猪捷申病毒dbn-10021株全基因组序列，测定其的引物及其应用的制作方法

专利名称：猪捷申病毒dbn-10021株全基因组序列，测定其的引物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及捷申病毒4型全基因组序列测定方法，具体的说是猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列测定方法。
背景技术：
猪捷申病毒(Porcine teschovirus,猪捷申病毒)可引起猪的脑脊髓灰质炎、繁殖障碍、肺炎、下痢、心包炎和心肌炎、皮肤损伤及无症状等多种临床表现。捷申病毒基因型众多，目前至少存在11个基因型，并且同一基因型的不同分离株的基因组间也存在较大差异。我国许多研究显示，猪群中猪捷申病毒的阳性率比较高，而在我国仅见有关猪捷申病毒2型和猪捷申病毒8型基因组的研究报道，其主要原因在于猪捷申病毒基因组变异大，不易设计引物，直接影响到猪捷申病毒基因组全长序列的测定。 针对上述问题，目前急需一种有效、简单、准确可靠的猪捷申病毒4型全基因组测序方法，并通过该方法得到猪捷申病毒4型的全基因组序列。

发明内容
为了解决上述问题,本发明提供猪捷申病毒(Porcine teschovirus)DBN_10021株全基因组序列，测定其的引物及其应用。本发明提供的猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列，序列如SEQ ID No. I所示。本发明还提供用于扩增猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列的引物，其包括序列如SEQ ID No. 2 13所示的引物。进一步地，所述的引物还可包括SEQ ID No. 14和SEQ ID No. 15所示的引物。本发明还提供一种测定扩增猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列的方法，其包括如下步骤I)提取猪捷申病毒DBN-10021株RNA，反转录成cDNA ；2)用SEQ ID No. 2^15所示引物对全基因组序列进行分段PCR扩增，分别为SEQID No. 2 和 14 扩增后再用 SEQ ID No. 3 和 15 嵌套扩增；SEQ ID No. 4 和 5 ；SEQ ID No. 6 和7 ；SEQ ID No. 8 和 9 ；SEQ ID No. 10 和 11 ；SEQ ID No. 12 和 13 ；3)目的片段回收、连接、转化、阳性菌的鉴定、测序；4)利用生物软件对所测定的序列进行比对分析、序列拼接，将6个片段首尾相连，得到猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列。其中，所述PCR反应条件参数为94 V预变性5min，然后94 °C 3(T60s ；50°C 30 60s ；72°C 20s_2min，进行 30 个循环，最后 72°C延伸 IOmin0本发明提供的用于测定猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列的引物可以用于制备猪捷申病毒DBN-10021株全基因组测序试剂盒，因此本发明还提供含有所述引物的猪捷申病毒DBN-10021株全基因组测序试剂盒。所述试剂盒还可含有常规的PCR试剂，如Taq酶，dNTPs 等。本发明将病毒基因组序列分为6个片段，用RT-PCR方法扩增相应的cDNA，将扩增片段克隆到T载体进行测序，在扩增中所用的引物是根据猪捷申病毒保守区域的核苷酸序列所设计的，引物3’端尽可能终止在兼并密码子较少的氨基酸位置且最后一个碱基尽可能避免终止在氨基酸密码子的第三位碱基上。本发明可以有效地扩增出目的片段，提供了全基因组序列，有利于研究病毒的分类、进化、致病性及分子流行病学等。本发明的猪捷申病毒DBN-10021株属于猪捷申病毒4型毒株，于2011年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 5573。


