一种液氮技术制备发酵剂的方法
一种液氮技术制备发酵剂的方法
【专利摘要】本发明公开了一种液氮技术制备发酵剂的方法，其包括步骤：(1)分别对单个菌种进行扩大培养；(2)从步骤（1）中扩大培养所得的菌体培养液中收集菌体；(3)将步骤（2）所得的菌体在菌体保护液中重新悬浮并混合均匀，得到单菌悬浮液；(4)将多种步骤（3）中所得的单菌悬浮液按照多种菌体混合的要求混合均匀，得到多菌悬浮液；(5)将步骤（4）所得的多菌悬浮液滴入液氮中，得到颗粒，所述的液氮的液层高度为50-200mm；(6)将步骤（5）所得的颗粒进行筛选，即得发酵剂。本发明提供的方法具有批次间产品性能更稳定，使用更方便，制备工艺较为简便，且获得的发酵剂颗粒均匀、外形较佳等优点。
【专利说明】一种液氮技术制备发酵剂的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品工业领域，特别涉及一种液氮技术制备发酵剂的方法。
【背景技术】
[0002]对于酸奶制作的研究，从最初的开始使用天然的混合菌株制备酸奶等乳制品，到筛选出性状优良的发酵菌种制备纯菌种液体发酵剂，再发展到现在易于保藏和运输的高效冻干直投式发酵剂的出现，标志着酸奶发酵剂研究的三个时代的更替。欧美许多国家在20世纪初就已经开始对发酵剂进行研究，
[0003]至今在发酵剂的领域中已取得举世瞩目的成就，浓缩发酵剂已实现了专业化、商品化生产，并成功的应用于发酵乳制品的生产以及保健型乳酸菌制剂的研制，涌现出一批知名的实力强劲的发酵剂制造商，如丹麦的科汉森公司和法国的罗地亚公司等。最初研制成的是冷冻浓缩乳酸菌发酵剂，即将乳酸菌通过浓缩培养、离心收集等手段制成高浓度菌体的浓缩型菌悬液，添加抗冻保护剂后在低于_70°C的低温条件下速冻，再置于低温下深冻保藏而成。
[0004]伴随真空冷冻干燥技术的日益成熟，在九十年代初，又相继开发出了浓缩型的真空冻干发酵剂，即将冻结后的浓缩菌悬液通过添加冻干保护剂，在真空低温的条件下将水分升华干燥，制成干燥粉末状的固体发酵剂，也叫直投式发酵剂(DirectvatsetjVS)。这种发酵剂具有较多优点:菌种活力强，浓度高，菌数能高达IOltl~1012cfu/g、发酵性能稳定、生产工艺易于控制，生长周期较短、保藏方便、在4°C常压保藏I年以上仍然具有很强的活力、体积较小，运输方便等等。因此随着直投式发酵剂的出现，酸奶产业得到了进一步的加速发展越来越多的发酵乳生产厂家开始使用浓缩型冻干发酵剂，其中也包括国内大多数大规模的乳制品公司；而我国由于起步较晚，研究水平还与西方国家有一定的差距，但随着国内乳制品市场需求量逐年增长，`许多科研部门和高校实验室都开始加紧对乳品发酵剂的研究和生产，并取得了一定的进展。
[0005]发酵剂中的性状优异的乳酸菌菌种是制备高品质酸奶的关键，保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)是发酵剂中的常用菌种。随着对酸奶益生作用的越来越重视和对乳酸菌菌种研究的深入，嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)也越来越多的应用在酸奶发酵剂中。另有一些益生菌发酵乳制品已经成功的推向市场。如芬兰Valio公司开发的L.GG，法国达能公司开发的L.casei Immunitas,法国罗地亚公司开发的L.acidophilus NCFM,日本Yakult公司开发的L.casei Shirota,丹麦汉森公司的L.acidophilusLA-Ι和LA-2,光明乳业股份有限公司的具降高血压功能的Lactobacillus casei LC2W (EP1642963B1 )、降血脂功能的Lactobacillus casei BD-1I (US Patent7270994),降血清胆固醇功能的 LactobacillusPlantarum ST-1II (ZL200410066891.7、ZL03116377.7)等。
[0006]全球益生菌市场年增长率达9%，中国地区销售额达到50亿欧元，占全球市场份额的四分之一。但我国发酵乳制品行业直投式发酵剂市场长期为国外发酵剂公司所垄断，益生菌发酵剂市场更是为国外公司所完全占有。
[0007]另外，真空冷冻干燥发酵剂具有活菌含量高、易保存管理、更强的稳定性和乳酸菌活力的特点，可直投式使用，是当今发酵剂的主要产品形式。但是，由于在冻干过程对菌体产生损伤，且能耗较大等因素，冻干菌粉菌株存在复活时间较长和成本较高的弊端，对于发酵剂制备需要寻求一种菌体受损伤较小的试验方法和工艺，来优化完善直投式发酵剂的工业制备。使用液氮冷冻浓缩造粒，发酵剂制备工艺方面较冷冻干燥技术简单方便，且耗时较短，制备的发酵剂均复水性较佳，结构较为均匀；在菌体存活率方面，使用保护液制备的液氮菌粒较冻干菌粉有显著优势，能够避免冻干过程中对菌体的损伤。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种新的液氮技术制备多联发酵剂的方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
[0009]本发明中，所述的制备方法优化了液氮技术制备多联发酵剂的方法，保证制备的发酵剂的乳酸菌有较高存活率，制备工艺较为简便，且获得的发酵剂颗粒均匀、外形较佳，有利于改善国内发酵剂市场同质化现象。
[0010]本发明提供的技术方案是:一种如前所述的液氮技术制备多联发酵剂的方法，所述的制备方法包括如下步骤:
[0011](I)分别对单个菌种进行扩大培养；
[0012](2)从步骤(1)中扩大培养所得的菌体培养液中收集菌体；
[0013](3)将步骤(2)所得的菌体在菌体保护液中重新悬浮并混合均匀，得到单菌悬浮液；
[0014](4)将多种步骤(3)中所得的单菌悬浮液按照多种菌体混合的要求混合均匀，得到多菌悬浮液；
[0015](5)将步骤(4)所得的多菌悬浮液滴入液氮中，得到颗粒，所述的液氮的液层高度为 50-200mm ；
[0016](6)将步骤(5)所得的颗粒进行筛选，即得发酵剂。
