专利名称：一种分离玉米青枯病原腐霉菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种分离方法，具体的说是一种分离玉米青枯病原腐霉菌的方法。
背景技术：
玉米青枯病是世界玉米产区普遍发生的一种土传病害。在我国各地的玉米产区也相继发生且比较严重，从而严重影响玉米的产量，一般玉米青枯病的发病率为10%-20%， 多雨季节发病严重，最高可达80%以上。一般情况下按病情发展速度和田间症状可分为急性型和普通型。急性型多发生在玉米生长后期乍雨乍晴的天气，又称青枯型，发病速度快， 通常在1-2天内全株迅速失水枯萎，似开水烫，呈灰绿色青枯状，茎基部可见维管束已变褐色，最后导致水渍状坏死，果穗下垂。普通型多在连续阴雨的天气发生，又称黄枯型，病情发展较慢，一般在5-10天全株才表现症状，整株叶片自下端开始依次黄枯，有时也呈现水烫状青黄枯，茎基初呈褐色水渍状斑，表皮失水轻微皱缩，进而变软成条纹凹陷，严重者叶片全部黄枯，根坏死，果穗下垂，茎基髓部中空，极易倒伏。玉米青枯病是一种典型的土传病害，且为多种病菌侵染所致，其病原菌又为多寄主和半腐生性，病原菌在土壤、肥料、病株残体和种子上越冬。目前对于玉米青枯病病原菌的分离尚不完善，没有可行的分离方法。
发明内容
本发明针对上述问题的不足，提供一种分离玉米青枯病原腐霉菌的方法，利用分离玉米青枯病原腐霉菌培养基将玉米青枯病原腐霉菌种进行分离，其分离方法简单。本发明涉及的试剂DNA凝胶回收试剂盒购买于碧云天生物技术研究所，该试剂盒中自配有成品的DNA纯化结合液，洗涤液，洗脱液，DNA纯化柱，收集管；
本发明为解决上述问题所采用的技术方案是一种分离玉米青枯病原腐霉菌的方法， 分离玉米青枯病原腐霉菌所用的分离培养基的原料由琼脂、葡萄糖、马铃薯、酵母浸膏和复合抗生素母液组成，各原料的加入量是15 — 30g的琼脂、15 — 30g的葡萄糖、150—300g的马铃薯、0. 8—1. 5g的酵母浸膏和0. 4—0. 7mL的复合抗生素母液；
利用分离培养基分离玉米青枯病原腐霉菌的方法，包括以下步骤为 步骤一、抗生素培养基的配制
1)在浓度为80万U/瓶的青霉素钠中加入无菌去离子水，混合均勻，制得浓度为20万 U/mL的母液a，备用；
2)在浓度为100万U/瓶的硫酸链霉素中加入无菌去离子水，混合均勻，制得浓度为20 万U/mL的母液b，备用；
3)按重量份数比取1份的浓度为20万U/mL的母液a和1份的浓度为20万U/mL的母液b，混合均勻，制得浓度为10万U/mL的复合抗生素母液，备用；
步骤4)在4000mL的水中加入400_600g的马铃薯，煮30— 40分钟，过滤，得到马铃薯滤液，备用；步骤5)在1500mL的马铃薯滤液中加入15 — 30g的琼脂、15 — 30g的葡萄糖和0. 8— 1. 5g的酵母浸膏，加热至80—90°C，使琼脂溶解，形成含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基煮至IOOOmL时，后将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基分装于10个三角瓶中，每瓶IOOmL,后将每个三角瓶放入高压灭菌锅内，在压强为1.05kg/cm2，温度为121°C，灭菌40分钟，取出，后在21°C条件下冷却至 60°C止，在每个含有酵母浸膏马铃薯葡萄糖琼脂培养基的三角瓶内加入0. 4-0. 7mL步骤 3)中得到的复合抗生素母液，混合均勻，使每个三角瓶内的抗生素浓度为20U/mL，制得抗生素培养基，后将抗生素培养基倒入无菌培养皿内，每个培养皿内抗生素培养基的含量为 30mL，放置40分钟，得到加富马铃薯葡萄糖琼脂抗生素分离平板，备用；
步骤6)取步骤4)中得到的IOOOmL马铃薯滤液，在滤液中加入15 — 30g的琼脂、15— 30g的葡萄糖，0. 8—1. 5g的酵母浸膏，加热至80— 90°C，使琼脂溶解，后将溶液定容至 lOOOmL，形成含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，后将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基分装于10个三角瓶中，每瓶IOOmL,然后将每个三角瓶放入高压灭菌锅内，在压强为1.05kg/cm2，温度为121°C，灭菌40分钟，取出，后在21°C条件下冷却至60°C止，将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基倒入无菌培养皿内，每个培养皿内含有30mL的培养基，得到加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板，备用； 步骤二、病原菌的萌发
1)将含有病原菌的玉米杆，剥离叶片，用保鲜膜将玉米杆包装好并放于10°C条件下，放置3天。2)用75%的酒精将含有病原菌的玉米杆外侧消毒，剪成IOcm的小段，剖开玉米茎杆，将病变组织暴露，取三个直径为Icm的病变组织块，将病变组织块接种到加富马铃薯葡萄糖琼脂抗生素分离平板中，在条件下，培养3-5天，得到萌发后的病原菌，备用；
步骤三、在步骤一中得到的加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板内，接种步骤二中得到的萌发后的病原菌，在条件下，培养3-5天，得到纯化后的菌株，备用；
步骤四、依据步骤三的方法，在加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板内接种步骤三得到的纯化后的菌株，在条件下，培养3-5天，进一步纯化得到玉米青枯病原腐霉菌株，备用；
步骤五、将步骤四中的得到全部玉米青枯病原腐霉菌接种到加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，在条件下，培养6天，得到玉米青枯病原腐霉菌丝，即分离得到玉米青枯病原腐霉菌。有益效果
本发明的分离玉米青枯病原腐霉菌的培养基，制备方便，便于操作，成本低廉，便于配制，降低生产成本，提高劳动效率。本发明中所提供的培养基配方是在马铃薯葡萄糖琼脂培养基的基础上，加入酵母浸膏，后加入青霉素和硫酸链霉素，制得终浓度在20U/mL的抗生素培养基，在排除细菌污染的情况下，准确、快速的将玉米青枯病原腐霉菌分离。本发明利用分离玉米青枯病原腐霉菌培养基分离玉米青枯病原腐霉菌的方法，其制备方法简单，操作简便，便于广泛应用。
图1为扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱；
