专利名称：一种猪捷申病毒的体外分离方法
CN 102533672 A一种猪捷申病毒的体外分离方法技术领域
本发明属于兽医生物技术领域，具体涉及一种猪捷申病毒的体外分离方法。
技术背景
猪传染性脑脊髓炎，又称猪捷申病是由猪捷申病毒(Porcine Teschovirus, PTV) 引起的，可以引起猪腹泻、呼吸道症状、猪脑脊髓灰质炎、繁殖障碍、肺炎、下痢、心包炎和心肌炎、皮肤损伤等多种表现的一种病毒性传染病，严重危害养猪业。
猪捷申病毒，原属于小RNA科，肠道病毒属，1999年病毒分类学委员会将肠道病毒属猪肠道病毒中的11个血清型列为捷申病毒属。由于临床上一般猪捷申病毒都是与其他病毒混合感染猪群，并且捷申病毒与临床常见的猪病病毒一样，都可以在IBRS-2细胞、 PK-15细胞、ST细胞等猪肾传代细胞系上生长，并且产生的细胞病变也不是特别典型，因此给猪捷申病毒分离与纯化带来一定困难。
噬斑纯化是用细胞分离病毒的常见的纯化方法，是利用某些病毒可以在细胞上形成肉眼可见的病变的特点，利用低熔点琼脂糖固定使得病变的病毒可以逐个挑出，一般认为一个噬斑就是一个病毒，一般经过三轮噬斑纯化，就可以得到较为纯净的病毒，这种病毒经过检测可以作为科研与疫苗制备中的种毒使用。发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种猪捷申病毒的体外分离方法。
本发明的一种猪捷申病毒的体外分离方法，其包括如下步骤
1)从临床上诊断为疑似猪捷申病毒感染的猪病料中获取用nRT-PCR鉴定为阳性， 并进行过滤除菌的病料上清液；
2)用步骤1)获得的病料上清液感染猪肾传代细胞系，连续传代培养至90%以上的细胞出现病变，其中，每代在收毒时均取上清进行nRT-PCR检测，保留PCR阳性的病毒液继续传代；
3)将步骤2)传代培养后的猪捷申病毒用噬斑纯化方法进行纯化。
在本发明一个优选的实施方案中，其中步骤1)具体包括如下步骤
用细胞培养液研磨所述的猪病料，反复冻融2 4次，8000 12000rpm冷冻离心 5 30min，取上清液进行总RNA的提取，进行nRT-PCR扩增，检测为阳性的病料上清液用 0. 22 μ m的过滤器进行过滤除菌。
其中，细胞培养液和猪病料的液固比为1 10 0. 5 10 (ml g)。
在本发明另一个优选的实施方案中，步骤幻具体包括如下步骤
将猪肾传代细胞系培养成单层细胞，将步骤2、获得的病毒液进行10倍倍比稀释 0 9次后，以0. 01 0. 2ml/cm2细胞的量接种细胞，摇勻后置37°C感作30min 2h，吸弃病毒液，用减血清培养基Opti-MEM以0. 1 0. 3mL/cm2细胞的量，洗涤1 2次后，将37°C 含2% 6%胎牛血清的2 XDMEM与60°C低熔点琼脂糖均勻混合后铺于细胞上，厚度为2 2/4页4mm，在37°C、5% CO2培养箱中培养，7 后挑选单个噬斑，接种于所述的猪肾传代细胞系上扩大培养，经三轮噬斑纯化后，将最后一次挑取的噬斑接种于所述的猪肾传代细胞系扩大培养，经鉴定后作为纯化的病毒。
其中，所述的病料优选为肺脏、肠和/或脑组织，更优选为小脑组织。
其中，所述的猪肾传代细胞系优选为IBRS-2、PK_15或ST细胞系，更优选为PK-15 细胞系。
其中，步骤2)中连续传代培养的代数优选为5 10代。
本发明的方法是以临床收集的样本，经巢式反转录聚合酶链式反应(nRT-PCR)检测为猪捷申病毒阳性，通过研磨、离心、过滤等处理后，用体外传代细胞系猪肾传代细胞系进行分离培养，并用噬斑试验进行纯化，以及通过nRT-PCR和免疫荧光方法鉴定为纯化的 PTV病毒。该分离纯化方法特异性高、敏感性强，能快速、特异地分离纯化猪捷申病毒。
图1所示nRT-PCR检测结果。其中，从左至右依次为DL2000DNA Marker、第一轮 PCR阳性目的条带(321bp)、第二轮PCR阳性目的条带(158bp)、阴性目的条带对照。
图2所示为猪捷申病毒在H(-15上的CPE(XlOO)。
图3所示为正常无病变的PK-15细胞(X 100)。
图4所示为猪捷申病毒荧光鉴定照片(X200)。
图5所示为荧光阴性对照照片(X200)。
图6所示为猪捷申病毒噬斑纯化图片。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
