专利名称：一种植物双元表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物双元表达载体。
背景技术：
植物表达载体是在植物进行转基因过程中，将外源基因导入植物细胞并整合于植物染色体上的DNA介质。在植物基因工程上应用最广泛的是双元表达载体，含有根癌农杆菌来源的T-DNA序列，可实现外源基因与植物染色体的整合。目前，已有一系列的植物表达载体得到应用，如pCambia系列载体。这些双兀表达载体一般含有标记基因、报告基因和多克隆位点。但所使用的报告基因大多为GUS。相对GUS而言，报告基因GFP的检测比较简便，只需荧光显微镜或激发光源，无需反应底物或其它辅助因子材料；GFP检测时无需前处理，可进行活体观察。植物表达载体上常用的标记基因为新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransfe-rase, NPT II)基因、链霉素憐酸转移酶(streptomycinphosphotransferase, SPT)基因、潮霉素憐酸转移酶(hygromycin phosphotransferase,HPT)基因和抗除草剂基因等。相对而言，卡那霉素抗性的NPTII基因使用卡那霉素进行筛选，是相对比较安全的一种标记基因。RNA干涉技术(RNA interference, RNAi)是近年来发展起来的一种特异基因阻断技术，是将双链RNA (double strained RNA, dsRNA)导入细胞内引起特异靶基因mRNA降解的一种细胞反应过程，它是一种转录后的基因沉默(PTGS)现象。在植物中，触发RNAi的主要方法是构建可转录 为发卡RNA(hairpin RNA, hpRNA)的植物表达载体转化植物来产生RNAi，因此构建高效的RNAi表达载体是利用转基因RNAi的关键。研究表明:在启动子下游插入反向重复片段的重组双元载体，是产生RNAi的基本结构。而用含内含子的发夹RNA(intron-contain-1ng hairpin RNA, ihpRNA)结构表达dsRNA 的植物,其沉默效率更高。通过构建及优化各种RNAi载体，可大大方便植物的RNA干涉研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物双元表达载体。本发明提供的植物双元表达载体，是按照如下方法得到:在出发载体PBI121中构建荧光蛋白报告基因表达盒和外源基因表达盒；所述外源基因表达盒由启动子、内含子和终止子依次连接而成，所述启动子与所述内含子之间具有若干个酶切位点，所述内含子与所述终止子之间具有若干个酶切位点；构建得到的植物双元表达载体中其它位置的酶切位点与所述内含子两侧的酶切位点均不相同。上述植物双元表达载体中，所述启动子与所述内含子间的若干个酶切位点为:XbaKAge I,Kpn 1.Avr II和BamH I，所述内含子与所述终止子之间的若干个酶切位点为:EcoR 1、Sac 1、Sal I 和 SnaB I。上述任一所述植物双元表达载体中，所述外源基因表达盒的核苷酸序列如序列4所示。
上述任一所述植物双兀表达载体中，所述构建突光蛋白报告基因的表达盒的方法为用荧光蛋白报告基因替换所述出发载体PBI121中的GUS基因表达盒中的GUS基因，得到所述荧光蛋白报告基因的表达盒。上述任一所述植物双元表达载体中，所述荧光蛋白报告基因的为EGFP报告基因。上述任一所述植物双元表达载体中，所述外源基因表达盒的表达方向与所述荧光蛋白报告基因的表达盒的表达方向相反。上述任一所述植物双元表达载体在将目的基因导入出发植物中的应用也属于本发明的保护范围。上述任一所述植物双元表达载体在使出发植物中的目的基因功能丧失中的应用也属于本发明的保护范围。上述任一所述应用中，所述使出发植物中的目的基因功能丧失是通过RNA干扰实现的。上述任一所述应用中，所述出发植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为烟草或棉花；所述单子叶植物具体为洋葱。本发明所构建的植物双元表达载体可用于植物转基因过表达研究和RNAi研究，可以将所述载体上TUB intron基因替换成目的基因，改造成含目的基因的植物表达载体，也可以在TUB intron基因片段两侧的多克隆位点上分别加上目的基因片段的正反向片段，改造成目的RNAi载体。所 述植物双元表达载体具有GFP报告基因，可以方便的进行转基因植株的检测；所述植物双元表达载体具有卡那霉素抗性基因，卡那霉素抗性基因较为安全，可以高效的进行筛选和生产的应用。
