专利名称：一种甲型h1亚型流感病毒双抗体夹心elisa试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物病毒学与动物传染病学检测技术领域。具体地说，本发明涉及一种甲型Hl亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测试剂盒及其在猪群中甲型Hl亚型流感病毒抗原检测的应用。
背景技术：
1975年,Kohler G和Milstein C在Nature杂志上发表了细胞融合法建立杂交瘤技术，创建了具有划时代意义的杂交瘤单克隆抗体技术。经克隆后产生结构和各种特性完 全相同的高纯度抗体，称为单克隆抗体(Monoclonal Antibody, McAb),简称单抗。单克隆抗体技术的发现和使用，对现代生命科学研究的发展起到了巨大的推动作用，已经成为生物技术领域的一个重要方面。迄今，该技术的应用已经广泛应用于基础研究、疾病诊断、治疗、预防等方面。2009年6月世界卫生组织宣布对甲型(HlNl)流感的警戒级别升至6级，意味着甲型(HlNl)流感的世界性大流行已形成。最近一次流感的世界性大流行起源于墨西哥，一开始被称为猪流感(Swine flu)，后根据病毒的分析，改称为猪源性流感病毒感染(swineorigin influenza virus infection,简称 S-0IV infection),最后为了与人的季节性流感A(HlNl)区别，改称新流感A(HlNl)，在我国则称为甲型HlNl流感。甲型HlNl流感对人及动物的健康造成巨大的影响，而且对经济造成了巨大的损失。1971年瑞典的Engvall等人分别以纤维素和聚丙乙烯试管作为固相载体吸附抗原/抗体，建立了酶联免疫吸附法(Enzyme Linked ImmunosrbentAssay,简称ELISA方法)。1974年Voller等人改用聚苯乙烯微量反应板作为固相免疫吸附载体，使ELISA方法得以推广应用，使得用于抗原定位的酶标记抗体技术发展成为液体标本中微量物质的测定方法，并逐渐成为抗原抗体检测中最为常用的一种方法。它将酶标记物同抗原抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用相结合，既保持了酶催化反应的敏感性，又保持了抗原抗体反应的特异性，因而极大的提高了灵敏度。同时它又是一种非均相免疫分析方法，即在反应的每一步都有洗涤过程，从而除去了未反应物和干扰物质。由于ELISA方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便、检测迅速和非放射性以及可以批量测定等诸多优点，使得ELISA方法得到了越来越广泛的应用。(焦奎等.酶联免疫分析技术及应用[M].北京化学工业出版社，2004，84 141;李文敏.酶联免疫吸附反应的技术进展及应用[J].湖北职业技术学院学报，2003，4 (6) 65 69)酶标记抗体技术是ELISA检测方法的关键技术，本发明中所用的酶标记抗体是本实验室自行生产抗甲型Hl亚型流感病毒血凝素单克隆抗体，经过辣根过氧化物酶(简称HRP)标记，具有很高的酶活性，产量高及成本低。
发明内容
本发的的主要目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种甲型Hl亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测试剂盒，以解决猪群中甲型Hl亚型流感病毒抗原的检测。本发明的第一个目的是得到一种特异性强的可用于组装ELISA试剂盒的核心试剂的抗甲型Hl亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体。本发明的第二个目的是建立一种甲型Hl亚型流感病毒的双抗体夹心ELISA检测方法