[0017]本发明中，步骤(1)为分别对单个菌种进行扩大培养。本发明中，所述的扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，最终获得一定数量和质量的纯种过程。本发明中，步骤(1)所述的扩大培养为本领域常规，较佳地，扩大培养一到四次，最佳地，扩大培养三次。较佳的，按本领域常规，菌种经过复苏后进行扩大培养。所述的复苏是指通过菌种的扩大培养，将处于休眠状态的生产菌种接入无菌培养基活化后，最终获得一定数量和质量的纯种微生物。所述的复苏的方式是本领域常规方法。本发明中所述的复苏和扩大培养中涉及到的培养基、培养条件、pH、接种量、发酵温度、发酵时间等均为实验室常规培养乳酸菌的试验参数。本发明中所述的菌种是指发酵过程中作为活细胞催化物的微生物。所述的菌种较佳的为本领域常规的乳酸菌菌种，更佳地包括保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和一种或几种益生菌,所述的益生菌为双歧杆菌(Bifidobacterium)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) ST-1II。[0018]本发明中，步骤(2)是从步骤(1)中扩大培养所得的菌体培养液中收集菌体。其中，所述的收集菌体的方法是常规的，将步骤(1)中扩大培养所得的菌体培养液进行固液分离即可，一般包括过滤，低温离心等；较佳地，本发明中采用低温离心方法并回收沉淀。较佳地，离心条件为2000g~12000g，最佳地，离心条件为5000g ;较佳的，离心时间为5~15min,最佳地,离心时间为lOmin。
[0019]本发明中，步骤(3)是将步骤(2)所得的菌体在菌体保护液中重新悬浮并混合均匀，得到单菌悬浮液。其中，所述的菌体保护液为本领域常规，是一种减少渗透压、或者液体环境中其他不利于菌体存活因素的影响的保护液体。所述菌体保护液较佳地包括10%~15%脱脂乳、1.0%~2.0%蔗糖、1.0%~2.0%海藻糖、0.1%~0.5%甘油、0.05%~0.15%柠檬酸钠和0.05%~0.15%单谷氨酸钠，所述的百分比为质量百分比。更佳的所述菌体保护液包括12%脱脂乳，1.5%蔗糖、1.5%海藻糖，0.2%甘油，0.1%柠檬酸钠和0.1%单谷氨酸钠，所述的百分比为质量百分比。所述的菌体保护液与菌体(湿菌泥)混合比例I~20mL/g，更佳为 10-20mL/g,最佳为 10mL/g。
[0020]本发明中，步骤(4)是将多种步骤(3)中所得的单菌悬浮液按照多种菌体混合的要求混合均匀，得到多菌悬浮液。其中，所述的单菌悬浮液包括多种菌种，较佳的包括多种常规的乳酸菌菌种，更加的包括保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和一种或几种其他益生菌。较佳地，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)数量混合比例为1:1~10:1，发酵乳中嗜热链球菌总数与保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌ST-1II总数的比例为1:1~1000:1，每株益生菌与保加利亚乳杆菌数量混合比例为1:1~10:1。
[0021]本发明中，步骤(5)是将步骤(4)所得的多菌悬浮液滴入液氮中，得到颗粒。步骤
(6)是将步骤(5)中的发酵剂颗粒进行筛选，筛选出颗粒均匀、圆润、粒径大小近似的发酵剂颗粒。其中，所述的发酵剂颗粒为一种用于酸奶、酸牛乳酒、奶油、干酪和其他发酵产品生产的细菌以及其他微生物培养物的固体颗粒。较佳的，步骤(5)和(6)中所述液氮的液层高度为50-200mm,最佳地,高度为100_150mm。以保证发酵剂在沉降过程中形成圆润、均匀颗粒，防止因液层过低造成发酵剂凝结成块现象。较佳地，所述的菌体保护液滴入液氮的流速为500mL/min~1000mL/min,最佳地,流速为750mL/min。较佳的,所述的液氮槽的长度为500~10000mm，宽度W为100~1000mm，高度H为100~400_。更佳的，长度为500_，宽度W为100mm，高度H为180mm。较佳地，步骤(5)和步骤(6)在以下所述的液氮深冷造粒设备中完成:
[0022]所述液氮深冷造粒包括:
[0023]一密封腔体；
[0024]一液体喷淋设备，设置于所述密封腔体顶部；
[0025]一液氮槽，包括第一端部和第二端部，其中第一端部设置于所述液体喷淋设备下方，所述液氮槽的底板倾角Θ为1°~30° ;
[0026]一大孔径筛网，设置在所述液氮槽下方，将液氮槽第二端部滑落下来的颗粒筛分；
[0027]一小孔径筛网，设置在所述大孔径筛网下方，将从大孔径筛网漏下的颗粒再次筛分；
[0028]一小颗粒废料收集器，设置在小孔径筛网下方，收集从小孔径筛网漏下的颗粒；和
[0029]一液氮缓存罐，设置在所述液氮槽下方，用于储存未气化的液氮。
[0030]较佳的，所述的设备还包括:一小颗粒废料接收槽12，存放从小颗粒废料收集器收集的颗粒；一发酵剂终产品接收槽11，收集保留在小孔径筛网上的颗粒；一大颗粒废料接收槽10，收集保留在大孔径筛网上的颗粒。
[0031]较佳的，所述密封腔体设有真空保温夹层，顶部还包括一出气管路3。
[0032]较佳的，所述液氮缓存罐与一液氮泵连接，所述液氮泵通过管路将液氮输送到所述液氮槽的第一端部。
[0033]其中，较佳的，液体喷淋设备的喷料口为矩形，设有多个出料口，最佳的共设有50个出料口。较佳的，出料口内径2-3mm，相邻两个出料口之间间距20mm。以保证发酵剂颗粒制备效率，且防止生产中不同出料口滴出的菌液相互干扰造成对发酵剂颗粒外形的影响。
[0034]其中，较佳的，所述的液体喷淋设备上部的液体流经管道规格Φ30πιπι。
[0035]其中,较佳的,所述的大、小孔径筛网的筛孔直径为更佳为5-7mm。最佳地，大孔筛网和小孔筛网的筛孔直径分别为:Φ7_、Φ4_。本发明设置两种不同孔径的筛网，将所得的发酵剂颗粒进行筛选。通过筛网震荡，对制备后的发酵剂颗粒进行筛选。通过分级筛选，最终通过发酵剂终产品接收槽得到粒径近似的发酵剂颗粒。
[0036]本发明所得的发酵剂颗粒进行活菌计数，检测发酵剂颗粒中所含活菌数。较佳地，发酵剂颗粒活菌数为1.0X 101°~9.9X 10ncfU/mL，并将符合产品需求的发酵剂颗粒置于超低温冰箱或者液氮中进行保存。
[0037]在不违背本领域常识的`基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0038]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0039]本发明的积极进步效果在于:
[0040]1、本发明提供的生产多联乳酸菌发酵剂的方法与未经优化前的工艺相比，具有批次间产品性能更稳定，使用更方便，制备工艺较为简便，且获得的发酵剂颗粒均匀、外形较佳等优点。
[0041]2、本发明中发酵乳多联乳酸菌发酵剂的制备方法，采用发酵乳直投式发酵剂，除了含有保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)这两种酸奶发酵所需的乳酸菌，并含有其他一株或几株益生菌，有利于改善国内发酵剂市场同质化现象，应用前景十分广阔。
【专利附图】
【附图说明】
[0042]以下结合【专利附图】
【附图说明】本发明的特征和有益效果。
[0043]图1为液氮技术制备发酵剂颗粒优化后设备示意图。
