专利名称：沙门氏菌肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌pcr焦磷酸法的检测引物试剂盒和检测方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌PCR-焦磷酸法的检测引物、试剂盒和检测方法。
背景技术：
沙门氏菌(Salmonella，Sa.)是重要的食源性致病菌之一，在世界各国细菌性食物中毒病例中，Sa引起的食物中毒案例常列榜首或第二位。随着分子生物学的发展，已有针对沙门氏菌 invA、16s rRNA、SpvC、invB、fimA、agfA、SEF14、sefA、sdf、ssaQ、fimY 等基因为目标基因，用普通PCR或荧光PCR检测沙门氏菌的报道，虽然这些方法可达到快速、高通量的目的，但却无法获得分子诊断的黄金标准-基因序列，因此有出现假阳性的可能。 焦磷酸测序(pyrosequencing)技术是近年来发明的一项实时地进行短片段DNA测序技木，该技术在DNA序列分析时不需要电泳和荧光标记，直接測定引物后面的碱基序列，通过提供可靠的序列信息来确认PCR产物，同时由于主要分析PCR产物双链中的一条链的序列，避免了由于DNA链的ニ级结构造成的人工假象，使测序结果更加准确，目前应用于基因表达病毒检测、SNP分析、耐药基因检测、真菌鉴定、DNA甲基化分析等多个领域。焦磷酸测序是ー种基于合成的新型DNA测序技术，在特异引物的引导下，根据待测序列分别加入四种核苷酸，在延伸的过程中释放焦磷酸，后者在ATP硫酸化酶和荧光酶的偶联反应中释放荧光，通过检测器检测相应的荧光強度，从而获得检测样本中的核苷酸序列，是ー种非常实用的短序列实时检测技术，定量准确、易于自动化、能实现高通量的大样本的快速检测，具有DNA测序法无法比拟的优势，已应用于临床微生物的分型鉴定及耐药监測。李秀娟等以fimy为目的基因用PCR-焦磷酸测序法从属的水平上检测159株不同来源的沙门氏菌，但该方法不能区分不同血清型沙门氏菌，文章中也未说明检测的159株沙门氏菌血清型，其特异性有待进ー步验证(李秀娟，田会方)。
发明内容
本发明的目的是提供简便、快捷、准确性高、特异性强的沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌PCR-焦磷酸法的检测引物、试剂盒和检测方法。本发明根据沙门氏菌aceA基因(GenBank:U43344. I)、肠炎沙门氏菌(SE)特异序列(GenBank:AF370707. I)、鼠伤寒沙门氏菌(ST)的STM4599序列(GenBank:AERVO1000023. I),分别设计扩增引物和测序引物，建立了结合PCR-焦磷酸测序从DNA序列水平上检测沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的方法，从而实现了本发明的目的。本发明的沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌PCR-焦磷酸法的检测引物，其特征在于包括PCR引物和测序引物针对沙门氏菌的PCR引物
5’ -TCACCGAAAGACCAACAGAA-3’ ；(如 SEQ ID NO. I 所示)5’ -GGTGGAACTCGCTGAAATGA-3’ ；(如 SEQ ID NO. 2 所示)测序引物5’-CGAAAGACCAACAGAAG-3’ ；(如 SEQ ID NO. 3 所示) 针对肠炎沙门氏菌的PCR引物5’ -GCATGTTCTGGAAAGCCTCTTTAT-3’ ；(如 SEQ ID NO. 4 所示)5，-TCGTTCTTCTGGTACTTACGATGA-3’ ；(如 SEQ ID NO. 5 所示)测序引物5’-AAAAAGGTTTAGTAAATCAG-3’ ；(如 SEQ ID NO. 6 所示)针对鼠伤寒沙门氏菌的PCR引物
