知母皂苷aⅲ的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种知母皂苷AⅢ的制备方法。该方法将市售的中药知母饮片或者新鲜采集的知母根茎或须根为原料，采用醇提、酶解、萃取、树脂及硅胶柱层析、结晶组合工艺制得知母皂苷AⅢ。本发明方法制备的知母皂苷AⅢ的纯度高于90%，适用于大量制备知母皂苷AⅢ。
【专利说明】知母皂苷AIII的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用酶解制备知母皂苷AIII的方法。
【背景技术】
[0002]中药知母为百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloides Bunge)的干燥根莖，主产于河北、内蒙古等地，有清热泻火、滋阴润燥的功效。知母的化学成分主要为皂苷、黄酮类成分，其中留体皂苷类为主要成分，其在根茎中的量约为6%，目前已经发现了有40多种甾体皂苷。 [0003]知母中知母皂苷B II的含量是最高的，其结构如图1。《中国药典》2010版规定知母药材含知母皂苷B II不少于3.0% ;而文献报道(不同产地知母药材中芒果苷和知母皂苷B II的含量测定，中国实验方剂学杂志，2010年第16期49-51页)药材中含知母皂苷B II多在5%左右，最高测得含量达10.25%。
[0004]知母皂苷AIII的结构如图2。与知母皂苷B II相比，二者的结构仅在甾体皂苷C-22位不同，知母皂苷B II为呋留皂苷元，知母皂苷A III为螺留皂苷元，为知母皂苷B II脱糖后的产物。知母药材含知母皂苷AIII较少，一般仅为0.3%左右，仅为知母皂苷B II的1/20(见色谱图4)。
[0005]采用传统的酸水解的方法将知母皂苷B II水解为知母皂苷AIII，化学反应强烈，条件不容易控制，而且在酸性的条件下，知母皂苷B II极易水解为菝葜皂苷元(结构见图3)。
【发明内容】
[0006]针对知母药材中知母皂苷A III含量低，传统酸水解提取方法不能大量制备知母皂苷A III的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种高效的、以酶转化法制备知母皂苷AIII的新方法。
[0007]根据实施例，本发明提供的知母皂苷A III的制备方法，包括以下步骤:
[0008](I)将市售的中药知母饮片或者新鲜采集的知母根茎或须根为原料，用丙酮水溶液或体积浓度为50-90%乙醇水溶液加热回流提取或者超声提取，浓缩，制得知母提取物；
[0009](2)将步骤(1)制得的知母提取物通过大孔树脂吸附法分离，使知母提取物的离心上清液或过滤液通过大孔吸附树脂，用水洗去杂质，用量为柱体积的3-5倍；再用10%-90%的乙醇水溶液作为洗脱剂洗脱，用量为柱体积的3-7倍；
[0010](3)收集步骤(2)的洗脱液，真空干燥制得知母总皂苷；
[0011](4)酶解:以步骤(1)制得的知母提取物或步骤(3)制得的知母总皂苷为底物，与适量β -葡萄糖苷酶混合加入pH = 3.75-4.95的醋酸缓冲溶液中，在37.5-55.(TC水浴中反应1.0-3.0小时；
[0012](5)萃取:用正丁醇或者乙酸乙酯萃取3-6次，合并正丁醇或者乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂至干；
[0013](6)过柱:将步骤(5)的产物通过硅胶柱层析，分别用氯仿、甲醇和水洗脱，收集洗脱液；或将步骤(5)的产物通过AB8大孔树脂，以不同浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液；
[0014](7)结晶:减压回收洗脱液中有机溶剂，析晶，收集结晶，干燥，得到的酶解产物即为知母皂苷AIII。
[0015]根据一个实施例，本发明前述知母皂苷A III的制备方法的步骤(2)中大孔树脂吸附法所用吸附树脂为聚苯乙烯型大孔吸附树脂，譬如=DlOl型大孔吸附树脂、HPD100型大孔吸附树脂或AB-8型大孔吸附树脂。
[0016]根据一个实施例，本发明前述知母皂苷A III的制备方法的步骤(4)中葡萄糖苷酶采用游离酶的方式或固定化酶的方式加入。
