奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定方法
【专利摘要】本发明涉及一种奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定方法，采用传统细菌培养方法以及基于病原菌16S?rRNA基因采用序列分析方法和双引物PCR-SSCP技术对中国荷斯坦奶牛乳房炎致病菌进行分离和鉴定。双引物PCR-SSCP技术和序列分析方法鉴定结果基本相同。双引物PCR-SSCP技术的结果多态性较好，结果与序列分析结果类似，是一种高效，简单和经济的鉴定病原菌的方法，为中国南方荷斯坦奶牛乳房炎致病菌的快速鉴定提供理论依据，从而为奶牛乳房炎的诊治提供了理论基础。
【专利说明】奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及奶牛乳房炎防治领域，具体涉及用16S rRNA基因的双引物PCR-SSCP作为高效，简便和经济的方法来鉴定奶牛乳房炎的致病菌。
【背景技术】
[0002]奶牛乳房炎是全球范围内奶牛养殖业中最严重的疾病之一。乳房炎会造成牛奶产量和质量的严重影响，该病大约消耗所有疾病经济的38%。在物理，化学等因素刺激下会使乳房组织产生炎症，但主要是由一种或多种微生物感染乳腺所造成。据报道乳房炎主要是由于细菌的感染，也有少数情况是由于真菌的感染造成的。例如金黄色葡萄球菌经常会引起乳牛坏疽性乳房炎。目前，奶牛乳房炎的防治方法有很多种，主要通过优化管理方式，如正确的挤奶方式和减少奶牛外界接触环境中的病原体，但是乳房炎在治疗和预防方面依然很大程度上依赖于抗生素的使用。抗菌药物被广泛用于控制金黄色葡萄球菌的感染，然而在临床治疗过程中，由于盲目的大量使用抗生素导致耐药菌株的不断产生使这些药物的使用受到了严重的争议。如果不能及时有效地控制金黄色葡萄球菌的感染，会造成慢性细菌性乳房炎疾病。在不能明确确定乳房炎病因的情况下，虽然可以通过优化挤奶的方式，消毒和抗生素的治疗等方法以减少奶牛乳房炎的发病率，但是这些方法有一定的盲目性。因此需要确定奶牛乳房炎主要致病菌的种类，并针对具体病原菌采取相应的预防和治疗措施，才能更有效的降低奶牛乳房炎发病率，及时治愈病牛。
[0003]现阶段确定奶牛乳房炎致病菌主要是通过传统细菌培养，根据菌落形态确定其种类，此过程周期长且不能及时准确的确定致病菌种类以便于乳房炎疾病预防和治疗，因此研发和完善一种快速、灵敏、准确的新型诊断方法迫在眉睫。
[0004]16S rRNA存在于所有的微生物中，并且包括保守区和可变区，所以16S rRNA基因的序列分析常用作微生物进化关系分析的靶基因。基于16S rRNA基因序列的PCR技术的应用是一种精确的鉴定方法。国内外有些实验室偏向于使用此技术来鉴定少量的致病菌，但是这种方法需要大量的时间和花费，不能广泛应用于奶牛乳房炎致病菌的鉴定中。
[0005]目前，国内外有些实验室采用一对引物的PCR-SSCP技术对常见病原菌进行鉴定。因为SSCP技术是一项简单，快速，高效的鉴定微生物的技术。但是有些病原菌的SSCP图谱多态性较差，难以与其他致病菌区别。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定方法，用16S rRNA基因的双引物PCR-SSCP作为高效，简便和经济的方法来鉴定奶牛乳房炎的致病菌。
[0007]具体技术方案如下:
[0008]一种奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定方法，包括如下步骤:
[0009](I)采集奶样；
[0010](2)分离致病菌；[0011](3)提取病原菌菌落DNA ;
[0012](4)合成引物；
[0013](5) PCR扩增产物检测；
[0014](6)双引物的PCR-SSCP分析。
[0015]进一步地，步骤(1)进一步为采集40头乳房炎性奶牛的40个奶样。
[0016]进一步地,步骤(2)进一步包括如下步骤:
[0017](2-1)将采集的奶样分别接种于普通培养基、麦康凯琼脂培养基、牛肉膏蛋白胨培
养基;
[0018](2-2) 37°C培养24_48h，根据菌落形态作纯化培养；
[0019](2-3)按常规方法涂片、革兰氏染色、镜检；
[0020](2-4)初步鉴定致病菌种类。
[0021]进一步地,步骤(3)进一步包括如下步骤:
[0022](3-1)挑取适量 菌落于装有1000ii I无菌水的离心管中，12000r/min离心5min，吸
去水使细菌沉淀尽可能干燥；
[0023](3-2)向装有细菌沉淀的离心管中加入100 U I溶液I，混匀，室温放置IOmin ；
[0024](3-3)加入200 U I溶液II,盖紧离心管,颠倒数次混匀,冰上放置5min ；
[0025](3-4)加入150 U I溶液III，盖紧离心管，颠倒数次混匀,冰上放置IOmin ；
[0026](3-5) 12000r/min离心5min,取上清液于另一离心管中；
[0027](3-6)向上清液中加入等体积的酚:氯仿:异戊醇，反复混匀，12000r/min离心5min,取上清液于另一离心管中；
[0028](3-7)向上清液中加入2倍体积的无水乙醇，混匀，冰上放置lOmin，12000r/min离心5min; (3-8)倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体；
[0029](3-9)用lml70%乙醇洗涤DNA沉淀，混匀，12000r/min离心5min，倒去上清液，
真空抽干或在空气中干燥；