图1是载体pCRI1210的酶切位点验证结果示意图。图2是载体pCRI1210的图谱示意图。图3是质粒载体pCRI1210和pBI121双酶切结果示意图。图4是GUS基因的特异性检测引物进行PCR检测扩增的结果示意图。图5是⑶S基因的双酶切检测结果示意图。图6是载体在洋葱表皮中的瞬时表达检测报告基因GFP表达的结果示意图。图7是载体的在棉花愈伤组织中的瞬时表达检测GUS表达的结果示意图。图8是转化V烟早幼牙⑶S染色结果不思图。图9是转化烟草叶片⑶S染色结果示意图。图10是转化烟草根部⑶S染色结果示意图。图11是用转化棉花愈伤组织检测报告基因EGFP的表达结果示意图。图12是转化烟草⑶S基因组DNA特异性检测引物PCR检测结果示意图。图13是转化和非转化烟草幼苗生长状态对比图。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、构建双元表达载体pCRI1210一、构建干涉表达框以含有CaMV 35S启动子的pBI121载体(GenBank:AF485783.1)为模板，分别用引物35S1/35S2和35S1/35S3通过两次PCR扩增获得了两端添加了酶切位点的CaMV35S启动子片段(其核苷酸序列如序列表中序列I所示，5'端添加的酶切位点为Hind II1、SmaI和XmaI, 3;端添加的酶切位点为BglII,KpnI,XbaI和XhoI)，并连接到pMD19_T simple载体(该载体购自大连TAKARA公司，产品目录号为:D104A)上，得到中间载体pMD19T_35S。引物序列如下:35S1:5，-AAgCTTCCCgggTATTggCTAgAgCAgCTT_3，，35S2:5， -TACCggTgATCTAgAAgCTCgAgAgAgATAgAT-3，，35S3:5， -CCgAgATCTATAggTACCTgACCggTgATCTAgAAgC-3，。以含有Ca MV 35SpolyA终止子的pCADS1341载体为模板，用引物35SpolyAl/35SpolyA2和35SpolyAl/35SpolyA3通过两次PCR扩增获得了两端添加了酶切位点的CaMV 35SpolyA终止子(其核苷酸序列如序列表中序列2所示，5^端添加的酶切位点为Sac1.Sal I和SnaBI, 3;端添加的酶切位点为BglII)并连接到pMD19-Tsimple载体上,得到中间载体pMD19T-polyA。引物序列如下:35SpolyAl:5，-TTgCTAgATCTCCgTACTgAATTAACgCCgAAT-3，，35SpolyA2:5， -gTCgACTCTACgTATCTgTCgATCgACAAgCT-3，，35SpolyA3:5， -ATgAgCTCTCTTgTCgACTCTACgTATCTgT-3，。从陆地棉的基因组DNA中用引物AF1/AF3通过PCR扩增得到TUB intron内含子片段，用引物AF2/AF4通过PCR扩增在TUB intron片段两端添加酶切位点(其核苷酸序列如序列表中序列3所示，5'端添加的酶切位点为Kpnl、AvrII和BamHI，3'端添加的酶切位点为 Bglll、SacI 和 EcoRI)，T/A 克隆到 pMD19_T simple 中，得到中间载体 pMD19T_AF。