专利名称：一种用于检测猪瘟病毒的试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及猪瘟病毒的检测方法，具体说是一种RT-PCR —步法用于检测猪瘟病 毒的试剂盒，本发明还包括该试剂盒的检测方法。
背景技术：
古典猪瘟(Classical swine fever，CSF)简称猪瘟，是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的猪的急性、烈性、接触性传染病，我国是猪瘟严重的流行 国家之一，每年因猪瘟造成的直接经济损失有数十亿元，严重威胁我国养猪业及其国际贸 易的发展。我国是世界上养猪最多的国家，养猪业已成为我国畜牧业的一大支柱产业，但每 年因感染猪瘟死亡的猪就占饲养总量的2% 5%，引起的经济损失每年在20亿 50亿左 右。我国采取接种猪瘟兔化弱毒疫苗的方法来预防和控制猪瘟的流行，已经成功的控制了 猪瘟的大爆发。然而，猪瘟的流行特点却从大流行转变为地方性流行和散发，并且不分季节 的随时发生。临床特点也从典型猪瘟转变为非典型性猪瘟，诊断和预防难度越来越大，因此 猪瘟仍是威胁养猪户的头号传染病。国外和国内均已建立了 RT-PCR(反转录-聚合酶链反应)检测方法。国外应用PCR 诊断CSFV已取得很大进展，许多学者根据CSFV序列，设计了不同引物，建立了检测CSFV核 酸的套式RT-PCR方法。该方法直接从猪的脾脏、血清、淋巴结及肉品等中扩增出预期的片 断，但该方法仅应用了两对引物，通过两次PCR扩增产生一个核苷酸片段。因此检测一份 样品需耗时7小时，即耗时又耗力。另外，RNA(核糖核酸)病毒具有高度变异能力，一个片 段不足以解决此问题，同时CSFV是一种高度传染性的病毒，因此现有的检测方法不具有快 速，敏感和准确的特点，需要研制并开发出快速，敏感、准确以及价格便宜的CSFV检测试剂 盒和检测方法，以弥补我国在CSFV检测上的薄弱环节，同时有利于剔除隐性带毒动物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有检测方法不能适应快速、敏感和准确的检测 需求，从而提供一种能够快速、敏感、准确地检测病毒的一种用于检测猪瘟病毒的试剂盒， 本发明还提供该试剂盒的检测方法。为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案一种用于检测猪瘟病毒的试剂盒，包含RNA酶抑制剂、AMV(禽成髓细胞性白血病 病毒)逆转录酶、Taq酶(耐热脱氧核糖核酸聚合酶)、无RNA酶水、OneStep RNA PCR ( 一 步RNA聚合酶链反应)混合液、阴、阳性对照以及序列SEQ IDNO :1至SEQ ID NO 6引物的 混合物。所述序列SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 6引物混合物的包括619bp条带的引物序列为SEQ ID NO 1 上游引物 TCAGGGGGATGTGCAGAGATGTGTSEQ ID NO 2 下游引物 GCTTTTTCCGCGCCTGATTGATA 395bp 条带的引物序列为
SEQ ID NO :3 上游引物 CCGCCGGTGATTTCGTGSEQ ID NO :4 下游引物 ACTGCCTCTTTGCCCTTTCCTTAT 274bp 条带的引物序列为SEQ ID NO :5 上游引物 CTGGCCAAGAGGGGTGAGCSEQ ID NO :6 下游引物 ACAGGCCGTCTTGGGTATTC所述引物混合物序列为序列SEQ ID NO 1至SEQID NO 6的向5，端和/或3，端延长的序列；619bp (NO :7)tcagggggatgtgcagagatgtgtggaagccatgaccaattatgcaagagagggtatccaatttatgaa gtctcaagcactgaaggtgaaggaaacccctacttacaaggagacaatggacactgtgacggactatgtaaagaaatteat ggaggcgctggcagacagtaaagaagacatcataaaatatgggctgtgggggacgcacacagccttatataagagcatc agtgccaggcttgggggtgagactgcgttcgctaccctggtagtgaagtggctggcatttgggggtgaatcaatagcag accatgtcaaacaagcggccacagacttggtcgtttactatatcatcaacagacctcagttcccaggagacacggagacac aacaagacggaaggaaatttgtggccagcctactggcctcagctctagctacttacacatacaaaagctggaattacaat aacctgtccaagatagttgaaccggctttggccactctgccctatgccgccacagctctcaaattatttgcccccacccgatt agagagcgttgtcatattaagtaccgcaatctacaagacctacctatcaatcaggcgcggaaaaagc395bp (NO :8)ccgccggtgatttcgtggacgagaagaaacctagagtcatacaataccctgaagcaaaaacaagactgg ccatcaccaaggtgatgtataagtgggtgaagcagaagccagtagttatacccgggtatgaagggaagacacctctatt ccaaatttttgacaaagtgaagaaggaatgggatcaatttcaaaatccagtggcagtgagcttcgacactaaggcgtgggac acccaggtaaccacaaaagatttggagctgataagggacatacaaaagtattatttcaagaagaaatggcacaaattta ttgacaccctgaccacgcatatgtcagaagtacccgtgattagtgctgatggggaagtatacataaggaaagggcaaagagg cagt274bp (NO :9)ctggccaagaggggtgagccaagaaccctgaagtggattagaaatttcaccgactgtccattgtgggtt accagttgctccgatgatggcgcgagtgggagtaaagagaagaagccagataggatcaacagaggcaaattaaaaatagcc ccaaaagagcatgagaaggacagcagaactaggccacctgacgctacgatcgtggtggaaggagtaaaataccaggt
6caaaaagaaaggtaaagttaaaggaaagaatacccaagacggcctgt所述One Step RNA PCR混合液包含PCR缓冲液、dNTP和Mg2+。PCR缓冲液的浓度 为10x、dNTP的浓度为10mM，Mg2+的浓度为25mM，所述PCR缓冲液、dNTP和Mg2+的配比为 5 · 4 · 3 ο所述引物浓度为50ρπιο1/μ 1，三对引物274bp，3%bp，619bp的配比为 13 12 5。所述阴性对照为正常细胞培养上清，空白对照为无RNA酶水。所述阳性对照为CSFV C株细胞毒。本发明还提供了用所述试剂盒检测猪瘟病毒的方法，包括以下步骤a.分别取400 μ L组织样品研磨上清液(细胞毒培养上清或血清)、空白对照及 阴、阳性对照提取总RNA;b.使用本发明所述的检测试剂盒进行RT-PCR扩增，其中条件如下50°C反转录30 分钟，94°C预变性2分钟，94°C 40秒，退火温度57 °C 40秒，72 °C 50秒，30个循环后72°C延 伸8分钟；c.电泳电压 80V-100V，或电流 40mA-50mA。电泳 15min_25min ；d.结果分析，与DL2000标准分子量对照，如果阳性对照出现619bp、395bp及 274bp三条条带或三条中的任何一条，样品扩增产物出现274bp、395bp以及619bp中的任何 一条条带，而阴性对照无扩增条带，则可判定该样品为阳性，否则为阴性。所述样品可以是待测猪的脾脏、血、淋巴结及肉品等。本发明在检测过程中将反转录和PCR扩增过程在一步反应中完成，使得检测时间 由原来的4-5小时缩短到现在的2-3小时，从而有利于快速检测。同时本发明使用了三对 引物，使该方法与普通PCR方法相比具有更高的敏感性，有助于CSFV的防控和隐性带毒动 物的剔除，避免造成大范围的传染。所述方法适用于任何实验室和基层各级防控单位、兽医 站及大中小型养殖场等。
图1为本发明样本检测电泳图。图中泳道1为分子量标准DL2000 ；泳道2为阳性对照；泳道3_6分别为猪脾脏、 全血、血清及淋巴结，其中泳道3和泳道4为强阳性样品；泳道5和6为阳性样品；泳道7为 阴性对照；泳道8为空白对照。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进行进一步详细叙述实施例11、引物的设计和制备参照GenBank (基因库)查找多个毒株，寻找多个序列上均保守的区域进行序列比 对，根据比对结果设计相对保守的三对特异引物，引物序列如下619bp条带的引物序列为
上游引物TCAGGGGGATGTGCAGAGATGTGT(SEQ ID NO 1)下游引物GCTTTTTCCGCGCCTGATTGATA(SEQ ID NO 2)395bp条带的引物序列为上游引物为CCGCCGGTGATTTCGTG(SEQ ID NO:3)下游引物为ACTGCCTCTTTGCCCTTTCCTTAT(SEQ ID NO 4)274bp条带的引物序列为上游引物为CTGGCCAAGAGGGGTGAGC(SEQ ID NO:5)下游引物为ACAGGCCGTCTTGGGTATTC(SEQ ID NO:6)上述引物由大连宝生物工程有限公司合成。阳性对照本发明试剂盒的阳性对照是灭活CSFV C株细胞毒，由中国农业科学院 兰州兽医研究所传代并大量培养。2、样品的制备(1)分别取阳性对照、猪脾脏组织研磨上清液取、阴性对照、无RNA酶水即空白对 照400μ 1，置1.5mL印pendorf管中，加1000 μ 1 Trizol (核酸抽提试剂)，混勻，4°C放置 5min。(2)力Π 200 μ 1三氯甲烷，盖上盖振摇15秒，室温放置3分钟。(3) 12000转/分和4°C离心15分钟，分为三层。(4)将上层水相(约700 μ 1)转移至另一 1.5ml管中，加入等量(700 μ 1)异丙醇， 混勻，室温放置10分钟。(5) 10000转/分和4°C离心10分钟，弃上清。(6)加1000 μ 1用无核糖核酸酶水配制的75%乙醇，漂洗沉淀一次，8000转/分和