图I所示为捷申病毒各亚型进化树。图2所示为扩增片段I飞的琼脂凝胶电泳图片。I飞表示基因组第I飞段；Ml、M2,M3分别表示不同的DNA Marker ;N1、N2、N3分别表示阴性对照。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例I猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列的克隆(I)病毒RNA的提取取猪捷申病毒DBN-10021株(CGMCC No. 5573)，经PK15细胞传代，收集第5代细胞毒液，反复冻融3次，然后12000r/min，4°C离心5分钟。取病毒悬液250 U I放在I. 5ml EP管中，加入0. 75mlTranszol (北京全式金生物技术有限公司)，混匀；再加入200 氯仿，剧烈震荡15秒，室温孵育3分钟。12000r/min4°C离心10分钟。离心后转移上层水相到新的I. 5ml EP管中，加入0. 5ml异丙醇，颠倒混匀，室温孵育10分钟。12000r/min4°C离心10分钟，弃去上清，留沉淀。加入lml75%乙醇(DEPC处理的水配制)，剧烈震荡。12000r/min4°C离心5分钟，弃上清，室温晾干沉淀，后将沉淀用5(Tl00 u I RNA溶解液中。(2)病毒RNA的反转录利用TransScriptTM First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)制备cDNA。以提取的病毒RNA为模板进行cDNA的合成，反应体系为RNA8 U I, RandomPrimerl u I, 2XTS Reaction MixlO u I, TransScript RT/RI Enzyme Mixlu I。25°C孵育10min,42°C孵育 30min。之后 85°C加热 5min 使 TransScript RT/RI Enzyme 失活。(3)引物设计与合成通过对多个猪捷申病毒全基因组序列的比对，选取保守的序列作为引物，引物3’端尽可能终止在兼并密码子较少的氨基酸位置且最后一个碱基尽可能避免终止在氨基酸密码子的第三位碱基上，相邻的扩增片段之间有长短不等的重叠。共设计12条引物，将病毒的全基因组序列分为6段，具体引物序列及其对应位点如表I所示，SEQ ID No. 2和SEQID No. 3分别为与5’RACE试剂盒配套使用的反向引物，SEQ ID No. 14为正向外套引物(试剂盒提供)，SEQ ID No. 2为反向外套引物，SEQ ID No. 15为正向内套引物(试剂盒提供)，、SEQID No. 3为反向内套引物；SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5为正反引物对；SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7为正反引物对；SEQ ID No. 8和SEQ ID No. 9为正反引物对；SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11为正反引物对；SEQ ID No. 12和SEQ ID No. 13为正反引物对。“F”代表正向引物，“R”代表反向引物。引物位置以捷申病毒4型PS36株(GenBank登录号AF296089)的基因组为参考。表I引物信息
权利要求
1.猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列，其序列如SEQID No. I所示。
2.用于扩增权利要求I所述序列的引物，其包括序列如SEQID No.2 13所示的引物。
3.如权利要求2所示的引物，其特征在于，还包括序列如SEQID No. 14和SEQ IDNo. 15所示的引物。
4.一种测定权利要求I所述序列的方法，其特征在于，包括如下步骤1)提取猪捷申病毒DBN-10021株RNA，反转录成cDNA；2)用SEQID No. 2 15所示引物对全基因组序列进行分段PCR扩增，分别为SEQ IDNo. 2 和 14 扩增后再用 SEQ ID No. 3 和 15 嵌套扩增；SEQ ID No. 4 和 5 ；SEQ ID No. 6 和 7 ;SEQ ID No. 8 和 9 ；SEQ ID No. 10 和 11 ；SEQ ID No. 12 和 13 ；3)目的片段回收、连接、转化、阳性菌的鉴定、测序；4)利用生物软件对所测定的序列进行比对分析、序列拼接，将6个片段首尾相连，得到猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR反应条件参数为94°C预变性5min,然后 94°C 30 60s ；50 °C 30 60s ；72°C 20s-2min,进行 30 个循环，最后 72°C 延伸IOmin0
6.权利要求2或3所述引物在制备猪捷申病毒DBN-10021株全基因组测序试剂盒中的应用。
7.含有权利要求2或3所述引物的猪捷申病毒DBN-10021株全基因组测序试剂盒。
全文摘要
本发明公开了猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列，测定其的引物及其应用。本发明提供的猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列如SEQ ID No.1所示。本发明的提供用于扩增所述猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列的引物，其包括序列如SEQ ID No.2~13所示的引物。本发明将病毒基因组序列分为6个片段，用RT-PCR方法扩增相应的cDNA，可以有效地扩增出目的片段，提供了全基因组序列，有利于研究病毒的分类、进化、致病性及分子流行病学等。
文档编号C12Q1/68GK102776210SQ20121026930
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者宫晓文, 张志榜, 焦连国, 王美君, 王贵华, 赵亚荣 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 福州大北农生物技术有限公司