本发明的第三个目的是组装一种甲型Hl亚型流感病毒的双抗体夹心ELISA检测试剂盒。本发明的第四个目的是利用该试剂盒在猪群甲型Hl亚型流感病毒抗原检测中的应用。本发明是这样实现的申请人:所在的华中农业大学农业微生物国家重点实验室病毒室从猪群中分离得到的一株甲型Hl亚型流感病毒A-Influ/JML-F9原毒株，该毒株于2011年I月27日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:V201105。申请人:制备了一种特异性强的单克隆抗体，它是抗甲型Hl亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白的单克隆抗体，分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株5F7，于2011年I月27日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCCNO C201106o申请人:利用所述的单克隆抗体制备成双抗体夹心ELISA核心试剂，组装了一种用于快速检测适用于猪群的甲型Hl亚型流感病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒。本发明的试剂盒是由盒体和包含在盒体内的样品稀释液、洗涤液、底物A液、底物B液、终止液，阳性对照样品和阴性对照样品组成。更详细的技术方案如下所述。抗甲型Hl亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体的制备，它包括下列步骤I)以从猪群中分离得到的一株保藏编号为CCTCC NO V201105的甲型Hl亚型流感病毒A-Influ/JML-F9为抗原，经过扩增、灭活和纯化，对5_8周龄BALB/c小鼠(购自湖北省实验动物研究中心)进行免疫。2)细胞融合，取经加强免疫后的BALB/c小鼠(购自湖北省实验动物研究中心)的脾脏，与新鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞(购自卫生部武汉生物制品所)融合。3)利用血凝抑制法(HI)(肖金晖等.RT-PCR法与血凝抑制法鉴定流感病毒的比较[J].中国热带医学，2005，5 :401 402)，筛选出分泌抗甲型Hl亚型亚型流感病毒血凝素(HA)抗体的阳性孔。对筛选出来的阳性孔立刻用有限稀释法(但汉并等.H5亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及鉴定[J].动物医学进展，2006，27 (8) :67 69)进行克隆、筛选。经过3 5次克隆纯化，最终筛选出分泌抗甲型Hl亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞株(保藏编号为CCTCC NO C201106)。4)腹水的制备，取雌5-6周龄BABL/c小鼠(购自湖北省实验动物研究中心)腹腔注射弗氏完全佐剂O. 5ml/只，5天后腹腔注射I X IO6个杂交瘤细胞/只，9天后收取腹水，血凝抑制(HI)法检测腹水效价，_70°C保存。5)将保藏编号为CCTCC NO C201106单克隆抗体进行纯化和标记。
上述抗体(保藏编号为CCTCC NO C201106)经过纯化和标记后可用于制备检测甲型Hl亚型流感病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒。与现有技术相比本发明具有如下显著优点I、本发明的试剂盒能直接对甲型Hl亚型流感病毒进行检测，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短，检测样品范围宽(鸡胚尿囊液、内脏组织匀浆液)的特点。2、本发明的试剂盒适用于对甲型Hl亚型猪流感病毒进行检测，对经典Hl亚型猪流感病毒不反应，具有特异性。3、本发明的试剂盒适用于对甲型Hl亚型流感病毒进行检测，而对其它亚型的流感病毒，如经典Hl亚型、H3亚型、H5亚型、H9亚型的流感病毒，则不反应，具有很好的特异性。4、本发明将所需的各种试剂组装成试剂盒，操作简单易行，不需由专业人员操作。本发明的试剂盒稳定性好、保存期长，在4°C条件下放置半年不会影响其敏感性。5、本发明一次能同时处理多个样本，非常适合甲型Hl亚型猪流感病毒的临床大规模检测。并能够满足试验要求，也可作为科研使用。6、目前市场上还没有检测甲型Hl亚型猪流感病毒抗原(北美流感)的试剂盒。也无区分甲型Hl亚型猪流感病毒(北美流感)和经典Hl亚型流感病毒的鉴别诊断试剂盒。