[0030](3-10)加入30 ii ITE缓冲液(其中含有20 y g/ml胰RNA酶)，使DNA完全溶解，_20°C保存备用。
[0031]进一步地,步骤(5)进一步包括如下步骤:
[0032](5-1)取5 ii LPCR扩增产物加入I U L溴酚蓝上样缓冲液混匀；
[0033](5-2)在0.8%琼脂糖凝胶上电泳，恒压80V，电泳30min ；
[0034](5-3)将胶置于凝胶成像系统上观察并拍照；
[0035](5-4)第一对引物的PCR产物取370bp处取条带，进行胶回收；
[0036](5-5)测序，比对确定细菌种类。
[0037]进一步地,步骤(6)进一步包括如下步骤:
[0038](6-1) PCR 扩增产物 98°C变性 IOmin ；
[0039](6-2)经12%非变性聚丙烯酰胺凝胶150V电泳5~7h，银染显色；
[0040](6-3)根据电泳图谱，鉴定图谱。
[0041]进一步地，步骤(3-2)中所述溶液I为50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris ? HCl(pH8.0)，IOmmoI/L EDTA(pH8.0)。
[0042]进一步地，步骤(3-3)中所述溶液II为1%SDS，0.2%Na0H，用前等体积混合。[0043]进一步地，步骤(3-4)中所述溶液III为5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5m。
[0044]进一步地，鉴定方法基于16S rRNA基因的序列分析和双引物PCR-SSCP方法。
[0045]与目前现有技术相比，本发明为了快速分离和鉴定中国南方荷斯坦奶牛乳房炎的病原菌，采用传统细菌培养方法以及基于病原菌16S rRNA基因采用序列分析方法和双引物PCR-SSCP技术对中国荷斯坦奶牛乳房炎致病菌进行分离和鉴定。结果:双引物PCR-SSCP技术的结果多态性较好，结果与序列分析结果相同，是一种高效，简单和经济的鉴定病原菌的方法，为中国南方荷斯坦奶牛乳房炎致病菌的快速鉴定提供理论依据，从而为奶牛乳房炎的诊治提供了理论基础。
[0046]具体来说:用16S rRNA可变区的两对引物进行PCR-SSCP分析，解决了以16S rRNA可变区的一对引物进行PCR-SSCP分析时图谱的多态性差不易区分的问题。
[0047]本发明在PCR技术的基础上，设计特异引物扩增目标微生物的16S rRNA基因可变区的三对引物用于序列分析和PCR-SSCP分析。PCR-SSCP技术操作简单，容易掌握，实验步骤少，周期短且灵敏度高。不同的致病菌具有特异性目的条带。鉴定过程简单方便，成本低廉，速度快。
【专利附图】
【附图说明】
[0048]图1为PCR结果的琼脂糖凝胶图A:引物RW01，DG74 ；B:双引物P11P，P13P和ER10，ERll
[0049]图2为细菌序列比对
[0050]图3为致病菌的进化关系
[0051]图4为双引物的SSCP图谱
【具体实施方式】
[0052]下面根据附图对本发明进行详细描述，其为本发明多种实施方式中的一种优选实施例。
[0053](I)奶样采集:40个奶样采自安徽芜湖卫岗奶牛场40头乳房炎性奶牛。
[0054](2)分离致病菌:将采集的奶样分别接种于普通培养基、麦康凯琼脂培养基、牛肉膏蛋白胨培养基。37°C培养24-48h，根据菌落形态作纯化培养。按常规方法涂片、革兰氏染色、镜检。初步鉴定致病菌种类。
[0055](3)病原菌菌落DNA的提取:挑取适量菌落于装有1000 无菌水的离心管中，12000r/min离心5min。吸去水使细菌沉淀尽可能干燥。向装有细菌沉淀的离心管中加入100 ill 溶液 I (50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris ? HCl (pH8.0)，10mmol/L EDTA (pH8.0))，混匀，室温放置lOmin。加入200 U I溶液II (1%SDS，0.2%Na0H,用前等体积混合)，盖紧离心管，颠倒数次混匀，冰上放置5min。加入150 y I溶液III(5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸
11.5ml,水28.5ml),盖紧离心管，颠倒数次混匀，冰上放置IOmin0 12000r/min离心5min,取上清液于另一离心管中。向上清液中加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25: 24: 1)，反复混匀，12000r/min离心5min，取上清液于另一离心管中。向上清液中加入2倍体积的无水乙醇,混匀，冰上放置lOmin，12000r/min离心5min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。用lml70%乙醇洗漆DNA沉淀，混匀，12000r/min离心5min,倒去上清液，真空抽干或在空气中干燥。加入30 u ITE缓冲液(其中含有20 u g/ml胰RNA酶)，使DNA完全溶解，_20°C保存备用。
[0056](4)引物的合成:引物由上海生物公司合成，具体位置、序列、长度和退火温度见附件中的表一。
[0057](5)PCR扩增产物检测:取5 ii LPCR扩增产物加入I U L溴酚蓝上样缓冲液混匀，在
0.8%琼脂糖凝胶上电泳，恒压80V，电泳30min，将胶置于凝胶成像系统上观察并拍照。第一对引物的PCR产物取370bp处取条带，进行胶回收。由上海生物工程有限公司测序，比对确定细菌种类，结果见附件图2和表二。