图2为rDNAITS序列的玉米青枯病原腐霉菌的系统发育树；
图中Marker 自上而下分别为 2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp，检测样品为扩增产物的目的片段，其检测片段为889bp。
具体实施例方式一种分离玉米青枯病原腐霉菌的方法，分离玉米青枯病原腐霉菌所用的分离培养基的原料由琼脂、葡萄糖、马铃薯、酵母浸膏和复合抗生素母液组成，各原料的加入量是 15—30g的琼脂、15—30g的葡萄糖、150—300g的马铃薯、0. 8—1. 5g的酵母浸膏和0. 4—
0.7mL的复合抗生素母液；
利用分离培养基分离玉米青枯病原腐霉菌的方法，包括以下步骤为 步骤一、抗生素培养基的配制
1)在浓度为80万U/瓶的青霉素钠中加入无菌去离子水，混合均勻，制得浓度为20万 U/mL的母液a，备用；
2)在浓度为100万U/瓶的硫酸链霉素中加入无菌去离子水，混合均勻，制得浓度为20 万U/mL的母液b，备用；
3)按重量份数比取1份的浓度为20万U/mL的母液a和1份的浓度为20万U/mL的母液b，混合均勻，制得浓度为10万U/mL的复合抗生素母液，备用；
步骤4)在4000mL的水中加入400_600g的马铃薯，煮30—40分钟，过滤，得到马铃薯滤液，备用；
步骤5)在1500mL的马铃薯滤液中加入15 — 30g的琼脂、15 — 30g的葡萄糖和0. 8—
1.5g的酵母浸膏，加热至80—90°C，使琼脂溶解，形成含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基煮至IOOOmL时，后将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基分装于10个三角瓶中，每瓶IOOmL,后将每个三角瓶放入高压灭菌锅内，在压强为1.05kg/cm2，温度为121°C，灭菌40分钟，取出，后在21°C条件下冷却至 60°C止，在每个含有酵母浸膏马铃薯葡萄糖琼脂培养基的三角瓶内加入0. 4-0. 7mL步骤 3)中得到的复合抗生素母液，混合均勻，使每个三角瓶内的抗生素浓度为20U/mL，制得抗生素培养基，后将抗生素培养基倒入无菌培养皿内，每个培养皿内抗生素培养基的含量为 30mL，放置40分钟，得到加富马铃薯葡萄糖琼脂抗生素分离平板，备用；
步骤6)取步骤4)中得到的IOOOmL马铃薯滤液，在滤液中加入15 — 30g的琼脂、15— 30g的葡萄糖，0. 8—1.5g的酵母浸膏，加热至80— 90°C，使琼脂溶解，后将溶液定容至 lOOOmL，形成含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，后将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基分装于10个三角瓶中，每瓶IOOmL,然后将每个三角瓶放入高压灭菌锅内，在压强为1.05kg/cm2，温度为121°C，灭菌40分钟，取出，后在21°C条件下冷却至60°C止，将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基倒入无菌培养皿内，每个培养皿内含有30mL的培养基，得到加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板，备用； 步骤二、病原菌的萌发
1)将含有病原菌的玉米杆，剥离叶片，用保鲜膜将玉米杆包装好并放于10°C条件下，放置3天。 2)用75%的酒精将含有病原菌的玉米杆外侧消毒，剪成IOcm的小段，剖开玉米茎杆，将病变组织暴露，取三个直径为Icm的病变组织块，将病变组织块接种到加富马铃薯葡萄糖琼脂抗生素分离平板中，在条件下，培养3-5天，得到萌发后的病原菌，备用；
步骤三、在步骤一中得到的加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板内，接种步骤二中得到的萌发后的病原菌，在条件下，培养3-5天，得到纯化后的菌株，备用；
步骤四、依据步骤三的方法，在加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板内接种步骤三得到的纯化后的菌株，在条件下，培养3-5天，进一步纯化得到玉米青枯病原腐霉菌株，备用；
步骤五、将步骤四中的得到全部玉米青枯病原腐霉菌接种到加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，在条件下，培养6天，得到玉米青枯病原腐霉菌丝，即分离得到玉米青枯病原腐霉菌，备用；
后利用分子生物学分离鉴定玉米青枯病原腐霉菌
步骤一、玉米青枯病原腐霉菌DNA的提取
1)在研钵内加入0.5mg的玉米青枯病原腐霉菌丝、ImL的SDS裂解液和ImL的石英砂， 研磨均勻，形成勻浆液，后在1. 5mL离心管a内加入ImL的勻浆液，将含有勻浆液的1. 5mL 离心管a在65°C条件下，放置10分钟，取出，然后在1.5mL离心管a内加入120 μ L浓度为 7. 5mol/L的乙酸铵溶液，混合均勻，后将1. 5mL离心管a置于0°C的冰水混合物中，放置8 分钟，取出，将1. 5mL离心管a送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上清液，备用；
2)在1.5mL离心管b中加入500 μ L的上清液、50 μ L浓度为3mol/L的NaAc和300 μ L 的异丙醇，混合均勻，形成混合液I，将含有混合液I的1. 5mL离心管b置于0°C的冰水混合物中，放置8分钟，取出，后将1. 5mL离心管b送入离心机内，以转速为13000转/分钟， 离心10分钟，弃去上清液，得到沉淀物，后在含有沉淀物的1.5!^离心管13内加入20(^1^ 的TE溶液，使沉淀物溶解，然后加入200 μ L的氯仿和异戊醇混合液，混合均勻，形成混合液 II，备用；
3)在1.5mL离心管c中加入200 μ L的混合液II、20 μ L的浓度为3mol/L的NaAc和 700 μ L的无水乙醇，混合均勻，后将1. 5mL离心管c送入离心机内，以转速为13000转/分钟，离心8分钟，弃去上清液，得到下层沉淀，后用浓度为70%的乙醇对1. 5mL离心管c中的沉淀洗涤1一2次，待乙醇挥发完毕后，后加入1. 5mL离心管c中加入20 μ L的TE溶液，得到玉米青枯病原腐霉菌DNA，备用；
步骤二、玉米青枯病原腐霉菌DNA的转接及纯化
1)ITS引物序列