5’ -AAGCTAAGTGTGGGGGCTAGTAT-3’ ；(如 SEQ ID NO. 7 所示)5’ -GGGTTTGTTTTTGATGATACAGG-3，；(如 SEQ ID NO. 8 所示)测序引物5’-AGTATTGATAAATAATGGTT-3’ ；(如 SEQ ID NO. 9 所示)。本发明的第二个目的是提供沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌PCR-焦磷酸法的检测试剂盒，包括DNA提取试剂，PCR反应试剂，单链模板制备试剂，焦磷酸测序试齐U，PCR引物和测序引物，其特征在于，所述的PCR引物和测序引物为针对沙门氏菌的PCR引物5，-TCACCGAAAGACCAACAGAA-3’ ；(如 SEQ ID NO. I 所示)5’ -GGTGGAACTCGCTGAAATGA-3’ ；(如 SEQ ID NO. 2 所示)测序引物5’-CGAAAGACCAACAGAAG-3’ ；(如 SEQ ID NO. 3 所示)针对肠炎沙门氏菌的PCR引物5’ -GCATGTTCTGGAAAGCCTCTTTAT-3’ ；(如 SEQ ID NO. 4 所示)5，-TCGTTCTTCTGGTACTTACGATGA-3’ ；(如 SEQ ID NO. 5 所示)测序引物5’-AAAAAGGITTAGTAAATCAG-3’ ；(如 SEQ ID NO. 6 所示)针对鼠伤寒沙门氏菌的PCR引物5’ -AAGCTAAGTGTGGGGGCTAGTAT-3，；(如 SEQ ID NO. 7 所示)5，-GGGTTTGTTTTTGATGATACAGG-3，；(如 SEQ ID NO. 8 所示)测序引物5’-AGTATTGATAAATAATGGTT-3’ ；(如 SEQ ID NO. 9 所示)。本发明的第三个目的是提供一种非诊断目的的沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤(I)对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板；(2)分别使用上述PCR引物分别进行PCR反应，回收PCR产物，制备单链模版，然后应用上述测序引物对相应的PCR产物进行焦磷酸测序，自测序引物3\端后的第一个碱基开始测序，当前30个碱基序列为GCCTGTGGGTACTTCTCCTGCCAGTATAAT时，判断样品中含有沙门氏菌，当前30个碱基序列为CCTGTTGTCTGCTCACCATTCGCCAGCCAC时，判断样品中含有肠炎沙门氏菌，当前30个碱基序列为TACAACCGGAGTGCACATTAATCCCGCAGC时，判断样品中含有鼠伤寒沙门氏菌。所述的样品可以为食品，肉制品，如猪肉，和海鲜，如售卖的对虾。优选，所述的PCR反应，其扩增体系为50 μ L，PCR Mix Buffer 25 μ 1，Taq酶5 μ 1，MgCl2 I μ I, 10 μ M上、下游引物各2 μ I,DNA模板I μ I,去离子水14 μ I,PCR反应条件为预变性 95°C 5min ；95°C 15s，65°C 30s, ,72°C 30s，45 个循环；72°C 12min。
本发明根据沙门氏菌(Sa)aceA基因、肠炎沙门氏菌(SE)特异序列、鼠伤寒沙门氏菌(ST)的STM4599序列中的保守区域，分别设计扩增引物和测序引物，建立了 PCR-焦磷酸测序，从DNA碱基序列水平上检测Sa、SE和ST的方法。本发明先对目标片段进行PCR扩增，保证扩增片段的特异性，再用扩增产物制备单链模板，在测序引物的引导下进行焦磷酸测序。检测的所得碱基序列与已知序列比对判断結果，即测序引物后前30个碱基序列为GCCTGTGGGTACTTCTCCTGCCAGTATAAT,判断样品中含有沙门氏菌,测序引物后前30个碱基序列为为 CCTGTTGTCTGCTCACCATTCGCCAGCCAC 和 TACAACCGGAGTGCACATTAATCCCGCAGC，则分别判断含有肠炎沙门氏菌(SE)和鼠伤寒沙门氏菌(ST)。PCR扩增实验結果，aceA、SE和ST扩增引物具有较好的特异性，24株不同血清型Sa、16株SE和6株ST分别扩增出大小81bp、176bp和131bp的DNA片段，而其他对照菌株未扩增出DNA条带。焦磷酸测序结果显示，24株Sa、16株SE和6株ST的测序有效DNA碱基数分别为31bp-36bp、31bp-39bp、34bp_36bp，均超过需检测的30bp DNA喊基序列，而其他对照囷株未测出DNA喊基序列。I旲拟样品检测结果，焦磷酸测序法与传统检测方法一致，但在检测周期上，传统方法需要培养、划线分离、生化鉴定、血清分型等，需要5d-6d，而焦磷酸测序方法BP第一次增菌10h，TTB第二次增菌18h，核酸提取、PCR扩增和焦磷酸测序3h，整个试验31h完成，简便快捷，而且可通过DNA碱基序列从属的水平上检测沙门氏菌的同时可对其分型，判定所检测Sa是否为SE和ST血清 型，避免了单纯PCR扩增检测易污染造成的假阳性结果，准确性高。因此本发明具有较好的应用前景。
