF3A基因扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker，1-14泳道为被检测的14个PCR产物。图2是2%琼脂糖凝胶电泳检测随机抽取的20个HIF3A基因扩增产物的Alw44I酶切结果。其中M泳道为标准分子量Marker。泳道11、15、20为GG型个体；泳道1、2、3、4、7、9、10、12、13、14、16、17、18、19 为 AG 型个体；泳道 5、6、8 为 GG 型个体。图3是本发明扩增的HIF3A基因部分DNA序列中突变位置的克隆测序峰图。箭头所指位置即为碱基突变位置。图4是实施例中PCR扩增产物的2%琼脂糖凝胶检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1_22为被检测的PCR产物。图5是实施例中酶切反应产物的2%琼脂糖凝胶检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1_22为22个被检测的酶切产物。泳道7、15、17为CC型个体；泳道1、2、
3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、16、18、19、21 为 CG 型个体；泳道 20,22 为 GG 型个体。
具体实施例方式为了更清楚地理解本发明，用具体实施方式
详细描述具体内容。本发明以提取的牛基因组DNA为模板，设计特异性引物一对，克隆牛HIF3A基因的部分DNA序列，利用PCR-RFLP方法，使用限制性内切酶Alw44I对PCR扩增反应产物进行酶切。将酶切结果分型并将不同基因型与超数排卵性状进行关联分析，为牛的标记辅助选择提供分子标记。一、牛HIF3A基因部分DNA片段的克隆利用01igo6. O软件设计特异性引物I对，为保证良好的引物质量，在本发明中，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，扩增产物长度为379bp，引物序列如下所示HIF3A-F5，-CTGGGCAGTTGCTACTGTTCCTAT-3 ’(正向引物)HIF3A-R5，-AGTCCCGTCCAGGATTGGT-3 ’(反向引物)为较快、较好地获得良好的结果，本发明 选择Biomiga公司的2XBench Top TaqMaster mix进行PCR扩增。具体反应体系为2XMaster Mix (产品包装盒内提供，其中含Taq DNA Polymerase O. 05 units/ μ 1,4mM MgCl2,0. 4mM dNTPs) 10. 0 μ I,正向引物与反向引物(浓度为均为IOpmol/μ I)各0·5μ 1，基因组DNA0.5y I(含10_50ngDNA)，二馏水8. 5 μ I。PCR反应条件为94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，共35个循环，72°C最后延伸5分钟。二、PCR-RFLP 方法的建立I、PCR产物的检测利用本发明设计的引物HIF3A-F和HIF3A-R对牛基因组DNA扩增得到的特异性产物，经2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图I所示，其中M泳道为标准分子量Marker，1-14泳道为被检测的14个PCR产物。2、针对牛HIF3A基因部分DNA片段PCR-RFLP诊断方法的建立利用本发明设计的特异性引物HIF3A-F和HIF3A-R扩增牛基因组DNA，得到379bp的特异扩增片段(SEQ ID N0:1)。测序结果发现，在该379bp片段中，如果第278bp处存在C — G的突变，会导致Alw44I酶切位点(G~TGCAC)的产生，其中，278_279bp间为Alw44I酶的多态性切点。PCR扩增产物经Alw44I酶切产生三种基因型，经2%琼脂糖凝胶电泳可明显判别不同带型。如图2所示，其中CC型只有379bp —条带，CG型含有379bp、278bp、IOlbp三条带，GG型有278bp和IOlbp两条带。限制性内切酶Alw44I可自行选择。本发明中为达到高效、高速的效果，选用MBIFermentas Life Science (MBI公司)的Alw44I内切酶。PCR产物酶切反应体系为16 μ 1，其中 IOXBuffer Tango [内切酶包装盒中提供，含 330mM Tris-acetate (PH7. 9), IOOmMmagnesium acetate, 660mM potassium acetate, lmg/ml BSA] I. 6 μ I, PCR 产物 5.0 μ I,限制性内切酶Alw44I I. O μ I (总量10U，内切酶包装盒中提供)，二馏水8. 4 μ 1，将样品混合均匀后37°C恒温水浴8小时。恒温水浴结束后，取10μ I酶切产物，用2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型检测结果。三、标记性状关联分析以申请人所拥有的实验群体为实验对象进行超数排卵性状测量，利用SPSS19.0软件进行不同基因型与不同个体间的性状关联分析。本发明中牛HIF3A基因的扩增序列Alw44I多态位点与牛超数排卵性状的关联分析，基因型检测结果表明，不同个体所拥有的不同超数排卵性状，包括未受精胚胎数、退化胚胎数、可用胚胎数、胚胎总数、桑葚胚数、囊胚数之间显著差异分析结果(最小二乘均值土标准误)见表I。表I不同基因型个体超数排卵性状之间显著差异分析结果超排性状CC型个体CG型个体GG型个体