[0044]1，液体喷淋设备；2，密封腔体；3，出气管路；4，液氮槽；5，大孔径筛网；6，小孔径筛网；7，小颗粒废料收集器；8，液氮泵；9，液氮缓存罐；10，大颗粒废料接收槽；11，发酵剂终产品接收槽；12，小颗粒废料接收槽。
[0045]图2为液氮槽横切图。[0046]图3为喷料口排列示意图。图3(A)为喷料口仰视图。图3(B)为喷料口侧视图。
[0047]图4为液氮技术制备的发酵剂颗粒图。图A为设备优化前发酵剂颗粒的图片，图B为设备优化后发酵剂颗粒的图片。
【具体实施方式】
[0048]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0049]所用菌种的来源名称规格为:
[0050]乳酸菌培养基:M17培养基，MRS培养基:德国Merck公司； [0051]保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)和双歧杆菌(Bifidobacterium):丹麦科?汉森公司；
[0052]植物乳杆菌(Lactobacilluspi ant arum ST-1II, CGMCC N0.0847)均由光明乳业研究院发酵剂研究室筛选保藏。
[0053]其他原料和试剂均市售可得。
[0054]实施例1液氮技术制备发酵剂的设备
[0055]图1是根据本发明的一个实施例的结构示意图。在该实施例中，液氮深冷造粒设备包括:一密封腔体2 液体喷淋设备1，设置于所述密封腔体顶部；一液氮槽4，包括第一端部和第二端部，其中第一端部设置于所述液体喷淋设备下方，所述液氮槽的底板倾角Θ为1°~30° ;—大孔径筛网5，设置在所述液氮槽下方，将液氮槽第二端部滑落下来的颗粒筛分；一小孔径筛网6，设置在所述大孔径筛网下方，将从大孔径筛网漏下的颗粒再次筛分；一小颗粒废料收集器7，设置在小孔径筛网下方，收集从小孔径筛网漏下的颗粒；一液氮缓存罐9，设置在所述液氮槽下方，用于储存未气化的液氮。
[0056]所述的液氮深冷造粒设备还可以包括:一小颗粒废料接收槽12，存放从小颗粒废料收集器收集的颗粒；一发酵剂终产品接收槽11，收集保留在小孔径筛网上的颗粒；一大颗粒废料接收槽10，收集保留在大孔径筛网上的颗粒。所述密封腔体2可以设有真空保温夹层，顶部可以包括一出气管路3。所述液氮缓存罐可以与一液氮泵8连接，所述液氮泵通过管路将液氮输送到所述液氮槽的第一端部。
[0057]其中，液氮槽横切图可见图2。液氮槽4内液氮层高度50_200mm，可以是100-150mm,以保证发酵剂在沉降过程中形成圆润、均匀颗粒，防止因液层过低造成发酵剂凝结成块现象。所述的液氮槽的长度可以为500~10000mm，宽度W可以为100~1000mm，高度H可以为100~400mm。长度也可以为500mm，宽度W也可以为100mm，高度H也可以为180mmo
[0058]其中，所述的液体喷淋设备I可如图3所示，其喷料口为矩形，设有多个出料口，可以共设有50个出料口 13。出料口内径可以是2-3mm，相邻两个出料口之间间距可以是20mm，以保证发酵剂颗粒制备效率，且防止生产中不同出料口滴出的菌液相互干扰造成对发酵剂颗粒外形的影响。
[0059]其中，所述的液体喷淋设备上部的液体流经管道(送料管道，即喷料口前段管道)规格可以是Φ30_。
[0060]其中，所述的大、小孔径筛网的直径为可以为5_7mm。大、小孔径筛网直径可与分别为:Φ7πιπι、Φ4πιπι。本发明设置两种不同孔径的筛网，将所得的发酵剂颗粒进行筛选。通过筛网震荡，对制备后的发酵剂颗粒进行筛选。通过分级筛选，最终通过发酵剂终产品接收槽11得到粒径近似的发酵剂颗粒。
[0061]本发明中，将含有保护剂的重悬菌液通过液氮深冷造粒设备加入液氮中制备发酵剂颗粒。其中本发明对原有液氮技术制备发酵剂设备(专利号:201210015940.9)进行优化，规定了液氮槽内液氮层高、浓缩发酵液流速、喷料口形状，并改进物料传送带及其传送方式。将原有物料传送带改装两个不同孔径震荡筛板，以上部件封闭在一个腔体内。震荡筛板下加装三个物料接收槽，其中两个为废料接收槽，另一个为发酵剂终产品接收槽。其他部件及制备流程参考专利CN201210015940.9原有设备规定参数保持不变。 [0062]液氮深冷造粒设备可实现乳酸菌在高密度培养、菌体浓缩、冻干保护剂添加等发酵剂制备常规工序后，将重悬得到的浓缩菌体通过液体喷淋设备I迅速以液滴的形式喷至装有一定倾角的液氮槽4中，瞬间实现乳酸菌的液氮深冷造粒；乳酸菌深冷发酵剂颗粒在液氮流冲击和重力势能作用下，顺着液氮槽4滑落至大孔筛网5上，在筛网震荡下，过筛落入小孔筛网6上，保留在小孔筛网上的颗粒即为发酵剂颗粒终产品，放入发酵剂颗粒终产品接收槽，接着进行定量分装；分装好的乳酸菌发酵剂颗粒，迅速放置于-40~-80°C的冷柜中储存。气化液氮通过密封腔体顶部的出气管路3直接排入室外，避免因室内氮气浓度过高所造成的人身伤害。
[0063]实施例2双联乳酸菌发酵剂
[0064]菌种组成及培养条件:
[0065]
―菌种I培养基_
嗜热链球菌M17/脱脂乳
保加利亚乳杆菌 Imrs/脱脂乳
[0066]
[0067]制备方法包括下列步骤:
[0068]1、单个菌种扩大培养
[0069](I)嗜热链球菌
[0070]I)将斜面保存的嗜热链球菌接种至IOmL的M17培养基中，42°C厌氧培养12h后得到的含有嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌株的M17培养基按2% (v/v)的接种量接种于500mL含有12% (wt)灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第1次扩培，培养温度42°C，培养时间10h。培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.2 ；
[0071]2)将步骤I)得到的液体按2% (v/v)的接种于20L含有12% (wt)灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第2次扩培，培养温度42°C，培养时间8h。培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.3 ；
[0072]3)将步骤2)得到的液体按5% (v/v)的接种量接入200L含有12% (wt)脱脂乳粉的灭菌水溶液中，进行第3次扩培，培养温度42°C，培养时间6h。
[0073]培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5 ;
