专利名称：一种人鼻咽癌肿瘤干细胞系建立方法
技术领域：
本发明涉及生物及医学领域，具体地，本发明涉及一种人鼻咽癌肿瘤干细胞系建立方法。
背景技术：
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是指鼻咽腔表面的上皮或鼻咽隐窝上皮发生的上皮性恶性肿瘤。鼻咽癌发病具有地方性特点，我国是世界上鼻咽癌发病率最高的国家，而华南地区，尤其是广东及其临近地区如广西、香港等地是高发病区，发病率比其它大部分国家地区高100倍以上，因此也有“广东瘤”之称。目前鼻咽癌的发病机理尚不明确，有待进一步深入研究。干细胞(stem cell)是存在于动物和人的一种特殊功能细胞，具有多种分化能力和自我更新能力。干细胞生物学特性包括(I)全能性或多功能性，干细胞具有分化为多种类型细胞的潜能；(2)自我更新能力，干细胞一旦形成，在机体终生都具有自我更新能力，通过不均一分裂进行自我更新和产生分化祖细胞，维持机体组织器官的稳定性；(3)高度增殖能力，对于维持机体正常功能有着重要的作用。肿瘤干细胞(tumor stem cells，TSC)，也称为癌干细胞，为一种特殊类型的干细胞，TSC因为在各种致瘤因素的作用下，在基因水平失去对其生长的正常调控，而表现出无限增殖、转移、异质性等特点。肿瘤干细胞与干细胞有很多相似的特征(I)都具有无限增殖和分化的特点；(2)存在相似的调节自我更新的信号传导途径；(3)都具有不同表型，异质性；(4)都具有端粒酶活性，都能转移到各种不同的组织且有相似的归巢和转移途径。当然，TSC还具有不同于干细胞的特点(I)自我更新信号转导途径的负反馈机制已被破坏；
(2)缺乏分化成熟能力；(3)倾向于累积复制的错误，而干细胞能够防止复制错误的发展
坐寸o从肿瘤干细胞角度入手，对于鼻咽癌发病机理，诊断治疗方案等都可带来积极的推动作用。而目前对于鼻咽癌肿瘤干细胞系的建立及相关理论研究并不多见。
发明内容
针对目前鼻咽癌发病率高的问题，本发明提供一种建立人鼻咽癌肿瘤干细胞系的方法，以对鼻咽癌的诊断治疗起到推动和促进作用。本发明的目的通过以下技术手段得以实现
一种人鼻咽癌肿瘤干细胞系的建立方法，包括以下步骤
(1)获得单细胞状态的人鼻咽癌细胞；
(2)将步骤(I)得到的单细胞状态的人鼻咽癌细胞加入含表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的无血清干细胞培养基中，得单细胞悬液；
(3)将步骤(2)中的单细胞悬液浓度调整至900 1100/ml；
(4)将步骤(3)得到的单细胞悬液接种于细胞培养板中，再加入等体积干细胞培养基进行培养72 96h ；
(5)收集步骤(4)所得细胞，胰酶消化至单个细胞并进行传代培养。
本发明提供的鼻咽癌干细胞系建立方法，操作简便，得到的鼻咽干癌细胞系具有较强的克隆形成能力，具有较强的药物耐受性，较高的干性因子表达量，且对裸鼠有较强的致瘤能力，可用于鼻咽癌干细胞的发病机理和诊断治疗方面的研究。
图I为本发明实施例中使用不同鼻咽癌细胞CNE-2、SUNE-1、H0NE_1得到的球形成率；
图2显示了本发明实施例中使用的鼻咽癌细胞CNE-2与CNE-2s的细胞形态；
图3为本发明实施例中鼻咽癌细胞CNE-2与CNE-2s的克隆形成率比较；
图4为本发明实施例中鼻咽癌细胞CNE-2与CNE-2s对吉西他滨的耐受性比较；
图5为本发明实施例中鼻咽癌细胞CNE-2与CNE-2s表达干性因子的RT-PCR检测结果，其中柱状图中左侧为CNE-2，右侧为CNE-2s ；
图6为本发明实施例中鼻咽癌细胞CNE-2与CNE-2s对于裸鼠致瘤能力的比较。
具体实施例方式以下将结合附图通过具体实施例对本发明进行详述，应理解此处所述实施例仅出于解释本发明的目的而非对其进行限制。本发明提供一种人鼻咽癌肿瘤干细胞系的建立方法，包括以下步骤
(1)获得单细胞状态的人鼻咽癌细胞；