[0017]本发明前述知母皂苷A III的制备方法中，原料和各工艺条件的考察/选取/验证和试验:
[0018]1、知母药材中知母皂苷B II和知母皂苷A III的含量测定
[0019]1.1色谱条件
[0020]知母皂苷B II色谱条件:色谱柱为Alltima?C18色谱柱；乙腈一水(25:75)为流动相；蒸发光散射检测器检测。
[0021]知母皂苷AIII色谱条件:色谱柱为Alltima?C18色谱柱；以甲醇一水(85:15)为流动相；蒸发光散射检测器检测。
[0022]1.2供试品的制备
[0023]1.2.1知母药材中知母皂苷AIII的供试品的制备。
[0024]取知母药材粉末(过40目筛)约0.3g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声提取30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀。滤过，取续滤液，即得。
[0025]1.2.2.知母药材中知母皂苷BII的供试品的制备。
[0026]取知母药材粉末(过40目筛)约0.15g，精密称定，置塞锥形瓶中，精密加入30%丙酮25ml，称定重量，超声提取30分钟，取出，放冷，再称定重量，用30%丙酮补足减失的重量，摇匀。滤过，取续滤液，即得。
[0027]三批药材含量测定数据，见表1。
[0028]表1.知母药材中B II和A III的含量测定结果
【权利要求】
1.一种知母皂苷A III的制备方法，其特征是，该方法包括以下步骤: (1)以市售的中药知母饮片或者新鲜采集的知母根茎或须根为原料，用丙酮水溶液或体积浓度为50-90%乙醇水溶液加热回流提取或者超声提取，浓缩，制得知母提取物； (2)将步骤(1)制得的知母提取物通过大孔树脂吸附法分离，使知母提取物的离心上清液或过滤液通过大孔吸附树脂，用水洗去杂质，用量为柱体积的3-5倍；再用10%-90%的乙醇水溶液作为洗脱剂洗脱，用量为柱体积的3-7倍； (3)收集步骤(2)的洗脱液，真空干燥制得知母总皂苷； (4)酶解:以步骤(1)制得的知母提取物或步骤(3)制得的知母总皂苷为底物，与适量β -葡萄糖苷酶混合加入pH = 3.75-4.95的醋酸缓冲溶液中，在37.5-55.(TC水浴中反应1.0-3.0 小时； (5)萃取:用正丁醇或者乙酸乙酯萃取3-6次，合并正丁醇或者乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂至干； (6)过柱:将步骤(5)的产物通过硅胶柱层析，分别用氯仿、甲醇和水洗脱，收集洗脱液；或将步骤(5)的产物通过AB8大孔树脂，以不同浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液； (7)结晶:减压回收洗脱液中有机溶剂，析晶，收集结晶，干燥，得到的酶解产物即为知母皂苷A III。
2.根据权利要求1所述的知母皂苷AIII的制备方法，其特征是，步骤(2)中大孔树脂吸附法所用吸附树脂为聚苯乙烯型大孔吸附树脂。
3.根据权利要求2所述的知母皂苷AIII的制备方法，其特征是，聚苯乙烯型大孔吸附树脂为DlOl型大孔吸附树脂、HPD100型大孔吸附树脂或AB-8型大孔吸附树脂。
4.根据权利要求1所述的知母皂苷AIII的制备方法，其特征是，步骤(4)中β-葡萄糖苷酶采用游离酶的方式或固定化酶的方式加入。
5.根据权利要求3所述的知母皂苷AIII的制备方法，其特征是，步骤(4)中醋酸缓冲溶液的PH值为3.80-4.80，水浴温度为45-53°C。
6.根据权利要求5所述的知母皂苷AIII的制备方法，其特征是，步骤(4)中水浴温度为50。。。
7.根据权利要求5所述的知母皂苷AIII的制备方法，其特征是，步骤(4)中醋酸缓冲溶液的PH值是4.8。
【文档编号】C12P33/20GK103540640SQ201210234803
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2012年7月9日 优先权日:2012年7月9日
【发明者】张彤, 刘艳平, 杨轶舜, 丁越, 蔡贞贞, 王如峰 申请人:上海中医药大学