[0058](6)双引物的PCR-SSCP分析:PCR扩增产物98°C变性IOmin后，经12%非变性聚丙烯酰胺凝胶150V电泳5~7h，银染显色。根据电泳图谱，鉴定图谱。结果见附件图4所示。
[0059]本实验确定了 7种常见的奶牛乳房炎致病菌的图谱。可高效、准确的确定奶牛乳房炎的致病菌，从而有针对性采用药物治疗，减少抗生素的滥用频率。奶牛的耐药性相对减弱，乳房炎奶牛相对减少，牛奶的质量有所提高，保证了乳制品的质量，具有很高的市场价值和潜力。
[0060]表一:引物
[0061]
【权利要求】
1.一种奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)采集奶样； (2)分离致病菌； (3)提取病原菌菌落DNA； (4)合成引物； (5)PCR扩增产物检测； (6)双引物的PCR-SSCP分析。
2.如权利要求1所述的奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定方法，其特征在于，步骤(1)进一步为采集40头乳房炎性奶牛的40个奶样。
3.如权利要求1或2所述的奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定方法，其特征在于，步骤(2)进一步包括如下步骤: (2-1)将采集的奶样分别接种于普通培养基、麦康凯琼脂培养基、牛肉膏蛋白胨培养基; (2-2) 37°C培养24-48h，根据菌落形态作纯化培养； (2-3)按常规方法涂片、革兰氏染色、镜检； (2-4)初步鉴定致病菌种类。
4.如权利要求1-3中一项所述的奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定方法，其特征在于，步骤(3)进一步包括如下步骤: (3-1)挑取适量菌落于装有1000 u I无菌水的离心管中，12000r/min离心5min，吸去水使细菌沉淀尽可能干燥； (3-2)向装有细菌沉淀的离心管中加入100 ill溶液I，混匀，室温放置IOmin ； (3-3)加入200 u I溶液II,盖紧离心管,颠倒数次混匀,冰上放置5min ； (3-4)加入150ii I溶液III,盖紧离心管，颠倒数次混匀,冰上放置IOmin ； (3-5) 12000r/min离心5min,取上清液于另一离心管中； (3-6)向上清液中加入等体积的酹:氯仿:异戍醇,反复混匀，12000r/min离心5min,取上清液于另一离心管中； (3-7)向上清液中加入2倍体积的无水乙醇，混匀，冰上放置lOmin，12000r/min离心5min ； (3-8)倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体； (3-9)用Iml70%乙醇洗涤DNA沉淀，混匀，12000r/min离心5min，倒去上清液，真空抽干或在空气中干燥； (3-10)W；v30iaTE缓冲液(其中含有20 u g/ml胰RNA酶)，使DNA完全溶解，-20 °C保存备用。
5.如权利要求1-4中一项所述的奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定方法，其特征在于，步骤(5)进一步包括如下步骤: (5-1)取5 ii LPCR扩增产物加入I U L溴酚蓝上样缓冲液混匀； (5-2)在0.8%琼脂糖凝胶上电泳，恒压80V，电泳30min ； (5-3)将胶置于凝胶成像系统上观察并拍照； (5-4)第一对引物的PCR产物取370bp处取条带，进行胶回收；(5-5)测序，比对确定细菌种类。
6.如权利要求1-5中一项所述的奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定方法，其特征在于，步骤(6)进一步包括如下步骤: (6-1) PCR扩增产物98°C变性IOmin ； (6-2)经12%非变性聚丙烯酰胺凝胶150V电泳5~7h，银染显色； (6-3)根据电泳图谱，鉴定图谱。
7.如权利要求4所述的奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定方法，其特征在于，步骤(3-2)中所述溶液 I 为 50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris ? HCl (pH8.0), 10mmol/L EDTA (pH8.0)。
8.如权利要求4所述的奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定方法，其特征在于，步骤(3-3)中所述溶液II为1%SDS，0.2%NaOH，用前等体积混合。
9.如权利要求4所述的奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定方法，其特征在于，步骤(3-4)中所述溶液III为5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5m。
10.如权利要求1-9中一项所述的奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定方法，其特征在于，鉴定方法基于16S rRNA基因的序列分 析和双引物PCR-SSCP方法。
【文档编号】C12Q1/04GK103642925SQ201310676837
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】杨兰英, 蔡亚非, 刘再群 申请人:安徽师范大学