图I 是 24 株 Sa 的 aceA 扩增产物电泳图，其中 M :50bp marker, I SE ATCC13076,
2ST ATCC14028,3-24 :Sal_Sa22 ；图2是Sa的aceA特异性实验扩增产物电泳图，其中M 50bp maker, I SEATCC13076，2 ST ATCC14028，3 :阪崎肠杆菌 ATCC29544，4 :大肠杆菌 ATCC25922，5 :小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC52221，6 :金黄色葡萄球菌ATCC6538，7 :痢疾志贺氏菌NICPBP51252，8 :单增李斯特菌ATCC19115，9 :肺炎克雷伯氏菌CMCC46102，10:去离子水；图3 是 SE 的扩增产物电泳图，其中 M 50bpmaker, I SE ATCC13076，2-16 SE1-SE15，17 :去离子水；图4是SE特异性实验扩增产物电泳图，其中M 50bp maker, I SE ATCC13076，2 ST ATCC14028，3 :阪崎肠杆菌ATCC29544，4 :大肠杆菌ATCC25922，5 :小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC52221，6 :金黄色葡萄球菌ATCC6538，7 :痢疾志贺氏菌NICPBP51252，8 :单增李斯特菌ATCC19115，9 :肺炎克雷伯氏菌CMCC46102，10:去离子水；图5是SE特异性实验扩增产物电泳图，其中M 50bp maker, I SE ATCC13076,2-23 Sal-Sa22,24 :去离子水；图6 是 ST 扩增产物电泳图，其中 M 50bp maker, I ST ATCC14028，2-6 :ST1_ST5，7 :去离子水；图7是ST特异性实验扩增产物电泳图，其中M 50bp maker, I ST ATCC14028，2 SE ATCC13076，3 :阪崎肠杆菌ATCC29544，4 :大肠杆菌ATCC25922，5 :小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC52221，6 :金黄色葡萄球菌ATCC6538，7 :痢疾志贺氏菌NICPBP51252，8 :单增李斯特菌ATCC19115，9 :肺炎克雷伯氏菌CMCC46102，10 :副溶血性弧菌ATCC33847, 11 :去离子水；图8是ST特异性实验扩增产物电泳图，其中M 50bp maker, I ST ATCC14028,2-23 Sal-Sa22,24 :去离子水；图9是Sa3焦磷酸测序结果图；图10是阴性对照(单增李斯特氏菌)焦磷酸测序结果图；图11是SE2焦磷酸测序结果图；图12是ST2焦磷酸测序结果具体实施例方式以下实施例是对本发明的进ー步说明，而不是对本发明的限制。 实施例I :I、材料和方法I. I菌株来源24种不同血清型沙门氏菌44株，其中SE、ST标准菌株各I株，不同食品中分离的非SE、非ST不同血清型Sa25株，SE分离株15株，ST分离株5株，菌株信息见表I。阴性对照菌株8株，分别为单增李斯特菌ATCC19115、金黄色葡萄球菌ATCC6538、阪崎肠杆菌ATCC29544、大肠杆菌ATCC25922、痢疾志贺氏菌NICPBP51252、小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC52221、肺炎克雷伯氏菌CMCC46102、副溶血性弧菌ATCC33847。上述菌株来自中国普通微生物菌种保藏管理中心、广东省疾病预防控制中心、中国检验检疫科学研究院、广东出入境检验检疫局技术中心。所有菌株均经VITEK2和API试剂条以及血清学实验进行确证。表I :沙门氏菌(Sa)菌株信息
权利要求
1.一种沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌PCR-焦磷酸法的检测引物，其特征在于包括PCR引物和测序引物 针对沙门氏菌的PCR引物5， -TCACCGAAAGACCAACAGAA-3，；5， -GGTGGAACTCGCTGAAATGA-3，； 测序引物5 ’ -CGAAAGACCAACAGAAG-3，； 针对肠炎沙门氏菌的PCR引物5’ -GCATGTTCTGGAAAGCCTCTTTAT-3’ ；5’ -TCGTTCTTCTGGTACTTACGATGA-3’ ； 测序引物5 ’ -AAAAAGGTTTAGTAAATCAG-3，； 针对鼠伤寒沙门氏菌的PCR引物5’ -AAGCTAAGTGTGGGGGCTAGTAT-3’ ；5’ -GGGTTTGTTTTTGATGATACAGG-3’ ； 测序引物5 ’ -AGTATTGATAAATAATGGTT-3，。
