专利名称：中国荷斯坦奶牛lhcgr基因作为分子标记的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及家畜具有突变位点的基因作为分子标记的应用，尤其涉及中国荷斯坦奶牛LHCGR基因作为分子标记在选育超数排卵奶牛中的应用。
背景技术：
目前，在奶牛育种中的传统选择方法大多是基于个体的表型记录值，通过分析个体本身及其亲属的表型数据去评估该个体在某个性状上所具有的遗传优势。最近在对中国荷斯坦奶牛超数排卵性状进行分子标记辅助选择的研究中分别有Ke-Qiong Tang等 (2010)和mi-CaiYang等Q010)把基因INHA和FSHR作为超数排卵性状的分子标记。由于传统的选择方法要等到个体生长到性成熟或之后才能获得超数排卵的数据， 这样世代间隔较长，遗传育种的选择速度也就较慢。超数排卵是一个数量性状，它除了受环境影响外，主要由多个基因控制，筛选出越多的相关基因越有利于选择的准确度和提高选择强度，但现在报道的仅有基因FSHR和 INHA两个基因的突变与之相关。
发明内容
本发明的目的是提供一种中国荷斯坦奶牛LHCGR基因作为分子标记的应用。中国荷斯坦奶牛 LHCGR基因存在 Reference SNP Cluster R印ort :rs41256848 位点，当该位点纯合为“G”时，表现出超数排卵的优势。以此作为分子标记用于中国荷斯坦奶牛的辅助育种。本发明的另一个目的是提供一种选育超数排卵的中国荷斯坦奶牛的方法。本发明所提供的选育超数排卵的中国荷斯坦奶牛的方法，是检测待测中国荷斯坦奶牛LHCGR基因Reference SNP Cluster R印ort :rs41256848位点，确定待测中国荷斯坦奶牛LHCGR基因为GT、GG或TT型，以LHCGR基因为GG型的中国荷斯坦奶牛进行育种，获得较好超数排卵性状的中国荷斯坦奶牛；所述GG型为LHCGR基因ReferenceSNP Cluster Report :rs41256848 位点是纯合 G ；所述 TT 型为 LHCGR 基因 Reference SNP Cluster Report :rs41256848 位点是纯合 T ；所述 GT 型为 LHCGR 基因 Reference SNP Cluster Report :rs41256848 位点是杂合 T/G。本发明选育超数排卵的中国荷斯坦奶牛的方法，可以通过提取中国荷斯坦奶牛基因组 DNA，克隆 LHCGR 基因或包含 LHCGR 基因 Reference SNP Cluster Report :rs41256848 位点的部分片段，然后对该LHCGR基因或所述部分片段进行单链构象多态性检测或进行测序实现。上述部分片段是以中国荷斯坦奶牛基因组DNA为模板，SEQ IDNo. 1和2所示的DNA 分子为引物对，进行PCR扩增获得的。上述单链构象多态性(SSCP)检测中，LHCGR基因GG型为凝胶电泳显示有两条带， LHCGR基因TT型为凝胶电泳显示有两条带，LHCGR基因GG型的两条带在电泳过程中泳动速度小于LHCGR基因TT型的两条带；LHCGR基因TG型为凝胶电泳显示有四条带。本发明的再一个目的是提供一种选育超数排卵的中国荷斯坦奶牛的引物对及专用试齐U盒。本发明选育超数排卵的中国荷斯坦奶牛的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No. 1和 2所示。本发明的选育超数排卵的中国荷斯坦奶牛的专用试剂盒，含有上述的引物对。除了上述引物对外，该试剂盒还可以含有进行PCR所需要的试剂，该试剂包括Taq DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液、变性溶液等。本发明通过对中国荷斯坦奶牛LHCGR基因进行分型，并将该分型与超数排卵性状进行相关性分析，确定中国荷斯坦奶牛超数排卵相关基因LHCGR基因可以作为分子标记选育出超数排卵的中国荷斯坦奶牛。本发明以分子标记辅助选择进行育种，可缩短世代间隔， 提高育种进程。另外还可结合与奶牛超数排卵性状相关的其他分子标记位点，使得对奶牛选择更加精确。
图1不同个体PCR产物SSCP分析结果。图2三种基因型测序图谱。图2中A、B、C分别代表GT、GG、TT三种带型的测序图谱。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1用基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)从牛血液中提取奶牛基因组 DNA。奶牛LHCGR基因部分片段克隆(1)引物设计以牛基因组DNA(NCBI中gene数据库ID :281900)为模板，利用 Primer 5. 0设计特异性引物1对正向引物为5，-GCTCTACCTGCTGCTCAT-3，，反向引物为5，-TAATTGCTGACACCCACA-3，。O)PCR反应体系及扩增条件PCR反应总体系为20μ 1，其中正、反向引物各ΙΟρΜ， dNTP为4μΜ，10 X PCR缓冲液(Mg2+plus) 2 μ 1，0. 5单位的Taq DNA聚合酶(宝生物工程有限公司)，基因组DNA50ng。PCR反应程序为95°C预变性5min，然后35个循环，每个循环包括 95°C变性30s，57°C退火30s，72°C延伸30s，最后循环外72°C延伸5min。PCR产物(297bp) 用琼脂糖凝胶电泳检测。对扩增的片段进行SSCP分型3μ1的PCR产物与8μ 1变性溶液(95%甲酰胺，25mM EDTA，0. 025 % 二甲苯青和0.025 %溴酚蓝)混合，然后在PCR仪上98 °C孵育lOmin，立刻放到冰上获得变性的DNA。变性的DNA进行13 %聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)8-10h(120V)。凝胶用0. 1 %硝酸银进行染色。对不同带型进行统计。对SSCP结果中不同带型的DNA进行测序及数据库比对。