ITSl 5 ‘ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ‘
ITS4 5 ‘ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ‘
2)在0.5mL离心管a中加入2. 0 μ L的10倍缓冲液、0. 5 μ L的dNTP、0. 5 μ L的ITS4 引物、0. 5μ L的ITSl引物、0. 5μ L的Taq聚合酶和20. 0 μ L的去离子水，混合均勻，得到混合液III，备用；
3)将含有混合液III的0.5ml离心管I放入基因扩增仪中，进行PCR扩增，PCR扩增程序为94°C预变性2分钟，94 °C变性40秒，59°C退火40秒，72°C延伸100秒，变性、退火和延伸为一次循环，共35次循环，后72°C再次延伸10分钟，取出，得到扩增产物，备用；
步骤三、扩增产物的分离、鉴定
1)利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，在凝胶成像系统中确认扩增产物中含有889bp 的目的条带，备用；
2)用DNA凝胶回收试剂盒对扩增产物进行回收、纯化
取1. 5ml离心管d并称其重量，在紫外灯下将扩增产物从步骤1)中的凝胶上切下，将切下的扩增产物放在已称重的1. 5ml离心管d中，称取1. 5ml离心管d的总重并计算出从凝胶上切下来的扩增产物的重量，然后将1. 5ml离心管d中的扩增产物捣碎，按扩增产物的克数加入相同毫升数的DNA纯化结合液，混合均勻，将1. 5ml离心管放置在50° C水浴中加热至扩增产物完全融解，得到混合液IV，将混合液IV加到DNA纯化柱上，DNA纯化柱位于收集管中，收集管在21°C条件下放置1分钟，将收集管放入离心机中，转速为12000转/分钟， 离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，向DNA纯化柱上加入 700微升的洗涤液，将DNA纯化柱置于收集管内，后将收集管在21°C条件下放置1分钟，后将收集管放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，向DNA纯化柱上加入500微升的洗涤液，将DNA纯化柱置于收集管内，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，将DNA纯化柱置于收集管内，然后将收集管放入离心机内，转速 13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱放置于1. 5ml离心管e中，后在DNA纯化柱上加入40微升洗脱液，将1. 5ml离心管e在21°C条件下放置1分钟，然后将收集管放入离心机内转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱得到1. 5ml离心管中e中的液体， 备用；
3)将步骤2)中回收、纯化后的液体进行测序，并在Genbank进行比对，确定为玉米青枯病原腐霉菌；
所述的DNA纯化结合液的组成成份每升DNA纯化结合液中含有25mmol的葡萄糖、 IOmmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、5mmol的乙二胺四乙酸，余量为水；
所述的洗涤液的组成成份按重量百分比洗涤液中含有8%的十二烷基硫酸钠，余量为
水；
所述的洗脱液的组成成份每升洗脱液中含50mmol的三羟甲基氨基甲烷、IOmmol的乙二胺四乙酸，余量为水；
所述的SDS裂解液的组成成份每升SDS裂解液中含有50mM的三羟甲基氨基甲烷和 IOg的十二烷基硫酸钠，余量为水；
所述的氯仿和异戊醇混合液的组成成分按体积比氯仿和异戊醇混合液中含有对份的氯仿和1份的戊醇；
所述的TE溶液的组成成份每升TE溶液中含有IOmmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、 Immol的乙二胺四乙酸，余量为水。
实施例1
一种利用分离培养基分离玉米青枯病原腐霉菌的方法，包括以下步骤为
步骤一、抗生素培养基的配制1)在浓度为80万U/瓶的青霉素钠中加入无菌去离子水，混合均勻，制得浓度为20万 U/mL的母液a，备用；
2)在浓度为100万U/瓶的硫酸链霉素中加入无菌去离子水，混合均勻，制得浓度为20 万U/mL的母液b，备用；
3)按重量份数比取1份的浓度为20万U/mL的母液a和1份的浓度为20万U/mL的母液b，混合均勻，制得浓度为10万U/mL的复合抗生素母液，备用；
步骤4)在4000mL的水中加入400g的马铃薯，煮30分钟，过滤，得到马铃薯滤液，备
用；
步骤5)在1500mL的马铃薯滤液中加入15g的琼脂、15g的葡萄糖和0. Sg的酵母浸膏，加热至80°C，使琼脂溶解，形成含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基煮至IOOOmL时，后将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基分装于10个三角瓶中，每瓶IOOmL,后将每个三角瓶放入高压灭菌锅内，在压强为 1. 05kg/cm2，温度为121°C，灭菌40分钟，取出，后在21°C条件下冷却至60°C止，在每个含有酵母浸膏马铃薯葡萄糖琼脂培养基的三角瓶内加入0. 4mL步骤3)中得到的复合抗生素母液，混合均勻，使每个三角瓶内的抗生素浓度为20U/mL，制得抗生素培养基，后将抗生素培养基倒入无菌培养皿内，每个培养皿内抗生素培养基的含量为30mL，放置40分钟，得到加富马铃薯葡萄糖琼脂抗生素分离平板，备用；
步骤6)取步骤4)中得到的IOOOmL马铃薯滤液，在滤液中加入15g的琼脂、15g的葡萄糖，0. Sg的酵母浸膏，加热至80°C，使琼脂溶解，后将溶液定容至IOOOmL,形成含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，后将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基分装于10 个三角瓶中，每瓶IOOmL,然后将每个三角瓶放入高压灭菌锅内，在压强为1. 05kg/cm2，温度为121°C，灭菌40分钟，取出，后在21°C条件下冷却至60°C止，将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基倒入无菌培养皿内，每个培养皿内含有30mL的培养基，得到加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板，备用； 步骤二、病原菌的萌发
