专利名称：一种间充质干细胞的无血清完全培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种间充质干细胞的无血清完全培养基。
背景技术：
间充质干细胞是来自中胚层的成体多能干细胞，可从骨髓、骨膜、滑膜、肌肉、脂肪等多种组织中分离出来，具有定向分化为多种类型成熟细胞的潜能。在整个生命过程中，组织器官无论在稳定状态还是环境改变而受到刺激都需要间充质干细胞来不断补充更新，因此间充质干细胞成为细胞工程和组织工程理想的种子细胞，然而骨髓等组织中间充质干细胞的数量较少，难以满足临床治疗和研究方面的需求，因此需要在体外对间充质干细胞进 行大量扩增。目前，间充质干细胞的常规培养体系中均加入了一定比例的动物血清，常用的是胎牛血清。血清在细胞的体外培养体系中是必不可少的，它提供生长因子，结合蛋白，激素，并提供保护作用；然而由于血清成分复杂，且含有一些不利于细胞生长的因子或毒性物质，这些物质可能会影响研究结果，且动物血清还可能因存在病原体，而对临床应用构成威胁，此外，血清的批次之间存在差异，导致培养结果也出现差异。尽管目前已有很多无血清培养基,但大多还含有少量的动物血清。
发明内容
本发明的目的之一在于解决现有技术的不足，提供一种人间充质干细胞体外培养的无血清完全培养基，克服含血清培养基的血清批次间不稳定、有细胞毒性和大量异源蛋白等缺陷。本发明另一目的在于在体外对间充质干细胞进行大量扩增。为达到上述目的，本发明采取了如下技术方案一种间充质干细胞的无血清完全培养基，由基础培养基和添加成份构成,所述的基础培养基为DMEM/F12，所述的添加成份由重组人胰岛素、人血清白蛋白、人转铁蛋白、胆固醇、亚硒酸钠、硝酸铁和葡聚糖组成。进一步的技术方案是，所述添加成份中重组人胰岛素2 10mg/L，人血清白蛋白I 30g/L,人转铁蛋白I 10mg/L,胆固醇10 50mg/L,亚硒酸钠0. 05 0. 2mg/L,硝酸铁I 10mg/L,葡聚糖10 100mg/L。进一步的技术方案是，所述的基础培养基DMEM/F12型号包括12400-024、Gibco884400。更进一步的技术方案是，所述的无血清完全培养基用于体外培养间充质干细胞，所述的间充质干细胞包含骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果(I)本发明的培养基不含有血清，大大避免了含血清培养基的血清批次间不稳定、有细胞毒性和大量异源蛋白等缺陷，为间充质干细胞的基础研究和临床治疗提供了很好的工具。(2)本发明在促进细胞增值方面达到了与含血清培养基及其他无血清培养基接近或相当的效果，可支持细胞的长期传代培养。
图I为实施例I的流式DNA周期检测示意图。
图2为实施例2的流式DNA周期检测示意图。图3为实施例3的流式DNA周期检测示意图。
具体实施例方式实施例一IL间充质干细胞无血清完全培养基的配制将产品型号为12400-024的DMEM/F12干粉(包装10袋*1L/盒)I袋,重组人胰岛素7mg,人血清白蛋白12g,人转铁蛋白Img,胆固醇25mg,亚硒酸钠0. 185mg,硝酸铁4mg,葡聚糖50mg混合,加注射用水800ml,搅拌溶解，并用0. 5mol/L的盐酸调节pH至7. 1，定容至1L，混匀后用0. 22um滤膜过滤除菌，4°C存放。BMSCs (骨髓间充质干细胞)体外培养由医院抽取志愿者骨髓10ml，等体积铺于