引物序列如下:AFl:5’ -CCTAggTATggATCCACTCCAAgTTgTAAgTAT-3’ 和AF3:5， -gAgCTCACTgAATTCTgAACATCAAACATTACA_3，；AF2:5， -TAggTACCAATTACCTAggTTATggATCCACT-3’ 和AF4:5，-AgATCTTgAgAgCTCACTgAATTCTgAACAT_3，。Kpn Ι/BglII分别双酶切上述中间载体pMD19T-35S和pMD19T-AF，分别回收3.5kb和590bp的片段，连接后得到的中间载体再进行Sac Ι/BglII双酶切，回收4.1kb片段，所回收的片段与Sac Ι/BglII双酶切载体pMD19T-polyA得到的240bp的片段进行连接，得到含有干涉表达框的中间载体PMD19T-35SAP。将载体pMD19T_35SAP进行测序验证，结果在PMD19-T的HindIII和BglII酶切位点间含有干涉表达框，干涉表达框结构如下:自上游至下游依次为:CaMV 35S启动子(序列表中序列I)、TUB intron内含子(序列表中序列3)和CaMV 35SpolyA终止子(序列表中序列2)，并在TUB intron内含子两端含有多克隆位点，在 TUB intron 的 5’ 端具有 5 个酶切位点:Xba I, Age I, Kpn I, Avr 11, BanH I，在 3’端具有 4 个酶切位点:EcoR 1、Sac 1、Sal 1、SnaB I。二、修饰 pBI121 载体用Sac !/BamH I双酶切pBI 121载体，得到的载体片段与报告基因EGFP (GenBank:AF323988.1，其序列见序列表中的序列5)连接，得到pBI121_EGFP表达载体。pBI121_EGFP载体用EcoR I单酶切，进行平末端化后连接，去除载体上的EcoR I酶切位点。用与去除EcoR I酶切位点同样的方法，分别去除PBI121-EGFP载体上的Sac 1.BamH I和Xba I酶切位点，得到中间载体PBI121-GFPQ。EcoR 1、Sac 1、BamH I和Xba I酶切位点位于pBI121载体中GUS基因的两侧。验证:通过Sac I/BamH I双酶切pBI121_EGFP表达载体，琼脂糖凝胶电泳检测，能够得到大约720bp的条带，说明EGFP已经正确连接到pBI121-EGFP表达载体中。采用Sac Ι/BglII双酶切质粒，以未去除酶切位点前的质粒做对照来验证pBI121上相应酶切位点的去除效果。由于PBI121载体上有2个Bgl II酶切位点，而所去除的4个酶切位点均位于这2个Bgl II位点之间。如果酶切位点被去除后，双酶切只能切开2个Bgl II位点，得到5.6k和8.0k的两个条带。如果酶切位点没有去除，则会切开3条带。根据验证结果，EcoR 1、Sac 1.BamH I和Xba I四个酶切位点均已去除。三、构建pCRI1210载体用HindIII单酶切载体pBI121_GFPQ，回收载体片段，进行平末端化反应和去磷酸化反应；用HindIII/BglII双酶切载体pMD19T_35SAP，回收1.7kb片段，进行平末端化反应后，与上述单酶切载体PBI121-GFPQ后回收的载体片段进行连接，得到双元载体pCRI 1210(图2)。利用载体pCRI1210两侧的多克隆位点进行酶切验证和测序验证。酶切组合为A:Avr II/EcoR I ；B:Age I/EcoR I ；C:Kpn I/Sal I ；D:Xba I/SacI ；E =SnaB I/BamH I，酶切效果见图1(图1 A^dtASAvr II/EcoR I的酶切验证结果，B为Age I/EcoR I酶切验证 结果，C Kpn I/Sal I酶切验证结果，D Xba I/Sac酶切验证结果，E SnaB I/BamH I酶切验证结果)，每一对酶切组合均得到了 550bp的酶切片段，表明构建的载体中只在内含子左右具有以上多克隆酶切位点外，其余位置没有以上多克隆酶切位点，说明该载体得到了正确的连接，其上的多克隆位点也是可用的。并送测序公司，结果干涉表达框的序列为序列4所示，进一步验证该表达载体正确。