(2)将步骤(I)得到的单细胞状态的人鼻咽癌细胞加入含表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的无血清干细胞培养基中，得单细胞悬液；
(3)将步骤(2)中的单细胞悬液浓度调整至900 1100/ml；
(4)将步骤(3)得到的单细胞悬液接种于细胞培养板中，再加入等体积干细胞培养基进行培养72 96h ；
(5)收集步骤(4)所得细胞，胰酶消化至单个细胞并进行传代培养。本发明实施例中使用的人鼻咽癌细胞优选为对数生长期的细胞，对数生长期是指细胞在培养环境下经过了短暂的适应期，进而快速生长的时期，此时期营养充足，细胞处于最佳生长状态。在本发明实施例的培养选取及后来的检测鉴定中均选取对数生长期的细胞。更优选地，本发明实施例中使用的鼻咽癌细胞为CNE-2、SUNE-1或H0NE-1，更优选为CNE-2。其中CNE-2、SUNE-I或H0NE-1为低分化的鼻咽癌细胞，即恶性程度较高的鼻咽癌细胞，而在此三种鼻咽癌细胞中CNE-2的恶化程度最高。优选地，本发明实施例肿瘤干细胞筛选过程中使用的无血清干细胞培养基为DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle’s Medium/ Nutrient Mixture F12)。该 DMEM/F12培养基由DMEM和F12按I: I的体积比混合而成，该培养基能够在很多无血清培养体系中完美地支持细胞生长。该培养基可从市场购得。优选地，本发明实施例中使用的无血清干细胞培养基中含有表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。表皮生长因子(EGF)是一种广泛存在于人或其它动物体内的小分子多肽，极微量即能强烈刺激细胞生长、抑制衰老基因的出现，延缓表皮细胞衰老。表皮生长因子可激活多种下游信号路径，产生多种生物学效应，ras-raf-MEK-erk/MAPK途径与增殖的激活有关，P13K-PKC-IKK途径与细胞移动性的增强有关。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是含155个氨基酸的促有丝分裂的阳离子多肽，分子量为16 18. 5 KD。bFGF的生物学作用极其广泛，它在血管形成、促进创伤愈合与组织修复、促进组织再生和神经组织生长发育过程中起着十分重要的作用。本发明实施例中使用的无血清干细胞培养基中两者的浓度均为10 30ng/ml,最优选的浓度为20ng/ml。优选地，本发明实施例步骤(3)中调整细胞浓度通过血球计数板进行计数，调整后细胞浓度优选为1000/ml。细胞培养过程中，接种浓度过高会导致细胞生长一段时间后生长空间减少，最后细胞接触产生抑制细胞活性，不利于细胞达到最佳状态，而接种浓度过低会导致生长周期过长，延长了实验时间。优选地，本发明实施例步骤(4)中使用的细胞培养板为六孔板，向每孔中加入的单 细胞悬液的量为I 2ml/孔，优选浓度为Iml/孔。优选地,本发明实施例步骤(5)中使用的胰酶浓度为0. 2 0. 3%，胰酶的最优选浓度为0. 25%。实施例一鼻咽癌球形成细胞的获得
1.将鼻咽癌细胞CNE-2、SUNE-UH0NE-1以含10% FBS(胎牛血清，Gibco)加双抗的DMEM/F12 (Gibco)培养基置于37°C，5%C02 培养箱内培养；
2.分别选取对数生长期的鼻咽癌细胞CNE-2、SUNE-1、H0NE-1，用质量体积百分比浓度为0. 25%的胰酶消化为单细胞悬液，加适量含血清培养基终止胰酶消化作用，IOOOrpm离心5min，弃上清液，加入Iml的含表皮生长因子EGF和碱性成纤维细胞生长因子bFGF的无血清干细胞培养基，混匀，该培养基为DMEM/F12，其中EGF和bFGF的终浓度均为20ng/ml ；
3.细胞计数取20ul与20ul台盼蓝取混合后，取细胞计数板冲池，并计数四个大方格的细胞总数，细胞浓度为细胞数/ml=(四个大个细胞总数/4)2X 104，计数后将细胞浓度调整为1000/ml ；
