专利名称：一种鸭肌肉发育调控基因mustn1及其编码的蛋白质和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于动物基因工程领域，具体涉及一种从北京鸭抑制消减杂交(SSH) cDNA文库中筛选出来的在肌肉组织中高表达的基因(MUSTN1, Musculoskeletal Embryonic Nuclear Proteinl)及其应用，同时还涉及一种该基因编码的蛋白质。
背景技术：
北京鸭是世界上著名的优良肉用鸭品种，具有生长发育快、育肥性能好的特点。北京鸭肉用性能尚低于国外优良肉鸭水平，其中骨骼肌发育时间晚且瘦肉率低是其最大的缺点。因此，筛选北京鸭肌肉发育相关基因，利用标记辅助选择技术(MAS)，对加速瘦肉型北京 鸭的育成具有重要的经济价值和社会意义。肌肉的发育是由众多基因共同调控的，利用抑制消减杂交技术可以分离到不同发育时期肌肉相关的差异表达基因。利用qRT-PCR可以分析差异表达基因在整个胸肌发育过程中的表达变化规律，进而推测基因的功能。MUSTNl基因是2004年首次发现的，该基因编码一种小核蛋白(LombardoF，Komatsu Dj Hadjiargyrou M. Molecular cloning and characterization of Mustang, anovel nuclear protein expressed during skeletal development and regeneration.FASEB. J，2004，18:52 - 61.)，该蛋白具有四个 AP-1 结构域(Liu Cj HadjiargyrouM. Identification and characterization of the Mustang promoter:regulationby AP-I during myogenic differentiation. Bone, 2006, 39:815824.)，在骨豁再生与发育中发挥重要作用。MUSTNl是一个肌肉特异性表达基因，也是一个成肌分化和肌融合的重要调节基因(Liu C，Gersch RP, Hawke TJj Hadjiargyrou M. Silencingof Mustnlinhibits myogenic fusion and differentiation. Am. J. Physiol. Cell.Physiol.，2010，298，CllOO-C1108.)，并对肌肉生长和发育具有促进作用。研究发现，MUSTNl基因能促进肉鸡和蛋鸡骨骼肌生长(Zheng Q, ZhangY, ChenY, Yang N, Wang XJj ZhuD.Systematic identification of genes involved in divergent skeletal musclegrowth rates of broiler and layer chickens. BMC. Genomics. , 2009, 10:87.), 也是导致羊骨盆、四肢及腰部骨骼肌肉肥大的差异表达上调基因之一(Vuocolo T, ByrneK, White Jj McWilliam S，Reverter A，Cockett NE，Tellam RL Identification of a genenetwork contributing to hypertrophy in callipyge skeletal muscle. Physiol.Genomics.，2007，28:253 - 272.)。同时，MUSTNl基因对肌肉损伤修复、软骨细胞的增殖与分化以及骨再生等都有一定作用(RobertP GiArifKj Lidia S，Gina S，Gerald HT. Mustnlisessential for craniofacial chondrogenesis during Xenopus development. Gene.Expr. Patterns.，2012，doi : 10. 1016/ j. gep. 2012. 01. 002.)
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸭肌肉发育调控基因MUSTN1。本发明的目的还在于提供了一种鸭肌肉发育调控基因在肌肉发育过程中的应用。另外，本发明的目的还在于提供了一种鸭肌肉发育调控基因MUSTNl编码的蛋白质。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种鸭肌肉发育调控基因MUSTN1，其cDNA序列与SEQ ID NO. I所示的序列一致。MUSTNl基因的cDNA序列长度为358bp，自38bp至274bp区段为其开放阅读框，编码78个氨基酸，r37bp区段为5’非编码区，275 358bp区段为3’非编码区。本发明的技术方案还采用了一种鸭肌肉发育调控基因MUSTNl编码的蛋白质，所含的氨基酸序列与SEQ ID NO. 2所示的序列一致。
更进一步地，本发明的技术方案还采用了一种鸭肌肉发育调控基因MUSTNl在胸肌发育调控过程中的应用。本发明是采用qRT-PCR技术分析了 MUSTNl基因在2、4、6和8周龄北京鸭胸肌组织中的表达情况。结果表明该基因在2、4、6周龄北京鸭胸肌组织中表达量逐渐增加，并在6周龄达到的最高峰，8周龄表达量又减少(如图I所示)，该基因的表达模式与北京鸭胸肌的实际发育情况一致，表明MUSTNl基因是北京鸭胸肌发育的正调控基因。用同样的方法分析了 MUSTNl基因在4周龄北京鸭胸肌、腿肌、心肌、肌胃、皮脂、肝脏和肾脏组织中的表达情况(如图2所示)，表明该基因主要在肌肉组织中表达。以上研究表明，MUSTNl对北京鸭胸肌的发育起重要的调控作用。