实施例2、植物双元表达载体的功能验证一、表达载体pCRI1210-GUS的构建用BamHI/SacI双酶切质粒pBI121中的⑶S基因片段和质粒pCRI1210中的TUBintron部分，酶切产物进行电泳，电泳结果如图3所示(图3:1号泳道为MakerIII，2号泳道为质粒PBI121的BamHI/SacI双酶切图谱，3号泳道为质粒pCRI1210的BamHI/SacI双酶切图谱。)，分别在约1.9kb和15kb处出现了扩增条带。将回收到的1.9kb和15kb的两部分DNA片段连接起来，得到含有GUS和GFP基因的载体pCRI 1210-GUS。其中，该载体的抗性筛选基因为卡那霉素抗性基因。将连接产物pCRI 1210-GUS加入到装有刚刚融化的大肠杆菌DH5a感受态细胞(购自Tiangen公司)的离心管中，轻弹混匀，冰浴30分钟；将该离心管置于42°C水浴锅中热激90秒，取出后立即冰浴2-3分钟，期间不要晃动离心管；向离心管中加入250-500ul不含卡那霉素的LB液体培养基，150rpm, 37°C震荡培养45分钟；将离心管中的菌液混匀，吸取IOOul菌液加入到含有卡那霉素的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻将菌液涂开，待平板表面干燥后，倒置平板；37°C培养12-16小时后，挑取单菌落于含卡那霉素的LB液体培养基中，摇菌约12小时；同时，设计未转化的大肠杆菌(空白对照)和转化pBI121载体的大肠杆菌(阳性对照);利用TIANprep Mini Plasmid Kit(购自Tiangen公司)提取质粒，用GUS基因的特异性检测引物对提取的质粒进行PCR检测，特异性GUS引物序列为:上游引物⑶SFl:5’ -CTACACCACGCCGAACACCT-3，和下游引物⑶SRl:5，-CACGCTTGGGTGGTTTTTGTC-3，。PCR检测结果显示，转化pCRI1210-GUS载体的大肠杆菌I号和2号单克隆与转化PBI121载体的大肠杆菌(阳性对照)在690bp处出现了扩增条带(图4:1号泳道为MakerIII, 2号泳道为未转化的大肠杆菌(空白对照)，3号泳道为I号单克隆，4号泳道为2号单克隆，5号泳道为转化pBI 121载体的大肠杆菌(阳性对照)，表明目的基因GUS已成功构建到载体PCRI1210中。同时，对提取的质粒进行酶切检测，用BamHI/SacI双酶切提取的质粒，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示I号和2号单克隆在1.9kb处出现了扩增条带(图5:1号泳道为Makerlll，2号泳道为I号单克隆，3号泳道为2号单克隆)，表明gus基因已经连接到PCRI1210-GUS载体上。检测后再送交测序公司，，确定阳性单克隆，所保存的对应菌落即为目的转化子。二、表达载体pCRI1210-GUS的功能验证(一)表达载体的瞬时表达分析(I)将上述步骤一得到的阳性单克隆的菌液，利用TIANprep Mini Plasmid Kit提取 pCRI 1210-GUS 质粒。(2)基因枪轰击转化利用基因枪转化法将PCRI1210-GUS质粒导入棉花胚性愈伤组织和洋葱表皮中。棉花胚性愈伤组织在转化 前28°C高渗预培养4h(添加0.6mol.Γ1甘露醇和0.6mol.Γ1山梨醇)，采用Bio-RadPDS 1000/He基因枪进行轰击，可裂膜压力为1.1kPa0将基因枪轰击后的棉花胚性愈伤组织在MS培养基上37°C暗培养48h后进行GUS染色；洋葱表皮在MS培养基上28.(TC弱光下培养24h后荧光显微观察。结果如图6所示(图6:A为轰击了载体pCRI1210-GUS质粒的洋葱表皮荧光显微成像图片，B为轰击了载体pBI121_GUS质粒的洋葱表皮荧光显微图片，a为A图视野的相应白光视野图片，b为B图视野的相应白光视野图片)，从结果可知，报告基因EGFP在载体pCRI1210-GUS中得到较强的表达，证明表达载体中的EGFP报告基因能有较好的表达效果。