[0074](2)德氏乳杆菌保加利亚亚种[0075]4)将斜面保存的德氏乳杆菌保加利亚亚种接种至IOmL的MRS培养基中，37°C厌氧培养12h后得到的含有德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的MRS培养基按2% (v/v)的接种量接种于500mL含有12% (wt)灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第1次扩培，培养温度37°C，培养时间10h。培养过程中，发酵罐均充入氮气,维持厌氧发酵，pH恒定在6.8 ；
[0076]5)将步骤4)得到的液体按2% (v/v)的接种量接种于20L含有12% (wt)灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第2次扩培，培养温度37°C，培养时间8h。培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.8 ；
[0077]2、菌体的收集
[0078]6)所使用菌体保护液由脱脂乳10%、蔗糖1.0%、海藻糖1.0%、甘油0.1%、柠檬酸钠
0.05%、单谷氨酸钠0.05%组成，所述的百分比为质量百分比，使用无菌水溶解；
[0079]7)将步骤3)得到的液体采用低温离心机，进行2000g，15min的离心，收集菌泥，用菌种保护液按10mL/g进行重悬，并搅拌均匀；
[0080]8)将步骤5)得到的液体采用低温离心机，进行2000g，15min的离心，收集菌泥，用菌种保护液按10mL/g进行重悬，并搅拌均匀；
[0081]3、多种单一菌体重悬液混合
[0082]9)将步骤7)和步骤8)得到的菌悬液进行计数；
[0083]10)将步骤7)和步骤8)得到的菌悬液按照嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus):德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)数量比例为10:1,进行混合,得到多菌悬浮液；
[0084]4、利用液氮制备发酵剂颗粒
[0085]11)将步骤10)得到的多菌悬浮液在液氮制备发酵剂设备(实施例1所示)上，通过送料管道(内径尺寸Φ30πιπι)以500mL/min流速，通过出料口 I (喷料口为矩形，设有50个出料口 ；出料口内径2mm，相邻两个出料口之间间距20mm)滴出；
[0086]12)多菌悬浮液通过出料口 I滴入液氮槽内4，其中液氮液层高50mm ;液氮槽长度为500mm,宽度W为100mm,高度H为180mm ；
[0087]13)在液氮瞬间造粒成型的发酵剂颗粒滑落到震荡筛网上，通过上下两层的两种不同孔径的筛网(7mm、4mm)进行分级筛选；
[0088]14)最终收集制得粒径约为4~7mm的发酵乳双联乳酸菌发酵剂；
[0089]5、保存和检测
[0090]15)采用平板计数法，对制得的发酵剂颗粒进行计数，进行记录，并将发酵剂置于液氮或者超低温冰箱中进行保存。
[0091]16)制得发酵乳双联乳酸菌发酵剂。检测所得发酵剂中乳酸菌存活量、存活率、颗粒的大小、圆润度。
[0092]实施例3三联乳酸菌发酵剂
[0093]菌种组成及培养条件:
[0094]
【权利要求】
1.一种液氮技术制备多联发酵剂的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤: (1)分别对单个菌种进行扩大培养； (2)从步骤(1)中扩大培养所得的菌体培养液中收集菌体； (3)将步骤(2)所得的菌体在菌体保护液中重新悬浮并混合均匀，得到单菌悬浮液； (4)将多种步骤(3)中所得的单菌悬浮液按照多种菌体混合的要求混合均匀，得到多菌悬浮液； (5)将步骤(4)所得的多菌悬浮液滴入液氮中，得到颗粒，所述的液氮的液层高度为50-200mm ； (6)将步骤(5)所得的颗粒进行筛选，即得发酵剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的菌体保护液包括10%~15%脱脂乳、1.0%~2.0%蔗糖、1.0%~2.0%海藻糖、0.1%~0.5%甘油、0.05%~0.15%柠檬酸钠和0.05%~0.15%单谷氨酸钠，更佳的包括12%脱脂乳，1.5%蔗糖、1.5%海藻糖，0.2%甘油，0.1%柠檬酸钠和0.1%单谷氨酸钠，所述的百分比为质量百分比。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的菌体保护液与菌体的混合比例为I~20mL/g，更佳为10-20mL/g。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的液氮的液层高度为100_150mm。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的多菌悬浮液滴入液氮的流速为 SOOmT ,/mi η ~10OOmT ,/mi η。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)和步骤(6)在以下所述的液氮深冷造粒设备中完成，所述液氣深冷造粒包括: 一密封腔体； 一液体喷淋设备，设置于所述密封腔体顶部； 一液氮槽，包括第一端部和第二端部，其中第一端部设置于所述液体喷淋设备下方，所述液氮槽的底板倾角Θ为1°~30° ; 一大孔径筛网，设置在所述液氮槽下方，将液氮槽第二端部滑落下来的颗粒筛分； 一小孔径筛网，设置在所述大孔径筛网下方，将从大孔径筛网漏下的颗粒再次筛分； 一小颗粒废料收集器，设置在小孔径筛网下方，收集从小孔径筛网漏下的颗粒；和 一液氮缓存罐，设置在所述液氮槽下方，用于储存未气化的液氮。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的液氮深冷造粒设备的喷料口为矩形，设有多个出料口。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述出料口的内径为2-3mm，相邻两个出料口之间间距20mm。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的液氮深冷造粒设备设置一大孔筛网和一小孔筛网，较佳地，直径为3_-10_，更佳的，大孔筛网和小孔筛网的筛孔直径分别为:Φ7πιπι.C>4mm。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的液氮深冷造粒设备的液体喷淋设备上部的液体流经管道的规格是Φ30πιπι。
【文档编号】C12R1/46GK103695339SQ201310676442
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】王钦博, 杭锋, 吴正钧, 韩瑨, 刘振民, 郭本恒, 穆海菠, 宋馨, 朱军伟 申请人:光明乳业股份有限公司