I.073g/ml的淋巴细胞分离液上，2250rpm离心30min，取云雾状单个核细胞层，用生理盐水洗3次；再依次以2000rpm、1800rpm、1600rpm离心去上清液,每次离心五分钟；将去上清液后获得的细胞以上述配制的间充质干细胞无血清培养基重悬并调整密度至5X IO6Cells/ml接种于6孔板中，置37°C 5% CO2饱和湿度培养箱中培养，每隔两天去上清液更换新鲜的上述配制的间充质干细胞无血清培养基并调整密度至5X106cellS/ml，培养10天后细胞汇合度达到85%时消化收获细胞。UCMSCs (脐带间充质干细胞)体外培养将无菌取得的足月妊娠分娩胎儿脐带充分洗漆去血溃后，剔除脐带动静脉，解剖刮取Wharton’s Jelly (间质组织)，剪碎成约Imm3大小的组织块，生理盐水冲洗，用上述配制的间充质干细胞无血清完全培养基重悬，接种于培养瓶中，14天后细胞汇合度达到85%时消化收获细胞。将上述体外培养的BMSCs和UCMSCs用上述配制的间充质干细胞无血清完全培养基分别重悬并调整密度lX106cells/ml分别接种于培养瓶中，3天后细胞汇合度达到85%时消化收获细胞，为细胞周期检测和集落形成检测备用。细胞周期检测将上述备用的BMSCs和UCMSCs在上述配制的间充质干细胞无血清完全培养基中培养2代后，以0. 5 X IO4ceIlsAiL的密度接种于IOOmm培养皿中，分别培养6d后收获细胞，以-20°C预冷的70%乙醇固定，50ii g/mL碘化丙锭(PI)染色，流式细胞仪(BD公司)检测10000个细胞，结果如图骨髓间充质干细胞G0/G1期48.9%,G2/M期14. 5%，S期36.6%,脐带间充质干细胞G0/G1期49. 8%，G2/M期15.8%, S期34. 4%，高比例的G0/G1期细胞显示这两种来源的间充质干细胞具有高度的分化潜能。集落形成检测将上述备用的BMSCs和UCMSCs在上述配制的间充质干细胞无血清完全培养基中培养2代后，以200CellS/well的密度接种于预铺了 0.2%明胶的6孔板中，每3d换液，7d后结晶紫染色集落，相差显微镜下计集落数，超过50个细胞计为一个集落，每组设3个平行。按下面公式计算集落形成率集落形成率(Colony-formingefficiency, CFE) (% )=(集落数 / 接种细胞数)X100%结果显示无血清扩增后的骨髓BMSCs和脐带UCMSCs的集落形成率分别为(13. 67% ±4.04%)和(15.00% ±2. 00% )，细胞的集落形成能力无明显差异。等渗结晶紫染色细胞集落，见两组细胞的集落尺寸也无明显差异。实施例2IL间充质干细胞无血清完全培养基的配制将产品型号为Gibco 884400的DMEM/F12干粉(包装10袋*1L/盒)I袋，重组人胰岛素2mg，人血清白蛋白30g，人转铁蛋白IOmg,胆固醇IOmg,亚硒酸钠0. 05mg,硝酸铁IOmg,葡聚糖IOmg混合,加注射用水800ml,搅拌溶解，并用0. 5mol/L的盐酸调节pH至7. 1±0. I,定容至1L,混勻后用0. 22um滤膜过滤除菌，4 °C存放。BMSCs (骨髓间充质干细胞)体外培养由医院抽取志愿者骨髓10ml，等体积铺于
I.073g/ml的淋巴细胞分离液上，2250rpm离心30min，取云雾状单个核细胞层，用生理盐水洗3次；再依次以2000rpm、1800rpm、1600rpm离心去上清液，每次五分钟，将去上清液后获得的细胞以上述配制的间充质干细胞无血清培养基重悬并调整密度至5X106cellS/ml接种于6孔板中，置37°C 5% C02饱和湿度培养箱中培养，每隔两天去上清液更换新鲜的上述配制的间充质干细胞无血清培养基并调整密度至5X106cellS/ml，培养10天后细胞汇合度达到85%时消化收获细胞。