图I :是本发明总体技术路线图。图2 :是SP2/0细胞染色体计数。图3 :5F7杂交瘤细胞染色体计数。图4 :抗甲型Hl亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白单克隆抗体间接免疫荧光检测图。其中图4A :为抗甲型Hl亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白单克隆抗体间接免疫荧光检测图；图4B为阴性对照
具体实施例方式实施例I制备实施例一、甲型Hl亚型流感病毒的分离I、分离过程用灭菌的咽拭子采集病猪咽喉样本，置于灭菌磷酸盐缓冲液(简称PBS，配方Na2CO3 I. 59g, NaHCO3 2. 93g，用ddH20定容至1000ml)中，随后将咽拭子样本液O. 2ml接种9日龄无特定病原体(Specific pathogen Free, SPF)鸡胚(购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司)，置35°C下孵育72h，收货尿囊液做血凝定性试验，血凝试验为阳性的样本，再经过RT-PCR试验定型。2、鉴定依据=RT-PCR检测为阳性的样本，扩增HA，送上海生工生物工程有限公司测序，对所得DNA序列与网上公布的序列(http://blast, ncbi. nlm. nih. rov/)进行比对，以确定病毒亚型。 3、甲型Hl亚型流感病毒株的病毒学特征经过的HA-DNA序列比对，得出与北美流感HA-DNA核酸同源达99. 2 %，氨基酸同源达99. O %，因此确实了我们获得的流感病毒为甲型Hl亚型流感病毒。
4、专利程序的保藏将鉴定后得到的得甲型Hl亚型流感病毒A-Influ/JML_F9送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO V201105o二、甲型Hl亚型流感病毒(保藏编号为CCTCC NO V201105)的扩增、灭活及纯化I、将保藏编号为CCTCC NO V201105的甲型Hl亚型流感病毒A-Influ/JML-F9进行扩增；(I)严格筛选9 10日龄无特定病原体(Specific pathogen Free, SPF)鸡胚(购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司)
每批送过来的鸡胚要经过严格筛选。外检共4项白壳、大小、破损及脏胚，内检共9项去除沙壳、偏气室、游气室、倒置胚、无精蛋、终止胚、弱胚、污染胚、裂缝胚。(2)接种病毒(A-Influ/JML_F9)于鸡胚尿囊腔选用9 10日龄无特定病原体(Specific pathogen Free, SPF)鸡胚(购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司)，画出气室和胚位，在气室接近胚位处涂抹碘酊和酒精进行消毒，用钢锥穿一小孔，随后将Iml注射器针头沿此小孔插入(避开血管)，接种甲型Hl亚型流感病毒(A-Influ/JML-F9)。最后用石蜡封口，并置35°C下孵育72h。每天检查鸡胚生长情况，每12h翻卵并检卵一次。24h内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡并弃去，72h收取鸡胚，4 °C下放置过夜。(3)含甲型Hl亚型流感病毒(A-Influ/JML-F9)尿囊液的收获用75%浓度的酒精消毒鸡胚气室端，用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，在绒毛尿囊膜无大血管处穿破。用无菌移液管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。将鸡胚收获液3000r/min离心5min去除血液和细胞。然后进行红细胞凝集实验，确定鸡胚尿囊液血凝效价。2、甲型Hl亚型流感病毒A-Inf lu/JML-F9的灭活将含病毒A-Influ/JML_F9尿囊液冻融3次后，按终浓度O. 8%的甲醛缓慢加入甲醛溶液，充分混合均匀，37°C灭活24小时，每隔6小时振摇I次。每个病毒灭活容器应立即取样，分别进行病毒灭活验证试验。