【专利摘要】本发明公开了一种液氮技术制备发酵剂的方法，其包括步骤：(1)分别对单个菌种进行扩大培养；(2)从步骤（1）中扩大培养所得的菌体培养液中收集菌体；(3)将步骤（2）所得的菌体在菌体保护液中重新悬浮并混合均匀，得到单菌悬浮液；(4)将多种步骤（3）中所得的单菌悬浮液按照多种菌体混合的要求混合均匀，得到多菌悬浮液；(5)将步骤（4）所得的多菌悬浮液滴入液氮中，得到颗粒，所述的液氮的液层高度为50-200mm；(6)将步骤（5）所得的颗粒进行筛选，即得发酵剂。本发明提供的方法具有批次间产品性能更稳定，使用更方便，制备工艺较为简便，且获得的发酵剂颗粒均匀、外形较佳等优点。
【专利说明】一种液氮技术制备发酵剂的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品工业领域，特别涉及一种液氮技术制备发酵剂的方法。
【背景技术】
[0002]对于酸奶制作的研究，从最初的开始使用天然的混合菌株制备酸奶等乳制品，到筛选出性状优良的发酵菌种制备纯菌种液体发酵剂，再发展到现在易于保藏和运输的高效冻干直投式发酵剂的出现，标志着酸奶发酵剂研究的三个时代的更替。欧美许多国家在20世纪初就已经开始对发酵剂进行研究，
[0003]至今在发酵剂的领域中已取得举世瞩目的成就，浓缩发酵剂已实现了专业化、商品化生产，并成功的应用于发酵乳制品的生产以及保健型乳酸菌制剂的研制，涌现出一批知名的实力强劲的发酵剂制造商，如丹麦的科汉森公司和法国的罗地亚公司等。最初研制成的是冷冻浓缩乳酸菌发酵剂，即将乳酸菌通过浓缩培养、离心收集等手段制成高浓度菌体的浓缩型菌悬液，添加抗冻保护剂后在低于_70°C的低温条件下速冻，再置于低温下深冻保藏而成。
[0004]伴随真空冷冻干燥技术的日益成熟，在九十年代初，又相继开发出了浓缩型的真空冻干发酵剂，即将冻结后的浓缩菌悬液通过添加冻干保护剂，在真空低温的条件下将水分升华干燥，制成干燥粉末状的固体发酵剂，也叫直投式发酵剂(DirectvatsetjVS)。这种发酵剂具有较多优点:菌种活力强，浓度高，菌数能高达IOltl~1012cfu/g、发酵性能稳定、生产工艺易于控制，生长周期较短、保藏方便、在4°C常压保藏I年以上仍然具有很强的活力、体积较小，运输方便等等。因此随着直投式发酵剂的出现，酸奶产业得到了进一步的加速发展越来越多的发酵乳生产厂家开始使用浓缩型冻干发酵剂，其中也包括国内大多数大规模的乳制品公司；而我国由于起步较晚，研究水平还与西方国家有一定的差距，但随着国内乳制品市场需求量逐年增长，`许多科研部门和高校实验室都开始加紧对乳品发酵剂的研究和生产，并取得了一定的进展。
[0005]发酵剂中的性状优异的乳酸菌菌种是制备高品质酸奶的关键，保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)是发酵剂中的常用菌种。随着对酸奶益生作用的越来越重视和对乳酸菌菌种研究的深入，嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)也越来越多的应用在酸奶发酵剂中。另有一些益生菌发酵乳制品已经成功的推向市场。如芬兰Valio公司开发的L.GG，法国达能公司开发的L.casei Immunitas,法国罗地亚公司开发的L.acidophilus NCFM,日本Yakult公司开发的L.casei Shirota,丹麦汉森公司的L.acidophilusLA-Ι和LA-2,光明乳业股份有限公司的具降高血压功能的Lactobacillus casei LC2W (EP1642963B1 )、降血脂功能的Lactobacillus casei BD-1I (US Patent7270994),降血清胆固醇功能的 LactobacillusPlantarum ST-1II (ZL200410066891.7、ZL03116377.7)等。
[0006]全球益生菌市场年增长率达9%，中国地区销售额达到50亿欧元，占全球市场份额的四分之一。但我国发酵乳制品行业直投式发酵剂市场长期为国外发酵剂公司所垄断，益生菌发酵剂市场更是为国外公司所完全占有。
[0007]另外，真空冷冻干燥发酵剂具有活菌含量高、易保存管理、更强的稳定性和乳酸菌活力的特点，可直投式使用，是当今发酵剂的主要产品形式。但是，由于在冻干过程对菌体产生损伤，且能耗较大等因素，冻干菌粉菌株存在复活时间较长和成本较高的弊端，对于发酵剂制备需要寻求一种菌体受损伤较小的试验方法和工艺，来优化完善直投式发酵剂的工业制备。使用液氮冷冻浓缩造粒，发酵剂制备工艺方面较冷冻干燥技术简单方便，且耗时较短，制备的发酵剂均复水性较佳，结构较为均匀；在菌体存活率方面，使用保护液制备的液氮菌粒较冻干菌粉有显著优势，能够避免冻干过程中对菌体的损伤。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种新的液氮技术制备多联发酵剂的方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
[0009]本发明中，所述的制备方法优化了液氮技术制备多联发酵剂的方法，保证制备的发酵剂的乳酸菌有较高存活率，制备工艺较为简便，且获得的发酵剂颗粒均匀、外形较佳，有利于改善国内发酵剂市场同质化现象。
[0010]本发明提供的技术方案是:一种如前所述的液氮技术制备多联发酵剂的方法，所述的制备方法包括如下步骤:
[0011](I)分别对单个菌种进行扩大培养；
[0012](2)从步骤(1)中扩大培养所得的菌体培养液中收集菌体；
[0013](3)将步骤(2)所得的菌体在菌体保护液中重新悬浮并混合均匀，得到单菌悬浮液；
[0014](4)将多种步骤(3)中所得的单菌悬浮液按照多种菌体混合的要求混合均匀，得到多菌悬浮液；
[0015](5)将步骤(4)所得的多菌悬浮液滴入液氮中，得到颗粒，所述的液氮的液层高度为 50-200mm ；
[0016](6)将步骤(5)所得的颗粒进行筛选，即得发酵剂。
[0017]本发明中，步骤(1)为分别对单个菌种进行扩大培养。本发明中，所述的扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，最终获得一定数量和质量的纯种过程。本发明中，步骤(1)所述的扩大培养为本领域常规，较佳地，扩大培养一到四次，最佳地，扩大培养三次。较佳的，按本领域常规，菌种经过复苏后进行扩大培养。所述的复苏是指通过菌种的扩大培养，将处于休眠状态的生产菌种接入无菌培养基活化后，最终获得一定数量和质量的纯种微生物。所述的复苏的方式是本领域常规方法。本发明中所述的复苏和扩大培养中涉及到的培养基、培养条件、pH、接种量、发酵温度、发酵时间等均为实验室常规培养乳酸菌的试验参数。本发明中所述的菌种是指发酵过程中作为活细胞催化物的微生物。所述的菌种较佳的为本领域常规的乳酸菌菌种，更佳地包括保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和一种或几种益生菌,所述的益生菌为双歧杆菌(Bifidobacterium)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) ST-1II。[0018]本发明中，步骤(2)是从步骤(1)中扩大培养所得的菌体培养液中收集菌体。其中，所述的收集菌体的方法是常规的，将步骤(1)中扩大培养所得的菌体培养液进行固液分离即可，一般包括过滤，低温离心等；较佳地，本发明中采用低温离心方法并回收沉淀。较佳地，离心条件为2000g~12000g，最佳地，离心条件为5000g ;较佳的，离心时间为5~15min,最佳地,离心时间为lOmin。