UCMSCs (脐带间充质干细胞)体外培养将无菌取得的足月妊娠分娩胎儿脐带充分洗漆去血溃后，剔除脐带动静脉，解剖刮取Wharton’s Jelly (间质组织)，剪碎成约Imm3大小的组织块，生理盐水冲洗，用上述配制的间充质干细胞无血清完全培养基重悬，接种于培养瓶中，14天后细胞汇合度达到85%时消化收获细胞。将上述体外培养的BMSCs和UCMSCs用上述配制的间充质干细胞无血清完全培养基分别重悬并调整密度lX106cells/ml分别接种于培养瓶中，3天后细胞汇合度达到85%时消化收获细胞，为细胞周期检测和集落形成检测备用。细胞周期检测将上述备用的BMSCs和UCMSCs在上述配制的间充质干细胞无血清完全培养基中培养2代后，以0. 5 X IO4ceIlsAiL的密度接种于IOOmm培养皿中，分别培养6d后收获细胞，以-20°C预冷的70%乙醇固定，50ii g/mL碘化丙锭(PI)染色，流式细胞仪(BD公司)检测10000个细胞，结果如图骨髓间充质干细胞G0/G1期44. 6 %，G2/M期16. 4%，S期38. 9 %，脐带间充质干细胞G0/G1期36.4%, G2/M期14.0%, SM 49. 6%，高比例的G0/G1期细胞显示这两种来源的间充质干细胞具有高 度的分化潜能。集落形成检测将上述备用的BMSCs和UCMSCs在上述配制的间充质干细胞无血清完全培养基中培养2代后，以200CellS/well的密度接种于预铺了 0.2%明胶的6孔板中，每3d换液，7d后结晶紫染色集落，相差显微镜下计集落数，超过50个细胞计为一个集落，每组设3个平行。按下面公式计算集落形成率集落形成率(Colony-formingefficiency, CFE) (% )=(集落数 / 接种细胞数)X100%结果显示无血清扩增后的骨髓BMSCs和脐带UCMSCs的集落形成率分别为(17. 67% ±2.04%)和(16.00% ±2. 00% )，细胞的集落形成能力无明显差异。等渗结晶紫染色细胞集落，见两组细胞的集落尺寸也无明显差异。实施例3 IL间充质干细胞无血清完全培养基的配制将产品型号为12400-024的DMEM/F12干粉(包装10袋*1L/盒)I袋,重组人胰岛素IOmg,人血清白蛋白Ig,人转铁蛋白Img,胆固醇50mg,亚硒酸钠0. 2mg,硝酸铁Img,葡聚糖IOOmg混合,加注射用水800ml,搅拌溶解，并用0. 5mol/L的盐酸调节pH至7. 1±0. 1，定容至1L，混匀后用0. 22um滤膜过滤除菌，4°C存放。BMSCs (骨髓间充质干细胞)体外培养由医院抽取志愿者骨髓10ml，等体积铺于
I.073g/ml的淋巴细胞分离液上，2250rpm离心30min，取云雾状单个核细胞层，用生理盐水洗3次,再依次以2000rpm、1800rpm、1600rpm离心去上清液,每次五分钟；将去上清液的细胞以上述配制的间充质干细胞无血清培养基重悬并调整密度至5X 106cellS/ml接种于6孔板中，置37°C 5% C02饱和湿度培养箱中培养，每隔两天去上清液更换新鲜的上述配制的间充质干细胞无血清培养基并调整密度至5X 106cells/ml，培养10天后细胞汇合度达到85%时消化收获细胞。UCMSCs (脐带间充质干细胞)体外培养将无菌取得的足月妊娠分娩胎儿脐带充分洗漆去血溃后，剔除脐带动静脉，解剖刮取Wharton’s Jelly (间质组织)，剪碎成约Imm3大小的组织块，生理盐水冲洗，用上述配制的间充质干细胞无血清完全培养基重悬，接种于培养瓶中，14天后细胞汇合度达到85%时消化收获细胞。