灭活容器的甲型Hl亚型流感病毒的尿囊液经检定合格。8000r/min,离心lOmin。弃去沉淀,上清备用。3、甲型Hl亚型流感病毒A-Inf lu/JML-F9浓缩及纯化(I)将甲型Hl亚型流感病毒A-Influ/JML-F9进行浓缩，方法是将甲型Hl亚型流感病毒鸡胚尿囊液于27000r/min，离心2h，弃去上清，沉淀用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，充分混匀备用。 (2)甲型Hl亚型流感病毒A-Influ/JML-F9纯化在超速离心管中依次加入60%、45%、30%、20%浓度蔗糖溶液形成密度梯度。将重悬好的病毒A-Influ/JML_F9样品平铺于最上层，于32000r/min,离心lh。离心后取出45%、30%之间层面样品，用PBS重悬30%、45%之间层面样品取出样品，320001'/11^11，离心lh，取沉淀(即得所述的病毒A-Influ/JML-F9)进行蛋白质含量测定。以此作为免疫原。实施例2抗甲型Hl亚型流感血凝素蛋白单克隆抗体的制备I、以灭活及纯化的甲型Hl亚型流感病毒A-Influ/JML-F9原毒株(保藏在湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0V201105)为抗原，加弗氏佐剂乳化(首免选用弗氏完全佐剂，二、三免选用弗氏不完全佐剂)免疫5-8周龄BALB/c小鼠(购自湖北省实验动物研究中心)。首免剂量为20ug/只，每只小鼠颈背部皮下多点注射。二周后用相同剂量加强免疫一次，二周后再加强免疫一次，剂量为40ug/只，二周后断尾采集少量小鼠血，收集血清，用血凝抑制法检测小鼠抗体效价。待小鼠抗体达到试验要求，再经腹腔注射灭活及纯化的甲型Hl亚型流感病毒A-Inf lu/JML-F9，注射剂量为40ug/只免疫一次。三天后，即可取免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞(购自卫生部武汉生物制品所)按实验室常规方法进行融合2、细胞融合，取经过强化免疫的BALB/c小鼠(购自湖北省实验动物研究中心)一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75%浓度酒精中浸泡IOmin消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞，与新鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞(购自卫生部武汉生物制品所)按IX IO7个SP2/0与IO8个免疫细胞(个数比I : 10)的比例于50ml离心管中混匀，1500r/min，离心lOmin。弃去上清，管壁用灭菌的滤纸吸干，轻震管底，使细胞沉淀略有松动。将装有细胞混合物的离心管放置于37°C恒温水浴中。然后在Imin内慢慢滴入预温至37°C的50%聚乙二醇(PEG)O. 8ml (购自sigma公司)，边加边轻轻用吸管尖搅拌，继续搅拌lmin。然后慢慢加入预温至37°C的1640(购自sigma公司)细胞培养液40ml。融合具体步骤如下第一分钟逐滴滴入50%聚乙二醇(PEG)O. 8ml，静置O. 5min ;第二分钟加1640细胞培养液lml，静置O. 5min (重复一次)；第四分钟加I. 5ml，静置O. 5min (重复一次)；第六分钟加5ml，静置O. 5min (重复一次);第八分钟加10ml，静置O. 5min (重复一次);每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。静置lmin, 1000r/min离心IOmin,弃上清,于37°C环境中放置8min。用HAT培养基(购自Sigma公司)悬浮，同时也用HAT培养基悬浮制备好的饲养脾细胞并与融合后的细胞混合，根据需要补加适量的HAT培养基，分种于96孔培养板中，约200 μ I/孔。一次融合可接种4 8块96孔板。根据需要也可少种，一般按SP2/0的细胞数计算，每孔接种量约含IO4左右个SP2/0细胞。于37°C，5% C02培养箱中培养。