1)将含有病原菌的玉米杆，剥离叶片，用保鲜膜将玉米杆包装好并放于10°C条件下，放置3天。 2)用75%的酒精将含有病原菌的玉米杆外侧消毒，剪成IOcm的小段，剖开玉米茎杆，将病变组织暴露，取三个直径为Icm的病变组织块，将病变组织块接种到加富马铃薯葡萄糖琼脂抗生素分离平板中，在条件下，培养3天，得到萌发后的病原菌，备用；
步骤三、在步骤一中得到的加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板内，接种步骤二中得到的萌发后的病原菌，在条件下，培养3天，得到纯化后的菌株，备用；
步骤四、依据步骤三的方法，在加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板内接种步骤三得到的纯化后的菌株，在条件下，培养3天，进一步纯化得到玉米青枯病原腐霉菌株，备用； 步骤五、将步骤四中的得到全部玉米青枯病原腐霉菌接种到加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，在条件下，培养6天，得到玉米青枯病原腐霉菌丝，备用； 步骤六、玉米青枯病原腐霉菌DNA的提取
1)在研钵内加入0. 5mg的玉米青枯病原腐霉菌丝、ImL的SDS裂解液和ImL的石英砂， 研磨均勻，形成勻浆液，后在1.5mL离心管a内加入ImL的勻浆液，将含有勻浆液的1. 5mL离心管a在65°C条件下，放置10分钟，取出，然后在1.5mL离心管a内加入120 μ L浓度为 7. 5mol/L的乙酸铵溶液，混合均勻，后将1. 5mL离心管a置于0°C的冰水混合物中，放置8 分钟，取出，将1. 5mL离心管a送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上清液，备用；
2)在1.5mL离心管b中加入500 μ L的上清液、50 μ L浓度为3mol/L的NaAc和300 μ L 的异丙醇，混合均勻，形成混合液I，将含有混合液I的1. 5mL离心管b置于0°C的冰水混合物中，放置8分钟，取出，后将1. 5mL离心管b送入离心机内，以转速为13000转/分钟， 离心10分钟，弃去上清液，得到沉淀物，后在含有沉淀物的1. 5mL离心管b内加入200 μ L 的TE溶液，使沉淀物溶解，然后加入200 μ L的氯仿和异戊醇混合液，混合均勻，形成混合液 II，备用；
3)在1.5mL离心管c中加入200 μ L的混合液II、20 μ L的浓度为3mol/L的NaAc和 700 μ L的无水乙醇，混合均勻，后将1. 5mL离心管c送入离心机内，以转速为13000转/分钟，离心8分钟，弃去上清液，得到下层沉淀，后用浓度为70%的乙醇对1. 5mL离心管c中的沉淀洗涤1次，待乙醇挥发完毕后，后加入1. 5mL离心管c中加入20 μ L的TE溶液，得到玉米青枯病原腐霉菌DNA，备用；
步骤七、玉米青枯病原腐霉菌DNA的转接及纯化
1)ITS引物序列
ITSl 5 ‘ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ‘
ITS4 5 ‘ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ‘
2)在0.5mL离心管a中加入2. 0 μ L的10倍缓冲液、0. 5 μ L的dNTP、0. 5 μ L的ITS4 引物、0. 5 μ L的ITSl引物、0. 5 μ L的Taq聚合酶和20. 0 μ L的去离子水，混合均勻，得到混合液III，备用；
3)将含有混合液III的0.5ml离心管I放入基因扩增仪中，进行PCR扩增，PCR扩增程序为94°C预变性2分钟，94 °C变性40秒，59°C退火40秒，72°C延伸100秒，变性、退火和延伸为一次循环，共35次循环，后72°C再次延伸10分钟，取出，得到扩增产物，备用；
步骤八、扩增产物的分离、鉴定
1)称取0.25克琼脂糖粉末加到含有25毫升琼脂糖凝胶电泳缓冲液的三角瓶中，将三角瓶内琼脂糖凝胶电泳缓冲液加热至沸腾并使琼脂糖粉末充分溶解，加入2微升的溴化乙锭溶液，至混合均勻止，后倒入琼脂糖制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔，将凝胶放入含有琼脂糖凝胶电泳缓冲液的电泳凝胶盒中，在凝胶的点样孔中分别加入5微升的扩增产物和2微升DNA分子量标准Marker，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为100伏特时开始电泳，电泳30分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中观察到889bp的条带时，备用；
2)用DNA凝胶回收试剂盒对扩增产物进行回收、纯化
取1. 5ml离心管d并称其重量，在紫外灯下将扩增产物从步骤1)中的凝胶上切下，将切下的扩增产物放在已称重的1. 5ml离心管d中，称取1. 5ml离心管d的总重并计算出从凝胶上切下来的扩增产物的重量，然后将1. 5ml离心管d中的扩增产物捣碎，按扩增产物的克数加入相同毫升数的DNA纯化结合液，混合均勻，将1. 5ml离心管放置在50° C水浴中加热至扩增产物完全融解，得到混合液IV，将混合液IV加到DNA纯化柱上，DNA纯化柱位于收集管中，收集管在21°C条件下放置1分钟，将收集管放入离心机中，转速为12000转/分钟， 离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，向DNA纯化柱上加入 700微升的洗涤液，将DNA纯化柱置于收集管内，后将收集管在21°C条件下放置1分钟，后将收集管放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，向DNA纯化柱上加入500微升的洗涤液，将DNA纯化柱置于收集管内，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，将DNA纯化柱置于收集管内，然后将收集管放入离心机内，转速 13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱放置于1. 5ml离心管e中，后在DNA纯化柱上加入40微升洗脱液，将1. 5ml离心管e在21°C条件下放置1分钟，然后将收集管放入离心机内转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱得到1. 5ml离心管中e中的液体，