同时以转化PCRI1210的棉花胚性愈伤组织和洋葱表皮作为空载体对照，以未经转化的棉花胚性愈伤组织和洋葱表皮作为空白对照。结果:空载体对照未见绿色荧光蛋白；空白对照中未见绿色荧光蛋白。(3)愈伤组织的⑶S染色⑶S染色程序为:将愈伤组织浸泡于⑶S染色液(0.1mol磷酸钠缓冲液，pH 7.0 ；Ig.171 X-Gluc ;2% DMF;0.2%吐温20)中，37 °C温育12h，再在⑶S洗液中漂洗，然后用95%乙醇37°C脱色8 10h，漂洗后重复一次，保存于75%乙醇中，室温储存。同时以转化PBI121的棉花胚性愈伤组织和洋葱表皮作为空载体对照(即阳性对照)，以未经转化的棉花胚性愈伤组织和洋葱表皮作为空白对照(即阴性对照)。结果如图7所示，(图7:A为转化pCRI11210-GUS的胚性愈伤，B为转化pBI121的胚性愈伤(阳性对照)，而C为未转化任何载体的胚性愈伤(阴性对照))，结果显示转化PCRI11210-GUS的胚性愈伤与转化pBI121的胚性愈伤(阳性对照)中⑶S的表达效率相当。( 二)含有pCRI1210-GUS载体的农杆菌对烟草的转化1、农杆菌转化感受态细胞的制备:①用接种针在YEB固体培养基平板上划线培养农杆菌LBA4404单菌落；②挑取单菌落接种于5ml含适当抗生素的YEB液体培养基中，28 °C，250rpm振荡培养过夜；③按1: 25-50接种于IOOml含适当抗生素的YEB液体培养基中，继续培养4_6h ;④将菌液冰浴30min，期间不断摇动；⑤转入2个50ml离心管，重悬沉淀，4°C，4000rpm, IOmin 去上清，加入10_15ml灭菌蒸懼水，重悬沉淀，4°C, 4000rpm, IOmin ;⑦去上清，加入IOml灭菌10%甘油，重悬沉淀，4°C,4000rpm, IOmin !⑧去上清,加入IOml灭菌10%甘油，重悬沉淀,4. ,4000Γρπι, IOmin !⑨去上清,用回流的甘油重悬沉淀；⑩用0.5ml离心管分装，每管20 μ 1，_70°C保存备用。向农杆菌LB4404感受态细胞中，加入步骤2(1)中从阳性单克隆中所提取的质粒10ul，冰上放置30分钟；浸入液氮中5分钟，迅速取出37°C水浴5分钟，然后冰浴2分钟；加入500ul YEB液体培养基，280C，175rpm震荡培养3_5小时；利用无菌的弯头玻璃棒将菌液均匀涂布在含有链霉素、利福平和卡那霉素的YEB固体培养基平板上，28°C培养直至生长出单菌落；挑取单菌落进行PCR检测，各泳道均出现目标条带。将阳性单菌落摇菌过夜，培养至0D600 = 0.3-0.6用于侵染。2、含有pCRI1210-GUS载体的农杆菌对烟草的转化用上述步骤I得到的 含有PCRI1210-GUS载体的农杆菌侵染用升汞消毒后的烟草叶片(剪成0.5X0.5cm)3分钟，移入到共培养基(MS基本培养基+6_BA(2mg/L)+IAA(0.2mg/L)中避光28°C共培养48小时。设计未转化任何载体的烟草叶片为空白对照、转化PBI121载体的烟草叶片为阳性对照和转化PCRI1210的为空载体对照。将叶片转入幼芽增殖固体培养基中(MS基本培养基+6-BA(2mg/L)+IAA(0.2mg/L)+Kan(lOOmg/L)+CB(500mg/L))，置于28°C人工气候箱中诱导幼芽分化。十天后，出现幼芽。抗性筛选:在幼芽增殖固体培养基中加入卡那霉素(100mg/L)筛选阳幼芽，阳性幼芽生长正常，呈嫩绿色，未转化成功幼芽则明显分化迟缓，呈浅白色。EGFP筛选:撕取转基因烟草幼芽叶片制成水装片，直接在荧光显微镜下观察EGFP突光，显微镜型号:Axioskop 40突光显微镜(Zeiss, Germany),激发波长(ExcitationWavelength:480±20nm),发射波长(Emission Wavelength):510±20nm,利用 CCD 进行图像的采集。叶脉呈现亮绿色荧光的为转基因阳性植株。统计阳性转化率。