专利名称：一种线粒体突变检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因突变检测，更具体的说，检测一种与药物性耳聋有关的人类线粒体核糖体RNAA1555G，C1494T的突变。
背景技术：
链霉素、庆大霉素、卡那霉素、西索米星、妥布霉素、阿米卡星、奈替米星等氨基糖甙类药物因其对革兰氏阴性细菌的感染特别有效，同时对于某些革兰氏阳性细菌也有协同抗菌作用，成为临床应用最广泛的抗生素之一，但是，该类药物具有严重的耳毒性副作用， 使用时可能会造成听力不可逆转的损伤，甚至是“一针致聋”。这种易感性通常是母系遗传的，这表明其可能的发病机制与线粒体 DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)有关，位于线粒体12S rRNA基因的突变是造成听力下降的重要原因之一。在已经发现的多个12S rRNA基因突变位点中，位于12S rRNA高度保守的解码区的A1555G和C1494T同质性突变位点是与药物性耳聋相关性最高的两个位点，这两个突变点是导致绝大多数氨基糖甙类抗生素中毒性耳聋的主要原因。即当1555位点由A 突变为G或1494位点由C突变为T后，突变的携带者在使用氨基糖甙类抗生素后，导致耳聋的风险非常高。通过基因突变检测，发现A1555G和C1494T两个突变位点的携带者，避免使用该类药物，从而可以预防耳聋的发生。对于该突变的检测，除了直接测序法外，就是酶切序列分析和Taqman探针法，但这些方法不是费用较高就是操作繁琐、周期长，针对这些问题，我们设计了一种简单、快速、 价格低廉的检测方法，以用于临床检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单、快速而准确的线粒体突变检测的方法及试剂盒。本发明所提供的方法包括以下步骤针对1494T和1555G突变位点设计相应的引物，引物3’端末端碱基与突变型碱基完全匹配，而与野生型碱基错配；体系中另设计一对内质控引物；同时设计所有扩增产物的Tm值为不同的温度，为调整扩增产物的Tm值，可通过在引物5’端增加高GC含量的无关序列来实现。最后通过染料法荧光PCR，在一管中进行多重PCR扩增，然后进行熔解曲线分析，通过是否有特定温度下的熔解峰来判断有无突变发生。本发明另一目的是提供A1555G和C1494T突变检测试剂盒所述试剂盒可包含有如下部分1)核酸DNA提取试剂2)扩增反应试剂，包括taq聚合酶、PCR缓冲液、Mg2+、dNTP及引物。3)阴性对照品4)说明书
所述引物有5条引物，它们的序列分别是序列表中序列1、序列2、序列3、序列4和序列5。本发明通过不同PCR产物的熔解峰Tm值不同，从而实现不同位点的区分，能简单、 快速、准确的实现线粒体12rRNA基因突变的检测。本发明与现有技术相比优点如下本发明提供的方法和测序法与酶切法相比，操作简单、时间短、成本低廉，无需开盖操作，有效避免污染；和taqman探针法相比，能在一管中实现两个位点的检测，仪器要求低、成本低廉，结果判读容易。
图1、A1555G突变基因组模板检测结果，只有1555位置和质控位置出现熔解峰。图2、C1494T突变基因组模板检测结果，只有1494位置和质控位置出现熔解峰。图3、1555A和1494C野生型基因组模板，只有质控位置出现熔解峰。图4、未加任何基因组模板，未出现任何的熔解峰。
具体实施例方式下面以氨基糖苷类药物基因突变1555A_>G和1494C_>T检测为例，阐述本发明方案。设计扩增引物，以人基因组为模板进行扩增，其中内标质控峰Tm值为77.9°C，如果在 83. 6°C有熔解峰，则模板中含有1494T突变，如果在80. 5°C有熔解峰，则模板中含有1555G 突变，仅有质控峰，模板为野生型。实施例1、引物设计1. 1以人线粒体基因组核酸序列(NCBI数据库序列NC_012920)为模板，设计 1555A->G和1494C->T突变型引物，使引物的3，末端分别与1555G和1494T突变型完全匹配，而与野生型不匹配，同时设计与这两条引物共用的一条上游引物。1. 2为了使两者扩增产物的Tm值能在溶解曲线上进行区分，在1494位点引物的 5’增加高GC含量的序列。1. 3为了保证每个检测的有效性，设计了一对质控引物，同时确保产物Tm值均能在熔解曲线上与其他两个检测峰进行区分。1494 下游引物GCGGGCAGGGCGGCCTTTGAAGTATACTTGAGGAGA (序列 1)，位于核酸序列1494-1514pb之间，序列中斜体部分为增加的高GC含量序列。