4.取低黏附性六孔平板，将单细胞悬液以Iml/孔接种，再向每孔中加入Iml无血清干细胞培养基，37°C，5% CO2培养箱内培养2周，在显微镜下计数球形成细胞数量；
5.收集步骤4得到的球形成细胞，2000rpm离心5min,加入2ml磷酸缓冲液PBS清洗球形成细胞一次，加入Iml 0. 25%胰酶，得到絮状物，此时用枪头吹打为混悬液，放入37°C，5% CO2细胞培养箱内继续孵育5min，取出继续吹打几次，显微镜下观察为单个细胞悬液时，用含血清培养基终止消化，2000rpm 离心5min，弃上清液，加入Iml的干细胞培养基混悬细胞，并计数，计数方法同步骤3。6.将步骤5得到的细胞浓度调节为1000/ml，以2ml/孔接种于低粘附性六孔板于37°C, 5% CO2培养箱内培养14天，普通光学显微镜下计数各孔球形成细胞数量。结果如图I所示，得到的球形成细胞分别标记为CNE-2s、SUNE-Is、HONE-1 s，CNE2与CNE_2s细胞形态如图2所示(其余两种对比图未显示)。结果如图I所示,鼻咽癌细胞CNE-2中含有最高比例的球形成细胞,之后依次为H0NE-1和SUNE-1，因此本发明实施例中将从鼻咽癌细胞CNE-2、H0NE-1和SUNE-I中分选出鼻咽癌球形成细胞CNE-2s，并以CNE-2为对照，对CNE-2s进行肿瘤干细胞各项指标的检测，实验步骤及相应结果见实施例二至实施例五。实施例二鼻咽癌球形成细胞克隆形成能力检测
I.配制I. 2%和0. 6%琼脂溶液，高压灭菌，自然冷却至约450C。2.将含PBS (0. 01M)和双抗(青霉素的工作浓度为100U/ml，链霉素的工作浓度为 0.lmg/ml)的DMEM/F12培养基放入37°C水浴箱，温浴至37°C ；
3.分别取对数生长期鼻咽癌球形成细胞鼻咽癌球形成细胞CNE-2s、HONE-Is和SUNE-Is,以及用作参照的鼻咽癌细胞CNE-2、H0NE-1和SUNE-1，分别用0. 25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基调整细胞密度至I X IO6细胞/mL。然后作梯度倍比稀释为104/mL ；
4.按I:I比例使I. 2%的琼脂糖和2 X DMEM培养基(含有2 X抗生素和20%的胎牛血清)混合后，以2mL/孔混合液注入六孔平板内，冷却凝固，置37°C，5% CO2培养箱中备用。5.按I: I比例将0. 6%的琼脂糖和2 X DMEM培养基在无菌试管中混匀4. 2mL，再向管中分别加入0. 3mL步骤3中获得的104/mL细胞悬液，充分混匀，分别将悬液以约1000个/孔注入步骤4中获得的六孔平板内形成双琼脂层，待上层琼脂凝固后，置入37°C 5%C02培养箱中培养21天；
6.把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。按下式计算克隆形成率，实验结果取三次实验平均值。
克隆形成率=(克隆形成数/接种细胞数)X100%
结果 与CNE-2相比，实施例一获得的CNE-2S具有较强的克隆形成能力，如图3所示。实施例三鼻咽癌球形成细胞对抗肿瘤药物吉西他滨的耐药性
1.配制100iimol/mL吉西他滨溶液
吉西他滨分子量为299. 66，即29.966 mg/mL = 0. lmol/L，因此称取0. 2997g吉西他滨溶解于10ml DMEM/F12培养基中，过滤除菌，4°C保存备用；
2.分别收集对数生长期鼻咽癌球形成细胞CNE-2s、H0NE-ls和SUNE-ls，以及用作参照的鼻咽癌细胞CNE-2、H0NE-1和SUNE-1，并消化为单细胞悬液，对细胞计数，计数步骤同实施例一中步骤3，将细胞浓度调整为3X 104/mL ；
3.MTT检测两类细胞对吉西他滨的敏感性