融合后第二天开始观察96孔板内细胞有无污染，于第4天用HT培养基换HAT培养基100 μ I。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体效价检测。采用灭活的的甲型Hl亚型流感病毒(A-Influ/JML-F9)作为筛选抗原，利用血凝抑制法(肖金晖等.RT-PCR法与血凝抑制法鉴定流感病毒的比较[J].中国热带医学，2005，5 :401 402)筛选出分泌抗甲型Hl亚型亚型流感病毒血凝素(HA)抗体的阳性孔。对筛选出来的阳性孔立刻用有限稀释法(但汉并等.H5亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及鉴定[J].动物医学进展，2006，27 (8) :67 69)进行克隆、筛选。经过3 5次克隆纯化，最终筛选出分泌抗甲型Hl亚型亚型流感病毒血凝素(HA)抗体的单克隆杂交瘤细胞株5F7，于2011年I月27日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCCNO C201106o3、腹水的制备，选用5-6周龄雌BABL/c小鼠(购自湖北省实验动物研究中心)腹腔注射弗氏完全佐剂O. 5ml/只，5天后腹腔注射IX IO6个杂交瘤细胞/只，9天后收取腹水，血凝抑制法(HI)检测腹水效价，_70°C保存。4、腹水抗体的纯化辛酸-硫酸铵法具体步骤如下(I)将上述步骤3制备的腹水1000r/min离心IOmin,用0. 45 μ m滤膜过滤,滤液边搅拌边加入用4倍体积60mmol/L醋酸缓冲液(pH = 4. 5)；(2)边搅拌边逐滴加入正辛酸至终浓度为33μ 1/ml，室温条件下搅拌30min，8000r/min离心30min,弃沉淀收集上清；(3)将步骤⑵的上清液经滤纸过滤一次，滤液pH调制7. 4 ；(4)向步骤(3)所得的滤液边搅拌边加入饱和硫酸铵溶液(硫酸铵体积/总体积< 45% )，待滤液程白色浑浊液时，继续搅拌30min，然后于4°C静置5h。再于4°C条件12000r/min 下离心 30min ；(5)弃上清,沉淀用 IOmmol pH = 9. OTris-HCl 重悬；在 100 倍体积的 IOmmol pH=9. O的Tris-HCl中，于4°C条件下磁力搅拌透析,透析透析36h,期间3次(12h/次)更换新鲜Tris-HCl液。透析结束，取上清，用SDS-PAGE电泳的方法鉴定抗体的纯度，用紫外分光光度计测定抗体浓度，分装、冻存。上述纯化抗体试验中所用试剂按照以下配方配制醋酸缓冲液(60mmol/L)=C2H3NaO2 2. 463g，用 ddH20 定容至 500ml (pH = 4· 5)。饱和硫酸铵溶液每100ml ddH20中加(NH4)2S04 90g,加热至80°C溶解，趁热滤纸过滤，降至室温既有结晶析出，所得带有结晶滤液即为饱和硫酸铵溶液。用25%氨水调pH值至7. 2，备用。5、辣根过氧化物酶(HRP)标记单克隆抗体(保藏编号为CCTCC NO C201106)(I)取5. Omg的辣根过氧化物酶(HRP) 5. Omg溶于5ml ddH20,溶液呈棕红色；随后滴加NaIO4溶液^0mmOl/L)0. 5ml，使溶液呈草绿色，4°C条件放置30min ;滴加乙二醇溶液(160mmol/L)0. 5ml，终止氧化反应，室温下避光条件放置30min，溶液呈棕黄色；(2)取本发明制备的单克隆抗体(保藏编号为CCTCC NO C201106) 5ml (lmg/ml)与上述步骤(I)所处理好的液体混合，IOmmol pH = 9. 5碳酸盐缓冲液,4°C条件下磁力搅拌透析过夜。(3)向完成透析液体中加新鲜配制的浓度为5mg/ml的NaBH4溶液O. 2ml,于4°C下放置2h ;然后等体积加入饱和硫酸铵溶液，于4°C下静置30min，7000r/min离心lOmin，弃去上清。PB 溶液(20mmol/L pH = 7. 4,) 3ml 重悬,在 1000 倍体积的 PB (20mmol/L pH =7.4)中，4°C条件下磁力搅拌透析，透析36h，期间3次(12h/次)换液。(4)标记抗体(保藏编号为CCTCC NO C201106)完成透析后，加PB(20mmol/L pH=7. 