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分析北京奶牛中心4个良种场共114头荷斯坦小母牛的LHCGR突变与超数排卵性状之间的关系，用PASW Statistic 18中的一般线性模型(GLM)进行关联分析。研究发现在该群体中扩增的LHCGR片段进行SSCP分型后共有三种带型(参见图 1)，分别命名为GG (有两条带)、TT (有两条带)、TG (有四条带)，GG型的两条带在电泳过程中泳动速度小于TT型的两条带。对三种带型的PCR产物分别进行测序(参见图幻，图2 中A、B、C分别为GT、GG、TT三种带型的测序图谱。GG带型LHCGR基因自5 ‘末端第62551 位的核苷酸残基为G的纯合体；TT带型LHCGR基因自5'末端第62551位的核苷酸残基为T的纯合体；GT带型LHCGR基因自5'末端第62551位的核苷酸残基为T/G的杂合体。 把测序结果和NCBI中SNP数据库进行比对，发现该位点为已知突变位点(Reference SNP Cluster Report :rs41256848)。因此该SNP位点优势等位基因G可作为奶牛超数排卵性状的分子标记。对这三种带型在群体中的分布进行统计，并和超数排卵性状进行相关性分析见表 1。表1.三种基因型在群体中的个体数及与超数排卵性状之间的关系
GG(17)GT(56)TT(41)P value
TNO10.989±1.517a10.287±0.889a7.036±1.057b0.020NTE6.615±1.020a4.262±0.686c3.246±0.836c0.008NUO1.518±0.8263.445±0.5552.479±0.6770.046
NDE2.175±0.8662.086±0.5821.434±0.7100.557表1中a，b，c同行数据标有不同字母者差异显著(ρ < 0. 05)。TNO 获得总卵数； NTE 可移植胚胎数；NUO 未受精卵数；NDE 变性胚胎数。综上所述，GG基因型个体在获得总卵数方面显著高于TT基因型个体，在可移植胚胎数方面显著高于GT和TT基因型个体。通过SSCP检测对奶牛基因组LHCGR基因分型，选择GG基因型个体可选育出超数排卵的奶牛个体。另外可结合与奶牛超数排卵性状相关的其他分子标记位点，使得对奶牛选择更加精确，作为奶牛超数排卵的分子标记辅助选择比传统的遗传选择可加大选择强度，缩短世代间隔，提高育种进程。
权利要求
1.中国荷斯坦奶牛LHCGR基因作为分子标记在选育超数排卵奶牛中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述LHCGR基因存在ReferenceSNP Cluster Report :rs41256848位点，该SNP位点纯合体为G时表现出超数排卵的优势。
3.选育超数排卵的中国荷斯坦奶牛的方法，是检测待测中国荷斯坦奶牛LHCGR基因 Reference SNP Cluster Report :rs41256848位点，确定待测中国荷斯坦奶牛LHCGR基因为 GT、GG或TT型，以LHCGR基因为GG型的中国荷斯坦奶牛进行育种，获得较好超数排卵性状的中国荷斯坦奶牛；所述 GG 型为 LHCGR 基因 Reference SNP ClusterReport :rs41256848 位点是纯合 G ；所述 TT 型为 LHCGR 基因 ReferenceSNP Cluster Report :rs41256848 位点是纯合 T ；所述 GT 型为 LHCGR 基因 Reference SNP Cluster Report :rs41256848 位点是杂合 T/G。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于包括如下步骤提取中国荷斯坦奶牛基因组 DNA，克隆 LHCGR 基因或包含 LHCGR 基因 Reference SNP Cluster Report :rs41256848 位点的部分片段，然后对该LHCGR基因或所述部分片段进行单链构象多态性检测或进行测序。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述部分片段是以中国荷斯坦奶牛基因组 DNA为模板，SEQ ID No. 1和2所示的DNA分子为引物对，进行PCR扩增获得的。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述单链构象多态性检测中，LHCGR基因 GG型为凝胶电泳显示有两条带，LHCGR基因TT型为凝胶电泳显示有两条带，所述LHCGR基因GG型的两条带在电泳过程中泳动速度小于所述LHCGR基因TT型的两条带；LHCGR基因 TG型为凝胶电泳显示有四条带。
7.选育超数排卵的中国荷斯坦奶牛的引物对，其特征在于其核苷酸序列如SEQID No. 1和2所示。
8.选育超数排卵的中国荷斯坦奶牛的专用试剂盒，其特征在于含有权利要求7所述的引物对。
全文摘要
本发明涉及一种中国荷斯坦奶牛LHCGR基因作为分子标记的应用。中国荷斯坦奶牛LHCGR基因存在Reference SNP ClusterReportrs41256848位点，当该位点纯合为“G”时，表现出超数排卵的优势。以此作为分子标记用于中国荷斯坦奶牛的辅助育种，可缩短世代间隔，提高育种进程。
文档编号C12Q1/68GK102168136SQ20111003635
公开日2011年8月31日 申请日期2011年2月11日 优先权日2011年2月11日
发明者于勇, 田见晖 申请人:中国农业大学