(1)取对数生长期鼻咽癌球形成细胞CNE-2s、HONE-Is和SUNE-ls，以及鼻咽癌细胞CNE-2、H0NE-1和SUNE-1，各IOOul加入96孔培养板，分别加入以下浓度吉西他滨100 u I :0. Immol/L、0. 2 mmol /1,.0. 39 mmol /1,.0. 78 mmol/L> I. 56 mmol/L>3. 13 mmol /I,、
6.25 mmol/L、12.5 mmol/L、25 mmol/L、50 mmol/L,37 °C, 5% CO2，孵育 24 72h ;
(2)加入20ill MTT，继续孵育4h，IOOOrpm离心5min，弃上清液，加入150 yl DMS0，摇床混匀lOmin，酶标仪测定吸光度，以检查细胞存活率；
结果与CNE-2相比，实施例一获得的CNE-2s具有较强的吉西他滨药物耐受性，如图4所示。实施例四RT-PCR法检测干性因子表达 I.按下表I进行引物设计
表I
权利要求
1.一种人鼻咽癌肿瘤干细胞系的建立方法，包括以下步骤 (1)获得单细胞状态的人鼻咽癌细胞； (2)将步骤(I)得到的单细胞状态的人鼻咽癌细胞加入含表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的无血清干细胞培养基中，得单细胞悬液； (3)将步骤(2)中的单细胞悬液浓度调整至900 1100个/ml； (4)将步骤(3)得到的单细胞悬液接种于细胞培养板中，再加入等体积干细胞培养基进行培养72 96h ； (5)收集步骤(4)所得细胞，胰酶消化至单个细胞并进行传代培养。
2.如权利要求I所述的人鼻咽癌肿瘤干细胞系的建立方法，其特征在于，所述步骤(I)中使用的人鼻咽癌细胞为对数期人鼻咽癌细胞。
3.如权利要求I所述的人鼻咽癌肿瘤干细胞系的建立方法，其特征在于，所述步骤(I)中使用的人鼻咽癌细胞为CNE-2、SUNE-I或HONE-I。
4.如权利要求I或3所述的人鼻咽癌肿瘤干细胞系的建立方法，其特征在于，所述步骤(I)中使用的人鼻咽癌细胞为CNE-2。
5.如权利要求I所述的人鼻咽癌肿瘤干细胞系的建立方法，其特征在于，所述无血清干细胞培养基为DMEM/F12。
6.如权利要求I所述的人鼻咽癌肿瘤干细胞系的建立方法，其特征在于，所述含表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的无血清干细胞培养基中表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的浓度均为10 30 ng/ml。
7.如权利要求I所述的人鼻咽癌肿瘤干细胞系的建立方法，其特征在于，所述步骤(4)中的所述细胞培养板为六孔板。
8.如权利要求7所述的人鼻咽癌肿瘤干细胞系的建立方法，其特征在于，向所述六孔板中加入的单细胞悬液的量为I 2ml/孔。
9.如权利要求I所述的人鼻咽癌肿瘤干细胞系的建立方法，其特征在于，所述步骤(5)中的所述胰酶的质量体积百分比浓度为0. 25%。
全文摘要
本发明提供一种人鼻咽癌肿瘤干细胞系的建立方法，包括(1)获得单细胞状态的人鼻咽癌细胞；(2)将步骤(1)得到的单细胞状态的人鼻咽癌细胞加入含表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的无血清干细胞培养基中，得单细胞悬液；(3)将步骤(2)中的单细胞悬液浓度调整至900～1100个单细胞/ml；(4)将步骤(3)得到的单细胞悬液1ml接种于细胞培养板六孔板单孔中，再加入等体积干细胞培养基进行培养72～96h；(5)收集步骤(4)所得细胞，胰酶消化至单个细胞并进行传代培养。本发明提供的鼻咽癌干细胞系建立方法，操作简便，得到的鼻咽干癌细胞系的干细胞特征明显。
文档编号C12N5/095GK102732484SQ201210238190
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月10日 优先权日2012年7月10日
发明者冀天星, 周克元, 张鑫, 李彩虹, 李涛, 林碧华, 黄颖 申请人:广东医学院