1555 下游引物CACTTACCATGTTACGACTTGC(序列 2)，位于核酸序列 1555_1576pb 之间。公用上游序列CCTGAAGCGCGTACACAC (序列3)，位于核酸序列1466_1485pb之间。质控上游序列ATTCTCGCACGGACTACAAC (序列4)，位于核酸序列14675_14694pb之间。 质控下游序列GTATTGGGGTCATTGGTGTT (序列5)，位于核酸序列14740_14759pb之间。所有引物均由生工生物(上海)有限公司合成(PAGE纯)；PCR扩增模板为301医院提供的1494、1555突变型及野生型核酸。
反应体系如下2X syber green反应液(AB公司)10 μ 1，1494下游引物 (10 μ Μ) 0.2 μ 1，1555下游引物(10 μ Μ) 0. 2 μ 1，公用上游引物(10μΜ)0. 2μ 1，质控上游引物(10μΜ)0· 3μ 1，质控下游引物(10μΜ)0. 3μ 1，模板 2μ 1，H2O 6· 8μ 1。其中各个反应管中模板浓度均为IOng/μ 1，NTC以双蒸水为模板。反应在AB 7500上进行。反应程序如下首先是扩增过程，程序如下95 °C IOmin ；然后95 °C 15sec, 58 °C 20sec，72°C 20sec，40 个循环。接着为熔解曲线过程95 °C 10sec，72°C IOsec, 95°C lOsec。结果表明，反应各管均出现特异性扩增，各PCR产物的Tm值之间均能很好的进行区分，第一个管中出现83.6°C和77.9°C的熔解峰，分别为1494T和质控峰(图1)；第二管中出现80. 5°C和77.9°C的熔解峰，分别为1555G和质控峰(图幻；第三管中仅出现77. 9°C 的质控峰(图3) ；NTC管则无任何熔解峰的出现(图4)。所有检测结果均与所测标本的真实结果一致，从而验证了本方法是准确有效的。
权利要求
1.一种检测人线粒体12SrRNA基因C1494T和A1555G突变的方法，其特征在于以人基因组核酸为模板，用针对C1494T和A1555G突变型的引物组及内质控引物组进行多重PCR 扩增，然后进行溶解曲线分析，通过有无特定温度的熔解峰来判断有无突变。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于设计引物时，各PCR扩增产物的Tm之间有明显的不同，以便在熔解曲线分析中得以区分。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于设计的引物5’端可加入高GC含量的无关序列，以调整相应扩增产物的Tm值。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于该方法中使用5条引物，它们的序列分别为序列表中序列1、序列2、序列3、序列4和序列5所示。
5.一种检测线粒体12SrRNA基因C1494T和A1555G突变的试剂盒，所述试剂盒包括核酸DNA提取试剂、阴性对照品、扩增反应试剂及说明书，其特征在于扩增反应试剂包括taq 聚合酶、PCR缓冲液、Mg2+、dNTP及引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述引物有5条引物，它们的序列分别为序列表中序列1、序列2、序列3、序列4和序列5所示。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于核酸提取液含w/v为5^Wchelex100 溶液。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于阴性对照品为不含线粒体核酸的溶液。
全文摘要
本发明公开了一种线粒体突变检测方法及试剂盒，所述方法为检测1494T和1555G突变的方法，所用引物有5条，分别为引物序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4和序列5，用所述引物进行多重PCR扩增，进行熔解曲线分析，通过特定温度的熔解峰来判断是否有相应的突变发生，同时还公开了一种专用的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK102154481SQ201110035820
公开日2011年8月17日 申请日期2011年2月11日 优先权日2011年2月11日
发明者不公告发明人 申请人:智海生物工程(北京)有限公司