3)将步骤2)中回收、纯化后的液体进行测序，后将测出的DNA序列在基因库Genbank 进行BLAST比对，结果表明，本发明测出的液体序列与DNA序列数据库中登录编号为 AY598627. 1和AY5986^. 1的序列具有同源性，且同源性为98%，在BLAST系统发育树上观察到玉米青枯病原腐霉菌，登录编号(AY598627. 1)为芒孢腐霉菌，登录编号(AY5986^. 1) 为强雄腐霉菌，根据rDNA的ITS区序列的一般分析准则，本发明中分离检测的霉菌为玉米青枯病原腐霉菌。
实施例2
一种利用分离培养基分离玉米青枯病原腐霉菌的方法，包括以下步骤为
步骤一、抗生素培养基的配制
1)在浓度为80万U/瓶的青霉素钠中加入无菌去离子水，混合均勻，制得浓度为20万 U/mL的母液a，备用；
2)在浓度为100万U/瓶的硫酸链霉素中加入无菌去离子水，混合均勻，制得浓度为20 万U/mL的母液b，备用；
3)按重量份数比取1份的浓度为20万U/mL的母液a和1份的浓度为20万U/mL的母液b，混合均勻，制得浓度为10万U/mL的复合抗生素母液，备用；
步骤4)在4000mL的水中加入500g的马铃薯，煮35分钟，过滤，得到马铃薯滤液，备
用；
步骤5)在1500mL的马铃薯滤液中加入22g的琼脂、22g的葡萄糖和1. 2g的酵母浸膏，加热至85°C，使琼脂溶解，形成含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基煮至IOOOmL时，后将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基分装于10个三角瓶中，每瓶IOOmL,后将每个三角瓶放入高压灭菌锅内，在压强为 1. 05kg/cm2，温度为121°C，灭菌40分钟，取出，后在21°C条件下冷却至60°C止，在每个含有酵母浸膏马铃薯葡萄糖琼脂培养基的三角瓶内加入0. 6mL步骤3)中得到的复合抗生素母液，混合均勻，使每个三角瓶内的抗生素浓度为20U/mL，制得抗生素培养基，后将抗生素培养基倒入无菌培养皿内，每个培养皿内抗生素培养基的含量为30mL，放置40分钟，得到加富马铃薯葡萄糖琼脂抗生素分离平板，备用；
步骤6)取步骤4)中得到的IOOOmL马铃薯滤液，在滤液中加入22g的琼脂、22g的葡萄糖，1. 2g的酵母浸膏，加热至85°C，使琼脂溶解，后将溶液定容至IOOOmL,形成含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，后将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基分装于10 个三角瓶中，每瓶IOOmL,然后将每个三角瓶放入高压灭菌锅内，在压强为1. 05kg/cm2，温度为121°C，灭菌40分钟，取出，后在21°C条件下冷却至60°C止，将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基倒入无菌培养皿内，每个培养皿内含有30mL的培养基，得到加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板，备用； 步骤二、病原菌的萌发
1)将含有病原菌的玉米杆，剥离叶片，用保鲜膜将玉米杆包装好并放于10°C条件下，放置3天。 2)用75%的酒精将含有病原菌的玉米杆外侧消毒，剪成IOcm的小段，剖开玉米茎杆，将病变组织暴露，取三个直径为Icm的病变组织块，将病变组织块接种到加富马铃薯葡萄糖琼脂抗生素分离平板中，在条件下，培养4天，得到萌发后的病原菌，备用；
步骤三、在步骤一中得到的加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板内，接种步骤二中得到的萌发后的病原菌，在条件下，培养4天，得到纯化后的菌株，备用；
步骤四、依据步骤三的方法，在加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板内接种步骤三得到的纯化后的菌株，在条件下，培养4天，进一步纯化得到玉米青枯病原腐霉菌株，备用； 步骤五、将步骤四中的得到全部玉米青枯病原腐霉菌接种到加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，在条件下，培养6天，得到玉米青枯病原腐霉菌丝，备用； 步骤六、玉米青枯病原腐霉菌DNA的提取
1)在研钵内加入0.5mg的玉米青枯病原腐霉菌丝、ImL的SDS裂解液和ImL的石英砂， 研磨均勻，形成勻浆液，后在1.5mL离心管a内加入ImL的勻浆液，将含有勻浆液的1. 5mL 离心管a在65°C条件下，放置10分钟，取出，然后在1.5mL离心管a内加入120 μ L浓度为 7. 5mol/L的乙酸铵溶液，混合均勻，后将1. 5mL离心管a置于0°C的冰水混合物中，放置8 分钟，取出，将1. 5mL离心管a送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上清液，备用；
2)在1.5mL离心管b中加入500 μ L的上清液、50 μ L浓度为3mol/L的NaAc和300 μ L 的异丙醇，混合均勻，形成混合液I，将含有混合液I的1. 5mL离心管b置于0°C的冰水混合物中，放置8分钟，取出，后将1. 5mL离心管b送入离心机内，以转速为13000转/分钟， 离心10分钟，弃去上清液，得到沉淀物，后在含有沉淀物的1. 5mL离心管b内加入200 μ L 的TE溶液，使沉淀物溶解，然后加入200 μ L的氯仿和异戊醇混合液，混合均勻，形成混合液 II，备用；
3)在1.5mL离心管c中加入200 μ L的混合液II、20 μ L的浓度为3mol/L的NaAc和 700 μ L的无水乙醇，混合均勻，后将1. 5mL离心管c送入离心机内，以转速为13000转/分钟，离心8分钟，弃去上清液，得到下层沉淀，后用浓度为70%的乙醇对1. 5mL离心管c中的沉淀洗涤1次，待乙醇挥发完毕后，后加入1. 5mL离心管c中加入20 μ L的TE溶液，得到玉米青枯病原腐霉菌DNA，备用；
步骤七、玉米青枯病原腐霉菌DNA的转接及纯化 1)ITS引物序列