4°C离心5分钟，弃上清。(7) 8000rpm, 4°C，离心2min，吸弃上清，室温充分干燥RNA沉淀。(8)加20 μ 1无RNA酶水，溶解RNA沉淀，即可用于PCR扩增，其余RNA沉淀-20 V
保存备用。3、制备试剂盒本试剂盒由以下组分组成a. One Step RNA PCR 混合液 10 μ 1，浓度 IOxb. RNA 酶抑制剂 0. 5 μ 1，浓度为 40U/ μ 1c. AMV 逆转录酶 0. 5 μ 1，浓度为 5U/ μ 1d. Taq 酶 0. 5 μ 1，浓度为 5U/ μ 1e.引物浓度均为50ρ θ1/μ 1的三对引物混合液1.5μ l，274bp引物0.65 μ 1， 395bp引物 0· 6 μ l，619bp 引物 0. 5 μ 1。f ·无 RNA 酶水 7 μ 1g.阳性对照5μ1h.阴性对照5μ14、用本发明试剂盒检测猪瘟病毒(I)PCR总体系为25 μ 1。分别将本发明试剂盒中a. One Step RNA PCR混合液10 μ 1 ；b. RNA 酶抑制剂 0. 5 μ 1 ；c. AMV 逆转录酶 0. 5 μ 1 ；d.Taq 酶 0.5μ 1 ；e.三对引物 1. 5 μ 1 ;f.无RNA酶水7 μ 1，加入到4根0. 2ml扩增管中；(2)分别向上述扩增管中加入阳性对照5μ 1、从猪脾脏提取的RNA模板5μ 1、阴性 对照5 μ 1、无RNA酶水即空白对照5 μ 1，12000rpm离心5_30秒，将扩增管放入扩增仪中，在 以下设定程序下扩增50°C反转录30min，94°C预变性2min，94°C 40s，退火温度57°C 40s, 72°C 50s, 30个循环后72°C延伸8分钟，得到扩增产物。实施例21、引物的设计和制备同实施例12、样品的制备(1)取待检猪全血400μ 1，置1. 5mL印pendorf管中，加1000 μ 1 Trizol (核酸抽 提试剂)，混勻，4°C放置5min。步骤O)-步骤(8)同实施例1中23、制备试剂盒同实施例1中34、用本发明试剂盒检测猪瘟病毒(I)PCR总体系为25 μ 1。将本发明试剂盒中a. One Step RNA PCR混合液10 μ 1 ； b. RNA 酶抑制剂 0.5 μ 1 ；c. AMV 逆转录酶 0.5 μ 1 ；d.Taq 酶 0.5 μ 1 ；e.三对引物 1.5μ 1 ； f.无RNA酶水7 μ 1加入0. 2ml扩增管中；(2)向上述扩增管中加入从猪全血中提取的RNA模板5 μ l，12000rpm离心5-30 秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增50°C反转录25min，94°C预变性2min， 94°C 30s，退火温度57°C 35s，72°C 40s, 25个循环后72°C延伸8分钟，得到扩增产物。实施例31、引物的设计和制备同实施例12、样品的制备(1)取待检猪血清400μ 1，置1. 5mL印pendorf管中，加1000 μ 1 Trizol(核酸抽 提试剂)，混勻，4°C放置5min。步骤O)-步骤(8)同实施例1中23、制备试剂盒同实施例1中34、用本发明试剂盒检测猪瘟病毒(I)PCR总体系为25 μ 1。分别将本发明试剂盒中a. One Step RNA PCR混合液 10 μ 1 ；b. RNA 酶抑制剂 0. 5 μ 1 ；c. AMV 逆转录酶 0. 5 μ 1 ；d.Taq 酶 0.5μ 1 ；e.三对引物 1. 5μ 1 ；f.无RNA酶水7 μ 1加入0. 2ml扩增管中；(2)向上述扩增管中加入从猪全血中提取的RNA模板5 μ l，12000rpm离心5-30 秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增50°C反转录40min，94°C预变性5min， 94°C 60s，退火温度57°C 60s, 72°C 90s, 40个循环后72°C延伸15分钟，得到扩增产物。实施例41、引物的设计和制备同实施例12、样品4的制备(1)取待检猪淋巴结研磨上清液400μ 1，置1.5ml印pendorf管中，加1000 μ 1 Trizol (核酸抽提试剂)，混勻，4°C放置5min。