[0019]本发明中，步骤(3)是将步骤(2)所得的菌体在菌体保护液中重新悬浮并混合均匀，得到单菌悬浮液。其中，所述的菌体保护液为本领域常规，是一种减少渗透压、或者液体环境中其他不利于菌体存活因素的影响的保护液体。所述菌体保护液较佳地包括10%~15%脱脂乳、1.0%~2.0%蔗糖、1.0%~2.0%海藻糖、0.1%~0.5%甘油、0.05%~0.15%柠檬酸钠和0.05%~0.15%单谷氨酸钠，所述的百分比为质量百分比。更佳的所述菌体保护液包括12%脱脂乳，1.5%蔗糖、1.5%海藻糖，0.2%甘油，0.1%柠檬酸钠和0.1%单谷氨酸钠，所述的百分比为质量百分比。所述的菌体保护液与菌体(湿菌泥)混合比例I~20mL/g，更佳为 10-20mL/g,最佳为 10mL/g。
[0020]本发明中，步骤(4)是将多种步骤(3)中所得的单菌悬浮液按照多种菌体混合的要求混合均匀，得到多菌悬浮液。其中，所述的单菌悬浮液包括多种菌种，较佳的包括多种常规的乳酸菌菌种，更加的包括保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和一种或几种其他益生菌。较佳地，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)数量混合比例为1:1~10:1，发酵乳中嗜热链球菌总数与保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌ST-1II总数的比例为1:1~1000:1，每株益生菌与保加利亚乳杆菌数量混合比例为1:1~10:1。
[0021]本发明中，步骤(5)是将步骤(4)所得的多菌悬浮液滴入液氮中，得到颗粒。步骤
(6)是将步骤(5)中的发酵剂颗粒进行筛选，筛选出颗粒均匀、圆润、粒径大小近似的发酵剂颗粒。其中，所述的发酵剂颗粒为一种用于酸奶、酸牛乳酒、奶油、干酪和其他发酵产品生产的细菌以及其他微生物培养物的固体颗粒。较佳的，步骤(5)和(6)中所述液氮的液层高度为50-200mm,最佳地,高度为100_150mm。以保证发酵剂在沉降过程中形成圆润、均匀颗粒，防止因液层过低造成发酵剂凝结成块现象。较佳地，所述的菌体保护液滴入液氮的流速为500mL/min~1000mL/min,最佳地,流速为750mL/min。较佳的,所述的液氮槽的长度为500~10000mm，宽度W为100~1000mm，高度H为100~400_。更佳的，长度为500_，宽度W为100mm，高度H为180mm。较佳地，步骤(5)和步骤(6)在以下所述的液氮深冷造粒设备中完成:
[0022]所述液氮深冷造粒包括:
[0023]一密封腔体；
[0024]一液体喷淋设备，设置于所述密封腔体顶部；
[0025]一液氮槽，包括第一端部和第二端部，其中第一端部设置于所述液体喷淋设备下方，所述液氮槽的底板倾角Θ为1°~30° ;
[0026]一大孔径筛网，设置在所述液氮槽下方，将液氮槽第二端部滑落下来的颗粒筛分；
[0027]一小孔径筛网，设置在所述大孔径筛网下方，将从大孔径筛网漏下的颗粒再次筛分；
[0028]一小颗粒废料收集器，设置在小孔径筛网下方，收集从小孔径筛网漏下的颗粒；和
[0029]一液氮缓存罐，设置在所述液氮槽下方，用于储存未气化的液氮。
[0030]较佳的，所述的设备还包括:一小颗粒废料接收槽12，存放从小颗粒废料收集器收集的颗粒；一发酵剂终产品接收槽11，收集保留在小孔径筛网上的颗粒；一大颗粒废料接收槽10，收集保留在大孔径筛网上的颗粒。
[0031]较佳的，所述密封腔体设有真空保温夹层，顶部还包括一出气管路3。
[0032]较佳的，所述液氮缓存罐与一液氮泵连接，所述液氮泵通过管路将液氮输送到所述液氮槽的第一端部。
[0033]其中，较佳的，液体喷淋设备的喷料口为矩形，设有多个出料口，最佳的共设有50个出料口。较佳的，出料口内径2-3mm，相邻两个出料口之间间距20mm。以保证发酵剂颗粒制备效率，且防止生产中不同出料口滴出的菌液相互干扰造成对发酵剂颗粒外形的影响。
[0034]其中，较佳的，所述的液体喷淋设备上部的液体流经管道规格Φ30πιπι。
[0035]其中,较佳的,所述的大、小孔径筛网的筛孔直径为更佳为5-7mm。最佳地，大孔筛网和小孔筛网的筛孔直径分别为:Φ7_、Φ4_。本发明设置两种不同孔径的筛网，将所得的发酵剂颗粒进行筛选。通过筛网震荡，对制备后的发酵剂颗粒进行筛选。通过分级筛选，最终通过发酵剂终产品接收槽得到粒径近似的发酵剂颗粒。
[0036]本发明所得的发酵剂颗粒进行活菌计数，检测发酵剂颗粒中所含活菌数。较佳地，发酵剂颗粒活菌数为1.0X 101°~9.9X 10ncfU/mL，并将符合产品需求的发酵剂颗粒置于超低温冰箱或者液氮中进行保存。
[0037]在不违背本领域常识的`基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0038]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0039]本发明的积极进步效果在于:
[0040]1、本发明提供的生产多联乳酸菌发酵剂的方法与未经优化前的工艺相比，具有批次间产品性能更稳定，使用更方便，制备工艺较为简便，且获得的发酵剂颗粒均匀、外形较佳等优点。
[0041]2、本发明中发酵乳多联乳酸菌发酵剂的制备方法，采用发酵乳直投式发酵剂，除了含有保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)这两种酸奶发酵所需的乳酸菌，并含有其他一株或几株益生菌，有利于改善国内发酵剂市场同质化现象，应用前景十分广阔。
【专利附图】
【附图说明】
[0042]以下结合【专利附图】
【附图说明】本发明的特征和有益效果。
[0043]图1为液氮技术制备发酵剂颗粒优化后设备示意图。
[0044]1，液体喷淋设备；2，密封腔体；3，出气管路；4，液氮槽；5，大孔径筛网；6，小孔径筛网；7，小颗粒废料收集器；8，液氮泵；9，液氮缓存罐；10，大颗粒废料接收槽；11，发酵剂终产品接收槽；12，小颗粒废料接收槽。