ITSl 5 ‘ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ‘ ITS4 5 ‘ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ‘2)在0.5mL离心管a中加入2. 0 μ L的10倍缓冲液、0. 5 μ L的dNTP、0. 5 μ L的ITS4 引物、0. 5 μ L的ITSl引物、0. 5 μ L的Taq聚合酶和20. 0 μ L的去离子水，混合均勻，得到混合液III，备用；
3)将含有混合液III的0.5ml离心管I放入基因扩增仪中，进行PCR扩增，PCR扩增程序为94°C预变性2分钟，94 °C变性40秒，59°C退火40秒，72°C延伸100秒，变性、退火和延伸为一次循环，共35次循环，后72°C再次延伸10分钟，取出，得到扩增产物，备用；
步骤八、扩增产物的分离、鉴定
1)称取0.25克琼脂糖粉末加到含有25毫升琼脂糖凝胶电泳缓冲液的三角瓶中，将三角瓶内琼脂糖凝胶电泳缓冲液加热至沸腾并使琼脂糖粉末充分溶解，加入2微升的溴化乙锭溶液，至混合均勻止，后倒入琼脂糖制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔，将凝胶放入含有琼脂糖凝胶电泳缓冲液的电泳凝胶盒中，在凝胶的点样孔中分别加入5微升的扩增产物和2微升DNA分子量标准Marker，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为100伏特时开始电泳，电泳30分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中观察到889bp的条带时，备用；
2)用DNA凝胶回收试剂盒对扩增产物进行回收、纯化
取1. 5ml离心管d并称其重量，在紫外灯下将扩增产物从步骤1)中的凝胶上切下，将切下的扩增产物放在已称重的1. 5ml离心管d中，称取1. 5ml离心管d的总重并计算出从凝胶上切下来的扩增产物的重量，然后将1. 5ml离心管d中的扩增产物捣碎，按扩增产物的克数加入相同毫升数的DNA纯化结合液，混合均勻，将1. 5ml离心管放置在50°C水浴中加热至扩增产物完全融解，得到混合液IV，将混合液IV加到DNA纯化柱上，DNA纯化柱位于收集管中，收集管在21°C条件下放置1分钟，将收集管放入离心机中，转速为12000转/分钟， 离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，向DNA纯化柱上加入 700微升的洗涤液，将DNA纯化柱置于收集管内，后将收集管在21°C条件下放置1分钟，后将收集管放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，向DNA纯化柱上加入500微升的洗涤液，将DNA纯化柱置于收集管内，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，将DNA纯化柱置于收集管内，然后将收集管放入离心机内，转速 13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱放置于1. 5ml离心管e中，后在DNA纯化柱上加入40微升洗脱液，将1. 5ml离心管e在21°C条件下放置1分钟，然后将收集管放入离心机内转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱得到1. 5ml离心管中e中的液体，
3)将步骤2)中回收、纯化后的液体进行测序，后将测出的DNA序列在基因库Genbank 进行BLAST比对，结果表明，本发明测出的液体序列与DNA序列数据库中登录编号为 AY598627. 1和AY5986^. 1的序列具有同源性，且同源性为98%，在BLAST系统发育树上观察到玉米青枯病原腐霉菌，登录编号(AY598627. 1)为芒孢腐霉菌，登录编号(AY5986^. 1) 为强雄腐霉菌，根据rDNA的ITS区序列的一般分析准则，本发明中分离检测的霉菌为玉米青枯病原腐霉菌。
实施例3
一种利用分离培养基分离玉米青枯病原腐霉菌的方法，包括以下步骤为步骤一、抗生素培养基的配制
1)在浓度为80万U/瓶的青霉素钠中加入无菌去离子水，混合均勻，制得浓度为20万 U/mL的母液a，备用；
2)在浓度为100万U/瓶的硫酸链霉素中加入无菌去离子水，混合均勻，制得浓度为20 万U/mL的母液b，备用；
3)按重量份数比取1份的浓度为20万U/mL的母液a和1份的浓度为20万U/mL的母液b，混合均勻，制得浓度为10万U/mL的复合抗生素母液，备用；
步骤4)在4000mL的水中加入600g的马铃薯，煮40分钟，过滤，得到马铃薯滤液，备
用；
步骤5)在1500mL的马铃薯滤液中加入30g的琼脂、30g的葡萄糖和1. 5g的酵母浸膏，加热至90°C，使琼脂溶解，形成含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基煮至IOOOmL时，后将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基分装于10个三角瓶中，每瓶IOOmL,后将每个三角瓶放入高压灭菌锅内，在压强为 1. 05kg/cm2，温度为121°C，灭菌40分钟，取出，后在21°C条件下冷却至60°C止，在每个含有酵母浸膏马铃薯葡萄糖琼脂培养基的三角瓶内加入0. 7mL步骤3)中得到的复合抗生素母液，混合均勻，使每个三角瓶内的抗生素浓度为20U/mL，制得抗生素培养基，后将抗生素培养基倒入无菌培养皿内，每个培养皿内抗生素培养基的含量为30mL，放置40分钟，得到加富马铃薯葡萄糖琼脂抗生素分离平板，备用；
步骤6)取步骤4)中得到的IOOOmL马铃薯滤液，在滤液中加入30g的琼脂、30g的葡萄糖，1. 5g的酵母浸膏，加热至90°C，使琼脂溶解，后将溶液定容至IOOOmL,形成含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，后将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基分装于10 个三角瓶中，每瓶IOOmL,然后将每个三角瓶放入高压灭菌锅内，在压强为1. 05kg/cm2，温度为121°C，灭菌40分钟，取出，后在21°C条件下冷却至60°C止，将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基倒入无菌培养皿内，每个培养皿内含有30mL的培养基，得到加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板，备用； 步骤二、病原菌的萌发