将上述体外培养的BMSCs和UCMSCs用上述配制的间充质干细胞无血清完全培养基分别重悬并调整密度lX106cells/ml分别接种于培养瓶中，3天后细胞汇合度达到85%时消化收获细胞，为细胞周期检测和集落形成检测备用。细胞周期检测将上述备用的BMSCs和UCMSCs在上述配制的间充质干细胞无血清完全培养基中培养2代后，以0. 5 X IO4ceIlsAiL的密度接种于IOOmm培养皿中，分别培养6d后收获细胞，以-20°C预冷的70%乙醇固定，50ii g/mL碘化丙锭(PI)染色，流式细胞仪(BD公司)检测10000个细胞，结果如图骨髓间充质干细胞G0/G1期45.4%,G2/MSi 7. 58%, S期46.9%,脐带间充质干细胞G0/G1期44. 9%，G2/M期19.6%，S期35. 5%，高比例的G0/G1期细胞显示这两种来源的间充质干细胞具有高度的分化潜能。集落形成检测将上述备用的BMSCs和UCMSCs在上述配制的间充质干细胞无血清完全培养基中培养2代后，以200CellS/well的密度接种于预铺了 0.2%明胶的6孔板中，每3d换液，7d后结晶紫染色集落，相差显微镜下计集落数，超过50个细胞计为一个集落，每组设3个平行。
按下面公式计算集落形成率集落形成率(Colony-formingefficiency, CFE) ( % )=(集落数 / 接种细胞数)X100%
结果显示无血清扩增后的骨髓BMSCs和脐带UCMSCs的集落形成率分别为(14. 00% ±1.64% )和(11.67% ±3.00% )，细胞的集落形成能力无明显差异。等渗结晶紫染色细胞集落，见两组细胞的集落尺寸也无明显差异。
权利要求
1.一种间充质干细胞的无血清完全培养基，由基础培养基和添加成份构成，其特征在于所述的基础培养基为DMEM/F12，所述的添加成份由重组人胰岛素、人血清白蛋白、人转铁蛋白、胆固醇、亚硒酸钠、硝酸铁和葡聚糖组成。
2.根据权利要求I所述的一种间充质干细胞的无血清完全培养基，其特征在于所述添加成份中重组人胰岛素2 10mg/L，人血清白蛋白I 30g/L，人转铁蛋白I 10mg/L,胆固醇10 50mg/L,亚硒酸钠0. 05 0. 2mg/L,硝酸铁I 10mg/L,葡聚糖10 100mg/L。
3.根据权利要求I所述的一种间充质干细胞的无血清完全培养基，其特征在于所述的基础培养基DMEM/F12的产品型号包括12400-024、Gibco884400。
4.根据权利要求1、2或3所述的一种间充质干细胞的无血清完全培养基，其特征在于所述的无血清完全培养基用于体外培养间充质干细胞，所述的间充质干细胞包含骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞。
全文摘要
本发明公开了一种间充质干细胞的无血清完全培养基，由基础培养基和添加成份构成，所述的基础培养基为DMEM/F12，所述的添加成分由重组人胰岛素、人血清白蛋白、人转铁蛋白、胆固醇、亚硒酸钠、硝酸铁和葡聚糖组成。本发明不含有血清，大大避免了含血清培养基的血清批次间不稳定、有细胞毒性和大量异源蛋白等缺陷，为间充质干细胞的基础研究和临床治疗提供了很好的工具；本发明还在促进细胞增值方面达到了与含血清培养基及其他无血清培养基接近或相当的效果，可支持细胞的长期传代培养。
文档编号C12N5/0775GK102634482SQ20121001024
公开日2012年8月15日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者张琼, 戴成祥, 邓涛 申请人:成都美进生物科技有限公司