图I为本发明的鸭肌肉发育调控基因MUSTNl在2、4、6和8周龄北京鸭胸肌组织中的表达；图2为本发明的鸭肌肉发育调控基因MUSTNl在4周龄北京鸭胸肌、腿肌、心肌、肌胃、皮脂、肝脏和肾脏组织中的表达。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于以下实施例。I、样品的采集选择2周龄和6周龄发育正常的北京鸭Z5系母鸭各4只，另选择同一品系4周龄和8周龄发育正常的北京鸭母鸭各4只，屠宰后立即无菌采集胸肌组织，组织样品采集后立即投入液氮中保存备用。2、RNA提取及检测用Takara公司的RNAiso plus试剂盒提取组织总RNA，利用A260:A280确定RNA的纯度，通过O. 8%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。3、消减杂交(SSH)正反cDNA文库的构建和序列克隆正库以6周龄北京鸭胸肌组织为Tester，以2周龄北京鸭胸肌组织为Driver ;反库以2周龄北京鸭胸肌组织为Tester，以6周龄北京鸭胸肌组织为Driver。分别从4只2周龄北京鸭胸肌总RNA中取出2 μ 1，充分混合，制备成2周龄胸肌总RNA池；用同样的方法制备6周龄胸肌总RNA池。从制备的2周龄和6周龄北京鸭胸肌总RNA池中各取出I μ I用 Clontech 公司的 SMARTer Pico PCR cDNA Synthesis Kit 试剂盒合成 cDNA 第一链,然后用Advantage2PCR Kit试剂盒合成cDNA第二链；将合成的第二链用CHR0MASPIN-1000柱色谱纯化后，用Rsa I限制性内切酶消化、乙醇沉淀纯化，回收酶切完全的cDNA第二链。将Tester cDNA两端加上接头IR和2R，进行2次消减杂交和2轮PCR扩增，富集差异表达基因。回收纯化第二轮PCR产物后与PMD-19T载体(Takara)连接，转化感受态细胞DH5 α(Takara)，在含有AMP/IPTG/X_Gal的固体培养基上过夜培养，挑选白斑菌落震荡培养。4.差异表达克隆的测序、序列分析和Unigene功能注释对来自正、反库的克隆进行测序(ABI3730XL测序仪)，测序结果利用phred程序(版本phred_0. 020425. c)从峰图文件提取序列信息,运用cross_match (版本0· 990329)程序去除EST中的低质量序列、载体序列、重复序列，rRNA和污染序列。然后，使用phrap序列拼接软件(版本I. 080812)将上一步筛选到的高质量EST进行组装，得到Unigenes (包括单个的EST序列和叠连群)，并通过人工进行错误矫正。对Unigenes的分析主要包括以下 三个方面(I)用getorf软件(EMB0SS-4. I. O里面的软件)进行ORF预测；(2)通过BLAST比对进行Unigenes的基因注释；(3)对已经注释的Unigenes进行GO分析和KEGG分析。5.荧光实时定量PCR (qRT-PCR)分析分别将2、4、6和8周龄北京鸭的胸肌组织和4周龄北京鸭胸肌、腿肌、心肌、肌胃、皮脂、肝脏和肾脏组织的RNA各300ng用DNAse (Promega)处理，以去掉残存的基因组DNA，用Clontech公司的SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit试剂盒合成cDNA第一链，以这些cDNA第一链为摸板，采用Takara公司生产的SYBRD Premix Ex Taq II试剂盒进行荧光定量分析(Stratagene Mx3005P)，总的反应体系为20 μ 1，其中模板cDNA第一链I μ 1，IO'< S Y BR Premi X Ex Taq 2 μ 1，上、下游引物各 O. 7 μ 1，ddH207. 6 μ I。反应过程为 95°C预变性Imin ;然后94°C变性30s，退火30s，72°C延伸30s，42个循环。引物序列信息见表I。表1MUSTN1基因qRT-PCR的引物序列信息表
Tm 产物K.度
称O丨物卬列
(V) (bp)
5’ GCCCAGAACATTATCCCAG 3' 55.0 GAPDH 94 _ 5' AGCCCATTCCGGTAAAGC 3’ 57.5__
5* AAAAAGAAGCGTCCTCC 3' 49.3
MUSTNl................................................................................................................................................................................................................................................................................ 173
_ S1 AAGACTGTTTCACCTCCTG 3' 48.9 _序列表SEQUENCELISTING<110>中国农业科学院<120>一种鸭肌肉发育调控基因MUSTNl及其编码的蛋白质和应用<130>说明书
权利要求
1.一种鸭肌肉发育调控基因MUSTN1，其特征在于其CDNA序列与SEQID NO. I所示的序列一致。
2.根据权利要求I所述的鸭肌肉发育调控基因MUSTN1，其特征在于MUSTN1基因的cDNA序列长度为358bp，自38bp至274bp区段为其开放阅读框，编码78个氨基酸，I 37bp区段为5’非编码区，275 358bp区段为3’非编码区。
3.—种如权利要求I所述的鸭肌肉发育调控基因MUSTNl编码的蛋白质，其特征在于，所含的氨基酸序列与SEQ ID NO. 2所示的序列一致。
4.一种如权利要求I所述的鸭肌肉发育调控基因MUSTNl在胸肌发育调控过程中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种鸭肌肉发育调控基因MUSTN1及其编码的蛋白质和应用。鸭肌肉发育调控基因MUSTN1，其cDNA序列与SEQIDNO.１所示的序列一致。本发明是采用qRT-PCR技术分析了MUSTN1基因在2、4、6和8周龄北京鸭胸肌组织中的表达情况。结果表明该基因在2、4、6周龄北京鸭胸肌组织中表达量逐渐增加，并在6周龄达到的最高峰，8周龄表达量又减少(如图１所示)，该基因的表达模式与北京鸭胸肌的实际发育情况一致，表明MUSTN1基因是北京鸭胸肌发育的正调控基因。用同样的方法分析了MUSTN1基因在4周龄北京鸭胸肌、腿肌、心肌、肌胃、皮脂、肝脏和肾脏组织中的表达情况(如图２所示)，表明该基因主要在肌肉组织中表达。以上研究表明，MUSTN1对北京鸭胸肌的发育起重要的调控作用。
文档编号C12Q1/68GK102816767SQ201210238148
公开日2012年12月12日 申请日期2012年7月9日 优先权日2012年7月9日
发明者徐铁山, 侯水生, 张小辉, 叶保国, 黄苇, 谢明, 喻俊英 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 河南科技大学, 海南省农业科学院畜牧兽医研究所