1)将含有病原菌的玉米杆，剥离叶片，用保鲜膜将玉米杆包装好并放于10°C条件下，放置3天。 2)用75%的酒精将含有病原菌的玉米杆外侧消毒，剪成IOcm的小段，剖开玉米茎杆，将病变组织暴露，取三个直径为Icm的病变组织块，将病变组织块接种到加富马铃薯葡萄糖琼脂抗生素分离平板中，在条件下，培养5天，得到萌发后的病原菌，备用；
步骤三、在步骤一中得到的加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板内，接种步骤二中得到的萌发后的病原菌，在条件下，培养5天，得到纯化后的菌株，备用；
步骤四、依据步骤三的方法，在加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板内接种步骤三得到的纯化后的菌株，在条件下，培养5天，进一步纯化得到玉米青枯病原腐霉菌株，备用； 步骤五、将步骤四中的得到全部玉米青枯病原腐霉菌接种到加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，在条件下，培养6天，得到玉米青枯病原腐霉菌丝，备用； 步骤六、玉米青枯病原腐霉菌DNA的提取
1)在研钵内加入0. 5mg的玉米青枯病原腐霉菌丝、ImL的SDS裂解液和ImL的石英砂，研磨均勻，形成勻浆液，后在1. 5mL离心管a内加入ImL的勻浆液，将含有勻浆液的1. 5mL 离心管a在65°C条件下，放置10分钟，取出，然后在1.5mL离心管a内加入120 μ L浓度为 7. 5mol/L的乙酸铵溶液，混合均勻，后将1. 5mL离心管a置于0°C的冰水混合物中，放置8 分钟，取出，将1. 5mL离心管a送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上清液，备用；
2)在1.5mL离心管b中加入500 μ L的上清液、50 μ L浓度为3mol/L的NaAc和300 μ L 的异丙醇，混合均勻，形成混合液I，将含有混合液I的1. 5mL离心管b置于0°C的冰水混合物中，放置8分钟，取出，后将1. 5mL离心管b送入离心机内，以转速为13000转/分钟， 离心10分钟，弃去上清液，得到沉淀物，后在含有沉淀物的1. 5mL离心管b内加入200 μ L 的TE溶液，使沉淀物溶解，然后加入200 μ L的氯仿和异戊醇混合液，混合均勻，形成混合液 II，备用；
3)在1.5mL离心管c中加入200 μ L的混合液II、20 μ L的浓度为3mol/L的NaAc和 700 μ L的无水乙醇，混合均勻，后将1. 5mL离心管c送入离心机内，以转速为13000转/分钟，离心8分钟，弃去上清液，得到下层沉淀，后用浓度为70%的乙醇对1. 5mL离心管c中的沉淀洗涤2次，待乙醇挥发完毕后，后加入1. 5mL离心管c中加入20 μ L的TE溶液，得到玉米青枯病原腐霉菌DNA，备用；
步骤七、玉米青枯病原腐霉菌DNA的转接及纯化
1)ITS引物序列
ITSl 5 ‘ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ‘
ITS4 5 ‘ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ‘
2)在0.5mL离心管a中加入2. 0 μ L的10倍缓冲液、0. 5 μ L的dNTP、0. 5 μ L的ITS4 引物、0. 5 μ L的ITSl引物、0. 5 μ L的Taq聚合酶和20. 0 μ L的去离子水，混合均勻，得到混合液III，备用；
3)将含有混合液III的0.5ml离心管I放入基因扩增仪中，进行PCR扩增，PCR扩增程序为94°C预变性2分钟，94 °C变性40秒，59 °C退火40秒，72°C延伸100秒，变性、退火和延伸为一次循环，共35次循环，后72°C再次延伸10分钟，取出，得到扩增产物，备用；
步骤八、扩增产物的分离、鉴定
1)称取0.25克琼脂糖粉末加到含有25毫升琼脂糖凝胶电泳缓冲液的三角瓶中，将三角瓶内琼脂糖凝胶电泳缓冲液加热至沸腾并使琼脂糖粉末充分溶解，加入2微升的溴化乙锭溶液，至混合均勻止，后倒入琼脂糖制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔，将凝胶放入含有琼脂糖凝胶电泳缓冲液的电泳凝胶盒中，在凝胶的点样孔中分别加入5微升的扩增产物和2微升DNA分子量标准Marker，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为100伏特时开始电泳，电泳30分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中观察到889bp的条带时，备用；
2)用DNA凝胶回收试剂盒对扩增产物进行回收、纯化
取1. 5ml离心管d并称其重量，在紫外灯下将扩增产物从步骤1)中的凝胶上切下，将切下的扩增产物放在已称重的1. 5ml离心管d中，称取1. 5ml离心管d的总重并计算出从凝胶上切下来的扩增产物的重量，然后将1. 5ml离心管d中的扩增产物捣碎，按扩增产物的克数加入相同毫升数的DNA纯化结合液，混合均勻，将1. 5ml离心管放置在50° C水浴中加热至扩增产物完全融解，得到混合液IV，将混合液IV加到DNA纯化柱上，DNA纯化柱位于收集管中，收集管在21°C条件下放置1分钟，将收集管放入离心机中，转速为12000转/分钟， 离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，向DNA纯化柱上加入 700微升的洗涤液，将DNA纯化柱置于收集管内，后将收集管在21°C条件下放置1分钟，后将收集管放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，向DNA纯化柱上加入500微升的洗涤液，将DNA纯化柱置于收集管内，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱，倒掉收集管内的液体，将DNA纯化柱置于收集管内，然后将收集管放入离心机内，转速 13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱放置于1. 5ml离心管e中，后在DNA纯化柱上加入40微升洗脱液，将1. 5ml离心管e在21°C条件下放置1分钟，然后将收集管放入离心机内转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱得到1. 5ml离心管中e中的液体，