2.一种沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌PCR-焦磷酸法的检测试剂盒，包括DNA提取试剂，PCR反应试剂，单链模板制备试剂，焦磷酸测序试剂，PCR引物和测序弓I物，其特征在于，所述的PCR引物和测序引物为 针对沙门氏菌的PCR引物5， -TCACCGAAAGACCAACAGAA-3，；5， -GGTGGAACTCGCTGAAATGA-3，； 测序引物5’ -CGAAAGACCAACAGAAG-3’ ； 针对肠炎沙门氏菌的PCR引物5’ -GCATGTTCTGGAAAGCCTCTTTAT-3’ ；5’ -TCGTTCTTCTGGTACTTACGATGA-3’ ； 测序引物5’ -AAAAAGGTTTAGTAAATCAG-3’ ； 针对鼠伤寒沙门氏菌的PCR引物5’ -AAGCTAAGTGTGGGGGCTAGTAT-3’ ；5’ -GGGTTTGTTTTTGATGATACAGG-3’ ； 测序引物5’ -AGTATTGATAAATAATGGTT-3’。
3.一种非诊断目的的沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板； (2)分别使用权利要求I所述的PCR引物分别进行PCR反应，回收PCR产物，制备单链模版，然后应用权利要求I所述的测序引物对相应的PCR产物进行焦磷酸测序，自测序引物3 \端后的第一个碱基开始测序，当前3 O个碱基序列为GCCTGTGGGTACTTCTCCTGCCAGTATAAT时，判断样品中含有沙门氏菌，当前30个碱基序列为CCTGTTGTCTGCTCACCATTCGCCAGCCAC时，判断样品中含有肠炎沙门氏菌，当前30个碱基序列为TACAACCGGAGTGCACATTAATCCCGCAGC时，判断样品中含有鼠伤寒沙门氏菌。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的样品为食品或海鲜。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述的食品为肉制品。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的肉制品为猪肉。
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述的海鲜为售卖的对虾。
8.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的PCR反应，其扩增体系为.50 μ L,PCR Mix Buffer 25 μ l，Taq 酶 5μ IjMgCl2 I μ 1，10 μ M 上、下游引物各 2 μ 1，DNA 模板 I μ I，去离子水 14μ 1，PCR 反应条件为预变性 95°C 5min ；95°C 15s，65。。30s，，72。。30s，.45 个循环-JTC 12min。
全文摘要
本发明公开了一种沙门氏菌肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌PCR焦磷酸法的检测引物试剂盒和检测方法。本发明根据沙门氏菌aceA基因、肠炎沙门氏菌特异序列、鼠伤寒沙门氏菌的STM4599序列中的保守区域，分别设计扩增引物和测序引物，对目标片段进行PCR扩增，再用扩增产物制备单链模板，进行焦磷酸测序，测序引物后前30个碱基序列为GCCTGTGGGTACTTCTCCTGCCAGTATAAT判断样品中含有沙门氏菌，测序引物后前30个碱基序列为CCTGTTGTCTGCTCACCATTCGCCAGCCAC和TACAACCGGAGTGCACATTAATCCCGCAGC则分别判断含有肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌。
文档编号C12Q1/10GK102851361SQ20121023794
公开日2013年1月2日 申请日期2012年7月10日 优先权日2012年7月10日
发明者许龙岩, 袁慕云, 曹际娟, 相大鹏, 唐勤 申请人:许龙岩, 袁慕云, 曹际娟, 相大鹏, 唐勤