4)、甘油(终浓度30%)定容至5ml，于-20°C保存。标记抗体试验中所用试剂按以下配方配制NaI04 溶液(60mmol/L) =NaIO4 I. 283g，用 ddH20 定容至 IOOml ；乙二醇溶液(160mmol/L):乙二醇13. 4 μ 1，用 ddH20 稀释至 I. 5ml ；碳酸盐缓冲液IOmmol pH = 9. 5 =Na2CO3 I. 59g，NaHCO3 2. 93g，用 ddH20 定容至IOOOml (pH = 9. 5)；NaBH4 溶液(5mg/ml) :NaBH40. 05g,用 ddH20 定容至 10ml,现配现用；饱和硫酸铵溶液每IOOml ddH20中加(NH4)2S04 90g,加热至80°C溶解，趁热滤纸过滤，降至室温既有结晶析出，所得带有结晶滤液即为饱和硫酸铵溶液。用25%氨水调pH值至7. 2，备用。PB 溶液(20mmol/L pH = 7. 4) =Na2HPO4 · 12H20 3. 58g, NaH2PO4 I. 56g,用 ddH20 定容至 1000ml, pH = 7. 4。实施例3抗甲型Hl亚型流感血凝素蛋白单克隆抗体(保藏编号为CCTCC NOC201106)的鉴定1、HI效价的鉴定采用本发明分离得到的甲型Hl亚型流感病毒(保藏编号为CCTCCNO V201105)作为抗原用血凝抑制法测定杂交瘤细胞培养上清及小鼠腹水的效价。结果见表I。表I :利用血凝抑制法(HI)测定杂交瘤细胞培养上清及小鼠腹水的效价
权利要求
1.一种抗甲型Hl亚型流感病毒血凝素的单克隆抗体，其特征在于，它是由保藏号为CCTCCNO V201105的甲型HlNl流感病毒A-Influ/JML_F9制备的杂交瘤细胞株所分泌的，所述的杂交瘤细胞株5F7保藏号为CCTCC NO :C201106。
2.一株抗甲型Hl亚型流感病毒血凝素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株5F7，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO :C201106。
3.包含权利要求I所述的单克隆抗体的甲型Hl亚型流感病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒。
4.一种适用于猪的甲型Hl亚型流感病毒抗原检测的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，该试剂盒由下列部分构成保藏号为CCTCC NO C201106的单克隆抗体包被的酶标板，辣根过氧化物酶标记的保藏号为CCTCC NO C201106的单克隆抗体作为酶标二抗，样品处理A液、样品处理B液、阳性对照样品、阴性对照样品、底物A液、底物B液、终止液和10倍洗涤液； 其中 所述的试剂组分及其配比如下(1)样品处理A 液的配制称取 Na2B4O7 · IOH2O 13. 3g，H3BO3 16. 08g，NaCl 8. 5g，ddH20800mL,调pH至8. 4后用蒸馏水定容至IOOOmL ;在121°C高压蒸汽下灭菌30分钟后分装，置4°C贮存；(2)样品处理B 液的配制称取 Na2B4O7 · IOH2O 13. 3g，H3BO3 16. 08g，NaCl 8. 5g，ddH20800mL，调pH值为8. 4后用蒸馏水定容至IOOOmL ;在121°C高压蒸汽下灭菌30分钟后加入5g N-乙酰-L-半胱氨酸，5mL NP-40,混匀后分装，置4°C贮存； (3)阳性对照的配制将含病毒尿囊液冻融3次后，按终浓度O.8%的甲醛缓慢加入甲醛溶液，充分混合均匀，37°C灭活24小时，每隔6小时振摇I次；加入O. 02% NaN3防腐，并作为阳性对照样品分装成O. 5mL/管，置4°C下保存； (4)阴性对照的配制收取SPF鸡胚尿囊液，4°C，12000r/min离心30min后加入O.02%NaN3防腐。分装成O. 5mL/管，置4°C下保存； (5)底物A液0.006% H2O2缓冲液；(6)底物B 液:取 Na2HP04*12H20 14. 2g，柠檬酸 10. 5g，用 ddH20 定容至 500m 配成 O. ImL磷酸盐柠檬酸缓冲液，PH5. O ;按终浓度为20mg/L添加联苯二胺； (7)终止液浓度为40%氢氟酸溶液625μ L，用ddH20定容至IOOmL ；(8)10 倍洗涤液NaCl 80g, KCl 2g, Na2HPO4 · 12H20 29g, KH2PO4 2g, Tween-20 5mL，用ddH20 定容至 lOOOmL，pH7. 4。