[0045]图2为液氮槽横切图。[0046]图3为喷料口排列示意图。图3(A)为喷料口仰视图。图3(B)为喷料口侧视图。
[0047]图4为液氮技术制备的发酵剂颗粒图。图A为设备优化前发酵剂颗粒的图片，图B为设备优化后发酵剂颗粒的图片。
【具体实施方式】
[0048]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0049]所用菌种的来源名称规格为:
[0050]乳酸菌培养基:M17培养基，MRS培养基:德国Merck公司； [0051]保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)和双歧杆菌(Bifidobacterium):丹麦科?汉森公司；
[0052]植物乳杆菌(Lactobacilluspi ant arum ST-1II, CGMCC N0.0847)均由光明乳业研究院发酵剂研究室筛选保藏。
[0053]其他原料和试剂均市售可得。
[0054]实施例1液氮技术制备发酵剂的设备
[0055]图1是根据本发明的一个实施例的结构示意图。在该实施例中，液氮深冷造粒设备包括:一密封腔体2 液体喷淋设备1，设置于所述密封腔体顶部；一液氮槽4，包括第一端部和第二端部，其中第一端部设置于所述液体喷淋设备下方，所述液氮槽的底板倾角Θ为1°~30° ;—大孔径筛网5，设置在所述液氮槽下方，将液氮槽第二端部滑落下来的颗粒筛分；一小孔径筛网6，设置在所述大孔径筛网下方，将从大孔径筛网漏下的颗粒再次筛分；一小颗粒废料收集器7，设置在小孔径筛网下方，收集从小孔径筛网漏下的颗粒；一液氮缓存罐9，设置在所述液氮槽下方，用于储存未气化的液氮。
[0056]所述的液氮深冷造粒设备还可以包括:一小颗粒废料接收槽12，存放从小颗粒废料收集器收集的颗粒；一发酵剂终产品接收槽11，收集保留在小孔径筛网上的颗粒；一大颗粒废料接收槽10，收集保留在大孔径筛网上的颗粒。所述密封腔体2可以设有真空保温夹层，顶部可以包括一出气管路3。所述液氮缓存罐可以与一液氮泵8连接，所述液氮泵通过管路将液氮输送到所述液氮槽的第一端部。
[0057]其中，液氮槽横切图可见图2。液氮槽4内液氮层高度50_200mm，可以是100-150mm,以保证发酵剂在沉降过程中形成圆润、均匀颗粒，防止因液层过低造成发酵剂凝结成块现象。所述的液氮槽的长度可以为500~10000mm，宽度W可以为100~1000mm，高度H可以为100~400mm。长度也可以为500mm，宽度W也可以为100mm，高度H也可以为180mmo
[0058]其中，所述的液体喷淋设备I可如图3所示，其喷料口为矩形，设有多个出料口，可以共设有50个出料口 13。出料口内径可以是2-3mm，相邻两个出料口之间间距可以是20mm，以保证发酵剂颗粒制备效率，且防止生产中不同出料口滴出的菌液相互干扰造成对发酵剂颗粒外形的影响。
[0059]其中，所述的液体喷淋设备上部的液体流经管道(送料管道，即喷料口前段管道)规格可以是Φ30_。
[0060]其中，所述的大、小孔径筛网的直径为可以为5_7mm。大、小孔径筛网直径可与分别为:Φ7πιπι、Φ4πιπι。本发明设置两种不同孔径的筛网，将所得的发酵剂颗粒进行筛选。通过筛网震荡，对制备后的发酵剂颗粒进行筛选。通过分级筛选，最终通过发酵剂终产品接收槽11得到粒径近似的发酵剂颗粒。
[0061]本发明中，将含有保护剂的重悬菌液通过液氮深冷造粒设备加入液氮中制备发酵剂颗粒。其中本发明对原有液氮技术制备发酵剂设备(专利号:201210015940.9)进行优化，规定了液氮槽内液氮层高、浓缩发酵液流速、喷料口形状，并改进物料传送带及其传送方式。将原有物料传送带改装两个不同孔径震荡筛板，以上部件封闭在一个腔体内。震荡筛板下加装三个物料接收槽，其中两个为废料接收槽，另一个为发酵剂终产品接收槽。其他部件及制备流程参考专利CN201210015940.9原有设备规定参数保持不变。 [0062]液氮深冷造粒设备可实现乳酸菌在高密度培养、菌体浓缩、冻干保护剂添加等发酵剂制备常规工序后，将重悬得到的浓缩菌体通过液体喷淋设备I迅速以液滴的形式喷至装有一定倾角的液氮槽4中，瞬间实现乳酸菌的液氮深冷造粒；乳酸菌深冷发酵剂颗粒在液氮流冲击和重力势能作用下，顺着液氮槽4滑落至大孔筛网5上，在筛网震荡下，过筛落入小孔筛网6上，保留在小孔筛网上的颗粒即为发酵剂颗粒终产品，放入发酵剂颗粒终产品接收槽，接着进行定量分装；分装好的乳酸菌发酵剂颗粒，迅速放置于-40~-80°C的冷柜中储存。气化液氮通过密封腔体顶部的出气管路3直接排入室外，避免因室内氮气浓度过高所造成的人身伤害。
[0063]实施例2双联乳酸菌发酵剂
[0064]菌种组成及培养条件:
[0065]
―菌种I培养基_
嗜热链球菌M17/脱脂乳
保加利亚乳杆菌 Imrs/脱脂乳
[0066]
[0067]制备方法包括下列步骤:
[0068]1、单个菌种扩大培养
[0069](I)嗜热链球菌
[0070]I)将斜面保存的嗜热链球菌接种至IOmL的M17培养基中，42°C厌氧培养12h后得到的含有嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌株的M17培养基按2% (v/v)的接种量接种于500mL含有12% (wt)灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第1次扩培，培养温度42°C，培养时间10h。培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.2 ；
[0071]2)将步骤I)得到的液体按2% (v/v)的接种于20L含有12% (wt)灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第2次扩培，培养温度42°C，培养时间8h。培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.3 ；
[0072]3)将步骤2)得到的液体按5% (v/v)的接种量接入200L含有12% (wt)脱脂乳粉的灭菌水溶液中，进行第3次扩培，培养温度42°C，培养时间6h。
[0073]培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5 ;
[0074](2)德氏乳杆菌保加利亚亚种[0075]4)将斜面保存的德氏乳杆菌保加利亚亚种接种至IOmL的MRS培养基中，37°C厌氧培养12h后得到的含有德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的MRS培养基按2% (v/v)的接种量接种于500mL含有12% (wt)灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第1次扩培，培养温度37°C，培养时间10h。培养过程中，发酵罐均充入氮气,维持厌氧发酵，pH恒定在6.8 ；