步骤⑵-步骤(8)同实施例1中23、制备试剂盒同实施例1中34、用本发明试剂盒检测猪瘟病毒(I)PCR总体系为25μ 1。分别将本发明试剂盒中a. One Step RNA PCR混合液 10 μ 1 ；b. RNA 酶抑制剂 0. 5 μ 1 ；c. AMV 逆转录酶 0. 5 μ 1 ；d.Taq 酶 0.5μ 1 ；e.三对引物 1. 5μ 1 ；f.无RNA酶水7 μ 1加入0. 2ml扩增管中；(2)向上述扩增管中加入从猪全血中提取的RNA模板5 μ l，12000rpm离心5-30 秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增50°C反转录30min，94°C预变性2min， 94°C 60s，退火温度57°C 50s, 72°C 50s, 35个循环后72°C延伸10分钟，得到扩增产物。结果判定1、称取l.Og琼脂糖，加入IOOml 1 XTAE缓冲液中，加热融化，加入5 μ L(IOOmg/ ml)溴化乙锭，混勻，倒入插有8孔道梳子的水平放置的凝胶盘中，胶板厚度为5mm，待凝胶 冷却后拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，加IXTAE缓冲液淹没胶面。2、分别取5μ 1上述实施例1-4所得PCR扩增产物和2μ L 6x Ioadingbuffer (上 样缓冲液)，混勻，加入加样孔中，同时加5 μ 1 DL2000分子量标准。3、80V-100V 电压或 40mA_50mA 电流电泳 15min_25min。取出凝胶板置于紫外透射仪上，打开紫外灯观察并拍摄照片，结果见图1。如图所示，与DL 2000标准分子量对照可知，实施例1中猪脾脏和实施例2中猪全 血的电泳结果出现了三条不同的条带，即619bp、3%bp以及274bp ；实施例3中猪血清和实 施例中淋巴结出现了两条带，与阳性对照相符，同时阴性对照和空白对照无扩增条带，所以 判定实施例1-实施例4中样品1-样品4为阳性，即所述的待检猪脾脏、全血、血清及淋巴 结包含猪瘟病毒。
权利要求
1.一种用于检测猪瘟病毒的试剂盒，包含RNA酶抑制剂、AMV逆转录酶、Taq酶、无RNA 酶水、One Step RNA PCR混合液、阴、阳性对照，其特征在于所述试剂盒还包括序列SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 6引物的混合物。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于所述序列SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 6引物混合物包括619bp条带的引物序列为SEQ ID NO 1 上游引物 TCAGGGGGATGTGCAGAGATGTGTSEQ ID NO :2 下游引物 GCTTTTTCCGCGCCTGATTGATA395bp条带的引物序列为SEQ ID NO :3 上游引物 CCGCCGGTGATTTCGTGSEQ ID NO :4 下游引物 ACTGCCTCTTTGCCCTTTCCTTAT274bp条带的引物序列为SEQ ID NO 5 上游引物 CTGGCCAAGAGGGGTGAGCSEQ ID NO 6 下游引物 ACAGGCCGTCTTGGGTATTC
3.根据权利要求1所述的一种用于检测猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于所述引物混合 物序列为序列SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :6的向5，端和/或3，端延长的序列； 619bp(NO 7)tcagggggatgtgcagagatgtgtggaagccatgaccaattatgcaagagagggtatccaatttatgaagtct caagcactgaaggtgaaggaaacccctacttacaaggagacaatggacactgtgacggactatgtaaagaaattcatggag gcgctggcagacagtaaagaagacatcataaaatatgggctgtgggggacgcacacagccttatataagagcatcagtg ccaggcttgggggtgagactgcgttcgctaccctggtagtgaagtggctggcatttgggggtgaatcaatagcagacca tgtcaaacaagcggccacagacttggtcgtttactatatcatcaacagacctcagttcccaggagacacggagacacaaca agacggaaggaaatttgtggccagcctactggcctcagctctagctacttacacatacaaaagctggaattacaataacc tgtccaagatagttgaaccggctttggccactctgccctatgccgccacagctctcaaattatttgcccccacccgattagag agcgttgtcatattaagtaccgcaatctacaagacctacctatcaatcaggcgcggaaaaagc 395bp (NO 8)ccgccggtgatttcgtggacgagaagaaacctagagtcatacaataccctgaagcaaaaacaagactggccatCciCCciciggtgatgtataagtgggtgaagcagaagccagtagttatacccgggtatgaagggaagacacctctattccaa