3)将步骤2)中回收、纯化后的液体进行测序，后将测出的DNA序列在基因库Genbank 进行BLAST比对，结果表明，本发明测出的液体序列与DNA序列数据库中登录编号为 AY598627. 1和AY5986^. 1的序列具有同源性，且同源性为98%，在BLAST系统发育树上观察到玉米青枯病原腐霉菌，登录编号(AY598627. 1)为芒孢腐霉菌，登录编号(AY5986^. 1) 为强雄腐霉菌，根据rDNA的ITS区序列的一般分析准则，本发明中分离检测的霉菌为玉米青枯病原腐霉菌；
所述的DNA纯化结合液的组成成份每升DNA纯化结合液中含有25mmol的葡萄糖、 IOmmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、5mmol的乙二胺四乙酸，余量为水；
所述的洗涤液的组成成份按重量百分比洗涤液中含有8%的十二烷基硫酸钠，余量为
水；
所述的洗脱液的组成成份每升洗脱液中含50mmol的三羟甲基氨基甲烷、IOmmol的乙二胺四乙酸，余量为水；
所述的SDS裂解液的组成成份每升SDS裂解液中含有50mM的三羟甲基氨基甲烷和 IOg的十二烷基硫酸钠，余量为水；
所述的氯仿和异戊醇混合液的组成成分按体积比氯仿和异戊醇混合液中含有对份的氯仿和1份的戊醇；
所述的TE溶液的组成成份每升TE溶液中含有IOmmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、 Immol的乙二胺四乙酸，余量为水。
权利要求
1. 一种分离玉米青枯病原腐霉菌的方法，其特征在于分离玉米青枯病原腐霉菌所用的分离培养基的原料由琼脂、葡萄糖、马铃薯、酵母浸膏和复合抗生素母液组成，各原料的加入量是15— 30g的琼脂、15—30g的葡萄糖、150— 300g的马铃薯、0. 8—1. 5g的酵母浸膏和0. 4—0. 7mL的复合抗生素母液；利用分离培养基分离玉米青枯病原腐霉菌的方法，包括以下步骤为步骤一、抗生素培养基的配制1)在浓度为80万U/瓶的青霉素钠中加入无菌去离子水，混合均勻，制得浓度为20万 U/mL的母液a，备用；2)在浓度为100万U/瓶的硫酸链霉素中加入无菌去离子水，混合均勻，制得浓度为20 万U/mL的母液b，备用；3)按重量份数比取1份的浓度为20万U/mL的母液a和1份的浓度为20万U/mL的母液b，混合均勻，制得浓度为10万U/mL的复合抗生素母液，备用；步骤4)在4000mL的水中加入400_600g的马铃薯，煮30—40分钟，过滤，得到马铃薯滤液，备用；步骤5)在1500mL的马铃薯滤液中加入15 — 30g的琼脂、15 — 30g的葡萄糖和0. 8— 1. 5g的酵母浸膏，加热至80—90°C，使琼脂溶解，形成含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基煮至IOOOmL时，后将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基分装于10个三角瓶中，每瓶IOOmL,后将每个三角瓶放入高压灭菌锅内，在压强为1.05kg/cm2，温度为121°C，灭菌40分钟，取出，后在21°C条件下冷却至 60°C止，在每个含有酵母浸膏马铃薯葡萄糖琼脂培养基的三角瓶内加入0. 4-0. 7mL步骤 3)中得到的复合抗生素母液，混合均勻，使每个三角瓶内的抗生素浓度为20U/mL，制得抗生素培养基，后将抗生素培养基倒入无菌培养皿内，每个培养皿内抗生素培养基的含量为 30mL，放置40分钟，得到加富马铃薯葡萄糖琼脂抗生素分离平板，备用；步骤6)取步骤4)中得到的IOOOmL马铃薯滤液，在滤液中加入15 — 30g的琼脂、15— 30g的葡萄糖，0. 8—1.5g的酵母浸膏，加热至80— 90°C，使琼脂溶解，后将溶液定容至 lOOOmL，形成含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，后将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基分装于10个三角瓶中，每瓶IOOmL,然后将每个三角瓶放入高压灭菌锅内，在压强为1.05kg/cm2，温度为121°C，灭菌40分钟，取出，后在21°C条件下冷却至60°C止，将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基倒入无菌培养皿内，每个培养皿内含有30mL的培养基，得到加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板，备用；步骤二、病原菌的萌发1)将含有病原菌的玉米杆，剥离叶片，用保鲜膜将玉米杆包装好并放于10°C条件下，放置3天；2)用75%的酒精将含有病原菌的玉米杆外侧消毒，剪成IOcm的小段，剖开玉米茎杆，将病变组织暴露，取三个直径为Icm的病变组织块，将病变组织块接种到加富马铃薯葡萄糖琼脂抗生素分离平板中，在条件下，培养3-5天，得到萌发后的病原菌，备用；步骤三、在步骤一中得到的加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板内，接种步骤二中得到的萌发后的病原菌，在条件下，培养3-5天，得到纯化后的菌株，备用；步骤四、依据步骤三的方法，在加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板内接种步骤三得到的纯化后的菌株，在条件下，培养3-5天，进一步纯化得到玉米青枯病原腐霉菌株，备用；步骤五、将步骤四中的得到全部玉米青枯病原腐霉菌接种到加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，在条件下，培养6天，得到玉米青枯病原腐霉菌丝，即分离得到玉米青枯病原腐霉菌。
全文摘要
一种分离玉米青枯病原腐霉菌的方法，利用分离培养基分离玉米青枯病腐霉菌，包括引物设计及合成、玉米青枯病腐霉菌DNA的提取、目的基因的扩增及分离和扩增终产物的分离、进行测序鉴定，并在基因库Genbank进行比对，确定为玉米青枯病腐霉菌，本发明利用分离培养基分离玉米青枯病腐霉菌的方法，其鉴定方法操作简单，鉴定结果迅速准确，可以应用到实际生产中。
文档编号C12N1/02GK102533568SQ201210009628
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者侯军, 孙亚莉, 林晓民, 胡梅, 陈跟强 申请人:河南科技大学