结果:转PCRI1210-GUS载体的幼芽中生长正常且叶脉呈现亮绿色荧光的幼芽213个，不正常且无荧光的幼芽19个，阳性幼芽占总幼芽的91.8%;转阳性对照载体PBI121的幼芽中生长正常的幼芽241个，不正常幼芽20个，阳性转化率为92.3% ；转空载体PCRI1210的幼芽中正常的幼芽235个，不正常幼芽23个，阳性转化率为91.1%。三种载体的阳性转化率相当，均达到90%以上。将抗性筛选阳性的幼芽切下放入Gus染液中染色，37°C保温培养过夜后用70%酒精脱色，组织呈现深蓝色的为⑶S检测阳性。结果显示，pCRI1210-GUS载体转化的烟草幼芽与pBI121载体转化的烟草幼芽(阳性对照)均呈现深蓝色，而未进行转化的烟草幼芽(空白对照)和转化PCRI1210的烟草幼芽变为无色半透明状(图8:A号管为未进行转化的烟草幼芽(空白对照)，B和C为pBI121载体转化的烟草幼芽(阳性对照)，D和E为PCRI1210-GUS载体转化的烟草幼芽)，结果说明pCRI1210_GUS载体中的CaMV 35S能够正常启动其下游⑶S基因在烟草幼芽中正常表达。对上述培养的烟草幼芽十五天一个周期更换培养基，直至幼芽生长到4cm左右的幼苗，将幼苗转至生根培养基，同时取叶片进行Gus染色。结果显示，pCRI1210-GUS载体转化的烟草叶片与PBI121载体转化的烟草叶片(阳性对照)均呈现深蓝色，而未进行转化的烟草叶片(空白对照)和转化PCRI1210的烟草叶片没有呈现深蓝色(图9:A为PCRI1210-GUS载体转化的烟草叶片，B为pBI121载体转化的烟草叶片(阳性对照)，C为未进行转化的烟草叶片(空白对照)；为提高染色效果，叶片均剪去边缘并用毛细玻璃管打孔)，结果说明pCRI 1210-GUS载体中的CaMV 35S能够正常启动其下游⑶S基因在烟草叶片中正常表达。上述烟草幼苗七天后出现不定根，20天后出现大量不定根，打开瓶盖炼苗24小时，将苗取出后用水冲洗根部，去除培养基，移栽到盆中。同时，取部分根放入Gus染液中染色。结果显示，PCRI1210-GUS载体转化的烟草根与pBI121载体转化的烟草根(阳性对照)均呈现深蓝色，而未进行转化的烟草根(空白对照)和转化PCRI1210的烟草根没有呈现深蓝色(图10:A为pCRI1210-GUS载体转化的烟草根，B为pBI121载体转化的烟草根(阳性对照)，C为未进行转化的烟草根(空白对照)；为提高观察效果，采用不同的背景色)，结果说明PCRI1210-GUS载体中的CaMV 35S能够正常启动其下游⑶S基因在烟草根部中正常表达。5、pCRI1210-GUS载体转化烟草的分子生物学检测分别取步 骤4中pCRI1210-GUS载体转化的烟草植株、pBI121载体转化的烟草植株(阳性对照)、未进行转化的烟草植株(空白对照)和转化pCRI 1210的为空载体对照的幼嫩叶片，提取DNA，分别用⑶S基因的特异性检测弓I物⑶SF2和⑶SR2进行PCR检测。⑶S引物序列为:⑶SF2:5’ -GAAAGCCGGGCAATTGCT-3’ 和⑶SR2:5， -CACATCACCACGCTTGGGT-3，。检测结果显示(图12:A号泳道为Makerlll，B号泳道为未进行转化的烟草植株(空白对照)，C-E号泳道为pCRI1210-GUS载体转化的烟草的不同单株，F-G号泳道为pBI121载体转化的烟草的不同单株(阳性对照))，PCRI1210-GUS载体转化的烟草与PBI121载体转化的烟草(阳性对照)在IlOObp处均出现了扩增条带，而未进行转化的烟草植株(空白对照)和转化PCRI1210的为空载体对照在此处没有出现扩增条带，此结果表明目的基因⑶S所在的载体pCRI1210已成功整合到烟草基因组DNA中，同时pCRI1210_GUS载体转化的烟草植株生长良好(图13:A为未进行转化的烟草植株(空白对照)，B为PCRI1210-GUS载体转化的烟草植株，C为pBI121载体转化的烟草植株)。