atttttgacaaagtgaagaaggaatgggatcaatttcaaaatccagtggcagtgagcttcgacactaaggcgtgggacacccaggtaaccacaaaagatttggagctgataagggacatacaaaagtattatttcaagaagaaatggcacaaatttattga caccctgaccacgcatatgtcagaagtacccgtgattagtgctgatggggaagtatacataaggaaagggcaaagaggcagt274bp (NO 9)ctggccaagaggggtgagccaagaaccctgaagtggattagaaatttcaccgactgtccattgtgggttacca gttgctccgatgatggcgcgagtgggagtaaagagaagaagccagataggatcaacagaggcaaattaaaaatagccccaaaagagcatgagaaggacagcagaactaggccacctgacgctacgatcgtggtggaaggagtaaaataccaggtcaaa aagaaaggtaaagttaaaggaaagaatacccaagacggcctgt
4.根据权利要求1所述的一种用于检测猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于所述OneStep RNA PCR混合液包含PCR缓冲液、dNTP和Mg2+，所述PCR缓冲液的浓度为10x，dNTP的浓度 为IOmM, Mg2+的浓度为25mM,所述PCR缓冲液、dNTP和Mg2+的比例为5:4:3。
5.根据权利要求1所述的一种用于检测猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于所述引物浓度 为 50pmol/y L，三对引物 274bp，395bp，619bp 的配比为 13 12 5。
6.根据权利要求1所述的一种用于检测猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于所述阴性对照 为正常细胞培养上清，空白对照为无RNA酶水。
7.根据权利要求1所述的一种用于检测猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于所述阳性对照 为CSFV C株细胞毒。
8.—种如权利要求1所述试剂盒检测猪瘟病毒的方法，其特征在于，所述方法包括以 下步骤a.Trizol法提取样品总RNA ；b.使用权利要求1所述的检测试剂盒进行RT-PCR扩增，条件如下50°C反转录25 40分钟，94°C预变性2 5分钟，94°C 30秒 60秒，退火温度57°C 35 60秒，72°C 40 90秒，25 40个循环后72°C延伸8 15分钟；c.常规电泳；d.结果分析，如果样品扩增产物出现274bp、395bp以及619bp中的任何一条条带，而阴 性对照和空白对照无扩增条带，则判定该样品为阳性。
9.一种如权利要求10所述试剂盒检测猪瘟病毒的方法，其特征在于，所述方法包括以 下步骤a.Trizol法提取样品总RNA ；b.使用权利要求1所述的检测试剂盒进行RT-PCR扩增，条件如下50°C反转录30分 钟，94°C预变性2分钟，94°C 40秒，退火温度57 °C 40秒，72 °C 50秒，30个循环后72°C延伸 8分钟；c.常规电泳；d.结果分析，如果样品扩增产物出现274bp、395bp以及619bp中的任何一条条带，而阴 性对照和空白对照无扩增条带，则判定该样品为阳性。
10.根据权利要求8或9所述的一种用于检测猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于所述样品 可以是待测猪的脾脏、血、淋巴结及肉品。
全文摘要
一种用于检测猪瘟病毒的试剂盒，包含RNA酶抑制剂、AMV(禽成髓细胞性白血病病毒)逆转录酶、Taq酶(耐热脱氧核糖核酸聚合酶)、无RNA酶水、One Step RNA PCR(一步RNA聚合酶链反应)混合液、阴、阳性对照以及序列SEQ ID NO1至SEQ ID NO6引物的混合物。本发明在检测过程中将反转录和PCR扩增过程在一步反应中完成，使得检测时间由原来的4-5小时缩短到现在的2-3小时，从而有利于快速检测。同时本发明使用了三对引物，使该方法与普通PCR方法相比具有更高的敏感性，有助于CSFV的防控和隐性带毒动物的剔除，避免造成大范围的传染。所述方法适用于任何实验室和基层各级防控单位、兽医站及大中小型养殖场等。
文档编号C12Q1/70GK102140540SQ201110035770
公开日2011年8月3日 申请日期2011年1月29日 优先权日2011年1月29日
发明者刘湘涛, 吴锦艳, 尚佑军, 尹双辉, 张克山, 杨顺利, 王光祥, 田宏, 陈妍, 靳野 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所