下述实施例中涉及的试剂若无特别说明，均市售获得。
实施例1感染猪捷申病毒的病猪料的采集和处理
(1)病料采集
选取有腹泻症状并有神经症状的发病猪，临床确诊为感染猪捷申病毒的病猪小脑组织。
(2)病料处理
用5mL培养液研磨约Ig左右的病料。反复冻融3次，12000rpm离心10分钟，取上清，弃去沉淀，-40°C以下保存。
实施例2病料的nRT-PCR鉴定
取250 μ L实施例1处理好的病料，用RNA提取试剂盒进行RNA提取。
用反转录引物CCAGCCGCGACCCTGTCAGGCAGCAC(SEQ ID No. 2)进行反转录。反转录体系总 RNA lOOng，15pmol 引物，ImM d NTP，200U M-MLVU Xbuffer,20U RNase 抑制剂， 用DEPC水补齐至20 μ L体系，42 °C反应Ih。
反转录后的cDNA用下述引物进行巢式PCR扩增基因组的5’非翻译区，引物如下
第一轮PCR 上游引物AGTTTTGGATTATCTTGTGCCC(SEQ ID No. 1)；
下游引物CCAGCCGCGACCCTGTCAGGCAGCAC(SEQID No. 2)；4
第二轮PCR 上游引物TGAAAGACCTGCTCTGGCGCGAG(SEQ ID No. 3)；
下游引物GCTGGTGGGCCCCAGAGAAATCTC(SEQID No. 4)。
第一轮PCR产物的预期片段大小为321bp，第二轮PCR产物的预期片段大小为 158bp0
第一轮PCR反应程序PCR mix 12. 5 μ L、上下游引物各lOpmol、模板2 μ L、其余部分用水补至25 μ Lo反应条件为94°C 5min ；94°C 40s,55°C 50s,72°C 60s、共35个循环， 720C 7min，用2%的胶进行鉴定。
第二轮PCR反应程序与条件同第一轮PCR，所用模板为第一轮PCR的产物。
结果见图1。从图1中可以看出，扩增出来的条带与预期的条带大小一致，并且通过琼脂糖凝胶回收后测序确认。结果证实病料上清液为猪捷申病毒阳性。
实施例3猪捷申病毒的传代分毒
将根据实施例2鉴定为阳性的病料上清液取ImL接种于已长成单层的PK-15细胞 (T25细胞瓶)，37°C孵育Ih,后换成2% DMEM7mL,逐日观察CPE，见图2、图3，连续观察5日。 若无CPE，可继续传5代，每代在收毒时取上清用实施例2的方法进行nRT-PCR检测若为阳性则继续传代，若为阴性则弃去。
将出现90%以上病变的细胞冻融一次，12000rpm离心lOmin，取上清，于_80°C进行保存。
实施例4猪捷申病毒的间接免疫荧光鉴定
采用间接免疫荧光试验方法对所分离的病毒进行鉴定。将0.25%的胰酶消化好的 PK-15细胞转入96孔板，每孔100 μ L培养成长至80%左右的单层细胞，小心吸弃上清，加入用2% DMEM 100倍TCID5tl稀释的病毒液，37°C，Ih后换成2%的DMEM继续培养，12h后， 小心吸弃上清，每孔加入100 μ L-20°C预冷的乙醇，室温固定15min，用PBS洗涤3遍，每遍 :3min。用含5%小牛血清的PBS封闭，每孔200 μ L，37°C，Ih后用PBS洗涤3遍，每遍3min。 加入小鼠抗猪单抗，用加入了 5 %小牛血清的PBS稀释，每孔100 μ L，37°C，孵育lh，用PBS 洗3次，每次;3min。加入含0. 01 %的伊文斯兰的山羊抗小鼠酶标二抗，1 100稀释，每孔 50 μ L，37°C，孵育lh。用PBS洗涤3遍，每次3min，包锡箔纸避光，吸干液体后立即以荧光显微镜检测。
每次做荧光鉴定时，需同时做未接毒的细胞对照孔，只加一抗不加二抗，只加二抗不加一抗的对照孔各两个，以及接有已知鉴定好的病毒的阳性对照孔。只有当三组阴性对照均为阴性结果，阳性对照为阳性结果时，实验才可判为有效。
结果三组阴性对照组均判定为阴性，而阳性对照和本发明分离的病毒均判定为阳性，这一结果证实了分离到的是猪捷申病毒(图4、图5)。
实施例5猪捷申病毒的噬斑纯化