[0076]5)将步骤4)得到的液体按2% (v/v)的接种量接种于20L含有12% (wt)灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第2次扩培，培养温度37°C，培养时间8h。培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.8 ；
[0077]2、菌体的收集
[0078]6)所使用菌体保护液由脱脂乳10%、蔗糖1.0%、海藻糖1.0%、甘油0.1%、柠檬酸钠
0.05%、单谷氨酸钠0.05%组成，所述的百分比为质量百分比，使用无菌水溶解；
[0079]7)将步骤3)得到的液体采用低温离心机，进行2000g，15min的离心，收集菌泥，用菌种保护液按10mL/g进行重悬，并搅拌均匀；
[0080]8)将步骤5)得到的液体采用低温离心机，进行2000g，15min的离心，收集菌泥，用菌种保护液按10mL/g进行重悬，并搅拌均匀；
[0081]3、多种单一菌体重悬液混合
[0082]9)将步骤7)和步骤8)得到的菌悬液进行计数；
[0083]10)将步骤7)和步骤8)得到的菌悬液按照嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus):德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)数量比例为10:1,进行混合,得到多菌悬浮液；
[0084]4、利用液氮制备发酵剂颗粒
[0085]11)将步骤10)得到的多菌悬浮液在液氮制备发酵剂设备(实施例1所示)上，通过送料管道(内径尺寸Φ30πιπι)以500mL/min流速，通过出料口 I (喷料口为矩形，设有50个出料口 ；出料口内径2mm，相邻两个出料口之间间距20mm)滴出；
[0086]12)多菌悬浮液通过出料口 I滴入液氮槽内4，其中液氮液层高50mm ;液氮槽长度为500mm,宽度W为100mm,高度H为180mm ；
[0087]13)在液氮瞬间造粒成型的发酵剂颗粒滑落到震荡筛网上，通过上下两层的两种不同孔径的筛网(7mm、4mm)进行分级筛选；
[0088]14)最终收集制得粒径约为4~7mm的发酵乳双联乳酸菌发酵剂；
[0089]5、保存和检测
[0090]15)采用平板计数法，对制得的发酵剂颗粒进行计数，进行记录，并将发酵剂置于液氮或者超低温冰箱中进行保存。
[0091]16)制得发酵乳双联乳酸菌发酵剂。检测所得发酵剂中乳酸菌存活量、存活率、颗粒的大小、圆润度。
[0092]实施例3三联乳酸菌发酵剂
[0093]菌种组成及培养条件:
[0094]
【权利要求】
1.一种液氮技术制备多联发酵剂的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤: (1)分别对单个菌种进行扩大培养； (2)从步骤(1)中扩大培养所得的菌体培养液中收集菌体； (3)将步骤(2)所得的菌体在菌体保护液中重新悬浮并混合均匀，得到单菌悬浮液； (4)将多种步骤(3)中所得的单菌悬浮液按照多种菌体混合的要求混合均匀，得到多菌悬浮液； (5)将步骤(4)所得的多菌悬浮液滴入液氮中，得到颗粒，所述的液氮的液层高度为50-200mm ； (6)将步骤(5)所得的颗粒进行筛选，即得发酵剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的菌体保护液包括10%~15%脱脂乳、1.0%~2.0%蔗糖、1.0%~2.0%海藻糖、0.1%~0.5%甘油、0.05%~0.15%柠檬酸钠和0.05%~0.15%单谷氨酸钠，更佳的包括12%脱脂乳，1.5%蔗糖、1.5%海藻糖，0.2%甘油，0.1%柠檬酸钠和0.1%单谷氨酸钠，所述的百分比为质量百分比。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的菌体保护液与菌体的混合比例为I~20mL/g，更佳为10-20mL/g。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的液氮的液层高度为100_150mm。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的多菌悬浮液滴入液氮的流速为 SOOmT ,/mi η ~10OOmT ,/mi η。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)和步骤(6)在以下所述的液氮深冷造粒设备中完成，所述液氣深冷造粒包括: 一密封腔体； 一液体喷淋设备，设置于所述密封腔体顶部； 一液氮槽，包括第一端部和第二端部，其中第一端部设置于所述液体喷淋设备下方，所述液氮槽的底板倾角Θ为1°~30° ; 一大孔径筛网，设置在所述液氮槽下方，将液氮槽第二端部滑落下来的颗粒筛分； 一小孔径筛网，设置在所述大孔径筛网下方，将从大孔径筛网漏下的颗粒再次筛分； 一小颗粒废料收集器，设置在小孔径筛网下方，收集从小孔径筛网漏下的颗粒；和 一液氮缓存罐，设置在所述液氮槽下方，用于储存未气化的液氮。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的液氮深冷造粒设备的喷料口为矩形，设有多个出料口。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述出料口的内径为2-3mm，相邻两个出料口之间间距20mm。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的液氮深冷造粒设备设置一大孔筛网和一小孔筛网，较佳地，直径为3_-10_，更佳的，大孔筛网和小孔筛网的筛孔直径分别为:Φ7πιπι.C>4mm。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的液氮深冷造粒设备的液体喷淋设备上部的液体流经管道的规格是Φ30πιπι。
【文档编号】C12R1/46GK103695339SQ201310676442
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】王钦博, 杭锋, 吴正钧, 韩瑨, 刘振民, 郭本恒, 穆海菠, 宋馨, 朱军伟 申请人:光明乳业股份有限公司
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