(三)含有RI1210-GUS载体的农杆菌对棉花无菌苗下胚轴切段的转化用上述(二)中步骤3得到的含有RI1210-GUS载体的农杆菌侵染棉花无菌苗下胚轴切段3分钟，移入到共培养基(MS基本培养基+6-BA (2mg/L) +IAA (0.2mg/L))中28°C共培养48小时(同时设计空白对照)。将下胚轴转至脱分化培养基(MSB培养基、IAA、KT、2，4-D各0.lmg/L, 25g/L葡萄糖，2.2g/L Gel, pH = 6.5)上暗培养约20天，在超净工作台上用镊子提取少量的愈伤组织，制成水装片，直接在荧光显微镜下观察EGFP荧光，激发波长(Excitation Wavelength)为 480±20nm,发射波长(Emission Wavelength)为 510±20nm，利用CCD进行图像的采 集。结果显示，与未转化的棉花愈伤组织(空白对照)相比，转化PCRI1210-GUS载体的棉花愈伤组织中报告基因EGFP得到较强表达(图11:A为未转化的棉花愈伤组织(空白对照)，B为转化pCRI1210-GUS载体的棉花愈伤组织)。
权利要求
1.一种植物双元表达载体，是按照如下方法得到:在出发载体PBI121中构建荧光蛋白报告基因表达盒和外源基因表达盒；所述外源基因表达盒由启动子、内含子和终止子依次连接而成，所述启动子与所述内含子之间具有若干个酶切位点，所述内含子与所述终止子之间具有若干个酶切位点；构建得到的植物双元表达载体中其它位置的酶切位点与所述内含子两侧的酶切位点均不相同。
2.根据权利要求1所述的植物双元表达载体，其特征在于:所述启动子与所述内含子间的若干个酶切位点为=Xba 1、Age 1、Kpn 1、AvrII和BamH I，所述内含子与所述终止子之间的若干个酶切位点为:EcoR 1、Sac 1、Sal I和SnaB I。
3.根据权利要求2所述的植物双元表达载体，其特征在于:所述外源基因表达盒的核苷酸序列如序列4所示。
4.根据权利要求1或2所述的植物双元表达载体，其特征在于:所述构建荧光蛋白报告基因的表达盒的方法为用荧光蛋白报告基因替换所述出发载体PBI121中的GUS基因表达盒中的GUS基因，得到所述荧光蛋白报告基因的表达盒。
5.根据权利要求4所述的植物双元表达载体，其特征在于:所述荧光蛋白报告基因的为EGFP报告基因。
6.根据权利要求1或2所述的植物双元表达载体，其特征在于:所述外源基因表达盒的表达方向与所述荧光蛋白报告基因的表达盒的表达方向相反。
7.权利要求1-6中任一所述植物双元表达载体在将目的基因导入出发植物中的应用。
8.权利要求1-6中任一所述植物双元表达载体在使出发植物中的目的基因功能丧失中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:所述使出发植物中的目的基因功能丧失是通过RNA干扰实现的。
10.根据权利要求7、8或9所述的应用，其特征在于:所述出发植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为烟草或棉花；所述单子叶植物具体为洋葱。
全文摘要
本发明公开了一种植物双元表达载体。该植物双元表达载体是按照如下方法得到在出发载体pBI121中构建荧光蛋白报告基因表达盒和外源基因表达盒；所述外源基因表达盒由启动子、内含子和终止子依次连接而成，所述启动子与所述内含子之间具有若干个酶切位点，所述内含子与所述终止子之间具有若干个酶切位点；构建得到的植物双元表达载体中其它位置的酶切位点与所述内含子两侧的酶切位点均不相同。本发明所构建的植物双元表达载体可用于植物转基因过表达研究和RNAi研究；所述植物双元表达载体具有EGFP报告基因，可以方便的进行转基因植株的检测；所述植物双元表达载体具有卡那霉素抗性基因，卡那霉素抗性基因较为安全，可以高效的进行筛选和生产的应用。
文档编号C12N15/82GK103205456SQ20121001080
公开日2013年7月17日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者李付广, 尹国, 洪伟东, 张朝军, 张雪妍 申请人:中国农业科学院棉花研究所