将PK-15细胞于6孔细胞板内培养成单层细胞，将病毒做10倍稀释，可做到0 9次梯度稀释倍数，每孔接种病毒0. 5ml，摇勻后置37°C感作lh，吸弃病毒液，用减血清培养基Opti-MEM 2ml/孔，洗涤1 2后，将37°C含4% FBS的2 XDMEM与60°C琼脂糖均勻混合后铺于细胞上，厚度约为3mm，约aiil/孔，在37°C、5% CO2培养箱中培养，每4h观察一次， 72h后挑选单个噬斑，接种于PK-15细胞上扩大培养。经三轮噬斑纯化后，将最后一次挑取的噬斑接种于冊-15细胞扩大培养，经鉴定后作为纯化的病毒，保存。
每一轮纯化过程中需要挑取12个左右的斑。接种于T25细胞瓶。每一轮收毒方法同实施例2，每一轮需用实施例2所述的nRT-PCR方法进行鉴定是否出毒。
图6为第三轮噬斑纯化后的图片，表明本发明已经成功纯化出猪捷申病毒，而且由于过程中用免疫荧光法或nRT-PCR法不断地进行鉴定，保证了分离到的病毒的特异性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种猪捷申病毒的体外分离方法，其包括如下步骤1)从临床上诊断为疑似猪捷申病毒感染的猪病料中获取用nRT-PCR鉴定为阳性，并进行过滤除菌的病料上清液；2)用步骤1)获得的病料上清液感染猪肾传代细胞系，连续传代培养至90%以上的细胞出现病变，其中，每代在收毒时均取上清进行nRT-PCR检测，保留PCR阳性的病毒液继续传代；3)将步骤幻传代培养后的猪捷申病毒用噬斑纯化方法进行纯化。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，其中步骤1)具体包括如下步骤用细胞培养液研磨所述的猪病料，反复冻融2 4次，8000 12000rpm冷冻离心5 30min，取上清液进行总RNA的提取，进行nRT-PCR扩增，检测为阳性的病料上清液用 0. 22 μ m的过滤器进行过滤除菌。
3.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，其中，细胞培养液和猪病料的液固比为 1 10 0. 5 10。
4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，其中步骤3)具体包括如下步骤将猪肾传代细胞系培养成单层细胞，将步骤2、获得的病毒液进行10倍倍比稀释0 9次后，以0. 01 0. 2ml/cm2细胞的量接种细胞，摇勻后置37°C感作30min 2h，吸弃病毒液，用减血清培养基Opti-MEM以0. 1 0. 3mL/cm2细胞的量，洗涤1 2次后，将37°C含 2% 6%胎牛血清的2XDMEM与60°C低熔点琼脂糖均勻混合后铺于细胞上，厚度为2 4mm，在37°C、5% CO2培养箱中培养，7 后挑选单个噬斑，接种于所述的猪肾传代细胞系上扩大培养，经三轮噬斑纯化后，将最后一次挑取的噬斑接种于所述的猪肾传代细胞系扩大培养，经鉴定后作为纯化的病毒。
5.根据权利要求1 4任一项所述的分离方法，其特征在于，其中步骤1)中所述的病料为肺脏、肠和/或脑组织。
6.根据权利要求1 4任一项所述的分离方法，其特征在于，所述的猪肾传代细胞系为 IBRS-2、PK-15 或 ST 细胞系。
7.根据权利要求1 4任一项所述的分离方法，其特征在于，其中步骤2)中连续传代培养的代数为5 10代。
全文摘要
本发明提供了一种猪捷申病毒的体外分离方法，其包括如下步骤1)从临床上诊断为疑似猪捷申病毒感染的猪病料中获取用nRT-PCR鉴定为阳性，并进行过滤除菌的病料上清液；2)用步骤1)获得的病料上清液感染猪肾传代细胞系，连续传代培养至90％以上的细胞出现病变，其中，每代在收毒时均取上清进行nRT-PCR检测，保留PCR阳性的病毒液继续传代；3)将步骤2)传代培养后的猪捷申病毒用噬斑纯化方法进行纯化。本发明提供的分离纯化方法特异性高、敏感性强，能快速、特异地分离纯化猪捷申病毒。
文档编号C12N7/00GK102533672SQ20121001091
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月14日 优先权日2012年1月14日
发明者宫晓文, 张志榜, 王美君, 赵亚荣 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 福州大北农生物技术有限公司