5.一种适用于猪的甲型Hl亚型流感病毒抗原检测的双抗体夹心ELISA方法，包括制备保藏号为CCTCC NO C201106的单克隆抗体包被的酶标板，辣根过氧化物酶标记的保藏号为CCTCC NO C201106的单克隆抗体，样品处理A液、样品处理B液、阳性对照样本、阴性对照样本、底物A液、底物B液、终止液和10倍洗涤液，其步骤包括 (1)以保藏号为CCTCCNO V201105的甲型HlNl流感病毒A-Inf lu/JML_F9，作为免疫原； (2)用步骤(I)的免疫原制备得到保藏号为CCTCCNO C201106的单克隆抗体； (3)用步骤(2)所述的单克隆抗体包被酶标板作为一抗；(4)将待检测样品用样品处理液进行处理得到待检测物； (5)用辣根过氧化物酶标记的保藏号为CCTCCNO C201106的单克隆抗体作为二抗； (6)对步骤(4)所述的待检测物进行检测，于酶标仪上读取630纳米处的吸光光度值；其中各试剂的组分及配制如下10 倍洗涤液NaCl 80g, KCl 2g，Na2HPO4 · 12H20 29g, KH2PO4 2g, Tween-20 5mL，用ddH20 定容至 IOOOmL ；样品处理 A 液称取 Na2B4O7 · IOH2O 13. 3g, H3BO3 16. 08g, NaCl 8. 5g, ddH20 800mL，调pH值为8. 4后用蒸馏水定容至IOOOmL ;在121 °C高压蒸汽下灭菌后分装，置4°C贮存，用于处理内脏组织； 样品处理 B 液称取 Na2B4O7 · IOH2O 13. 3g, H3BO3 16. 08g, NaCl 8. 5g, ddH20 800mL，调pH值为8. 4后用蒸馏水定容至IOOOmL ;在121 °C高压蒸汽下灭菌后加入5g N-乙酰-L-半胱氨酸，5mLNP-40,混匀后分装，置4°C贮存，用于处理喉头拭子。
底物A液0. 006% H2O2缓冲液；底物 B 液-M Na2HPO4 · 12H20 14. 2g，柠檬酸 10. 5g，用 ddH20 定容至 500m 配成 O. ImL 磷酸盐柠檬酸缓冲液，PH5. O,按终浓度为20mg/L添加联苯二胺； 终止液浓度为40%氢氟酸溶液625 μ L，用ddH20定容至100mL。
6.权利要求I所述的甲型HlNl流感病毒A-Influ/JML-F9，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO :V201105。
7.权利要求I所述的单克隆抗体在制备甲型Hl亚型流感病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒中的应用。
8.权利要求3或4所述的试剂盒在甲型Hl亚型流感病毒抗原体外检测中的应用。
全文摘要
本发明属于动物病毒学与动物传染病学检测技术领域。具体涉及一种甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测试剂盒及应用。本发明试剂盒包括抗甲型H1亚型流感病毒血凝素的保藏号为CCTCC C201106的单克隆抗体包被的酶标板，辣根过氧化物酶标记甲型H1亚型流感病毒血凝素单克隆抗体为二抗。公开了甲型H1亚型流感病毒的分离、扩增、灭活和纯化方法及甲型H1亚型流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及纯化方法。还公开了甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法。
文档编号C12N7/00GK102633878SQ20111003616
公开日2012年8月15日 申请日期2011年2月11日 优先权日2011年2月11日
发明者但汉并, 周洪波, 张安定, 王灿, 赵刚, 郭学波, 金梅林 申请人:华中农业大学