未受精胚胎数O. 80 + 0. 197°I. 70 + 0. 198ob2. 23 + 0. 316b
退化胚胎数2. 03 + 0. 461°2. 75 + 0. 212ob3. 97 + 0. 491
可用胚胎数7. 95 + 0. 728°8. 03 + 0. 488°10. 12 + 1. 025°
胚胎总数10. 78+1. 036°12. 44 + 0. 551°16. 32 + 1. 225
桑葚胚数7. 00 + 0. 618°7. 70 + 0. 459°9. 87+1. 059b
囊胚数O. 35 + 0. 3770.41+0.0770.45 + 0. 147
注肩标带有不同字母表示差异显著(P < O. 05);带有不同大写字母表示差异极显著(P < O. 01)。分析结果表明，此酶切位点不同基因型所对应的个体的一些超数排卵性状存在显著或极显著的差异。GG型个体的超数排卵性状普遍优于CC型个体，虽然在未受精胚胎数和退化胚胎数两方面存在着负面效应，但是对于胚胎生产来说，可以获得更多的桑葚胚和囊胚更具有实际应用价值。因此，在选定被超数排卵的个体时，选择GG型个体将有利于获得更多的可用胚胎。实施例在吉林黑毛牛业有限公司的母牛群体中随机选定22个经过超数排卵处理的健康个体。采集血液进行基因组DNA提取。利用本发明设计的引物、PCR反应体系和条件进行PCR扩增。取ΙΟ.Ομ I的2XMaster Mix，正向引物与反向引物(浓度为均为IOpmol/μ I)各 O. 5μ 1，基因组 DNA 0·5μ I(含 10-50ngDNA)，二馏水 8·5μ I。PCR 反应条件为94°C 预变性5分钟，94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，共35个循环，72°C最后延伸5分钟。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示为特异性PCR产物。如图4所示，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1_22为被检测的PCR产物。将PCR产物按本发明设计的RFLP方法进行酶切反应。PCR产物酶切反应体系为16μ 1，其中IOXBuffer Tango1.6μ 1，PCR产物5. 0μ 1，限制性内切酶Alw44I I. O μ 1，二馏水8. 4 μ 1，将样品混合均匀后37°C恒温水浴8小时。为提高酶切反应效率，可每隔I小时将反应管取出，将部分蒸发的液体轻甩到管底部。恒温水浴结束后，取IOy I酶切产物，用2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。如图5所示，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1-22为被检测的酶切产物。泳道
7、15、17 为 CC 型个体；泳道1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、16、18、19、21 为 CG 型个体；泳道20、22为GG型个体。以此22个实验样本为实验对象进行性状关联分析，利用SPSS19. O软件进行不同基因型与不同个体间的性状关联分析。基因型检测结果表明，不同基因型所对应的个体之间的超数排卵均值的显著性差异分析结果(最小二乘值和标准误)见表4。表2不同基因型个体剪切力之间显著差异分析结果
权利要求
1.一对用于鉴定牛低氧诱导因子3d (HIF3A)基因片段的特异性引物，其特征在于，所述引物的序列如下 CCR9-F5，-CTGGGCAGTTGCTACTGTTCCTAT-3 ’(正向引物) CCR9-R5，-AGTCCCGTCCAGGATTGGT-3 ’(反向引物)
2.权利要求I所述的引物在牛优良超数排卵性状表及辅助选择中的应用。
全文摘要
本发明属于动物基因工程技术领域，是一种利用特定引物对牛优良超数排卵性状相关基因HIF3α基因片段的克隆以及其在牛标记辅助选择中的应用。所获得的HIF3α基因片段的核苷酸序列长度为379bp。在此片段的第278bp处存在有一个A→G的碱基突变，导致Alw44I-RFLP酶切多态性的产生。将此突变位点作为一个分子标记，使用限制性内切酶Alw44I检测此突变位点，并将检测结果与牛优良超数排卵性状相关联。分析结果表明，具有不同基因型的个体的超数排卵性能有显著的差异。本发明的特点在于利用特定引物获得与牛优良超数排卵性状相关的HIF3α基因部分片段，并利用PCR-RFLP方法对该片段进行多态性分析，为牛的标记辅助选择提供分子标记及其应用。
文档编号C12Q1/68GK102719545SQ20121021965
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月29日 优先权日2012年6月29日
发明者余文莉, 俞先锋, 姜昊, 张嘉保, 张国梁, 李树静, 袁宝, 贾丽坤, 邓琼, 陈承祯 申请人:北京安伯胚胎生物技术中心, 吉林大学, 吉林黑毛牛业有限公司