专利名称：鉴定优质抗虫杂交棉中棉所70品种真实性和／或品种纯度的ssr分子标记方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴定优质抗虫杂交棉“中棉所70”种子真实性和/或品种纯度的SSR标记方法，利用这些特异引物对优质棉花杂交种F1品种“中棉所70”的种子进行真伪鉴别和/或品种纯度的鉴定，属于生物技术应用领域。
背景技术：
棉花是我国重要的经济作物，在我国国民经济与社会发展中具有重要地位。近年来，抗虫杂交棉的成功育成与推广，推动了我国杂交棉生产的快速发展，并成为世界上杂交棉大面积种植的两个国家之一(邱新平.棉花杂种优势的研究与利用进展[J].中国棉花， 2000，27 (10):4-7 )。2006年，我国杂交棉种植面积占全国棉田总面积的33. 2%，长江流域棉区基本实现杂交种化,黄淮海棉区和西北内陆棉区的种植面积逐年扩大。杂交棉生产实践证明，高质量的种子是杂交棉优势得以发挥的基础。种子纯度是衡量杂交棉种子质量的主要指标，低纯度种子将导致棉花产量和品质的显著下降。由于在棉花杂交制种过程中，人工去雄不彻底或漏去雄，常会出现假杂交种，导致种子遗传纯度下降，给生产造成巨大的经济损失，同时，一些不法分子或种子经营单位为追求高额利润，以劣充好，假冒伪劣种子进入市场并用于生产，造成棉花减产和品质降低，进而影响优良品种的市场销售信誉及其产业化发展。因此，优良F1代杂交种种子真实性和/或品种纯度的快速、准确(简便、经济)鉴定成为棉花生产中最为迫切解决的问题之一。目前我国棉种的真实性和/或品种纯度鉴定仍主要依靠田间小区种植形态鉴定方法，但形态鉴定受环境影响较大，鉴定工作量大，成本高，耗时长，并受季节限制(匡猛等，分子标记技术在棉花品种鉴定上的研究进展.棉花学报，2009，21 (4): 330-334)。随着棉花品种数量的日益增加和遗传基础的日益狭窄，使得完全根据形态性状进行棉花品种的辨别越来越困难。近年来，分子生物学的发展使品种鉴定进入到基因水平，以DNA为基础的 SSR( Simple Sequence Repeat,简单序列重复)分子标记技术,属于共显性标记，在基因组中分布平均，具有检测位点数量多、多态性高、遗传稳定、不受环境条件影响等优点，已在棉花遗传连锁图谱的构建、遗传多样性研究、标记和定位基因以及分子标记辅助选择、品种亲缘关系及分类等方面得到应用，并发挥着越来越重要的作用；在棉花的品种鉴定、种子纯度检测方面也进行了一定的研究(匡猛，杨伟华，许红霞，王延琴，周大云，冯新爱， 王俊芳.分子标记技术在棉花品种鉴定上的研究进展.棉花学报2009，21 (4) :330-334 ； 武耀廷，张天真，郭旺珍，等.陆地棉品种SSR标记的多态性及用于杂交种纯度检测的研究[J].棉花学报，2001，13 (3) :131-133;殷剑美，陈旭升，狄佳春，等.杂交棉苏杂 118的SSR指纹图谱构建[J].江苏农业科学，2007(4) :29-31 ;刘勤红，王芙蓉，张军， 等.利用SSR标记鉴定鲁棉研15号杂交种纯度的研究[J].山东农业科学，2003 (2) :7-16 ; 朱美霞，李英芝，王建书，等.利用SSR方法鉴定棉花品种纯度[J].安徽农业科学，2005，33(11) :2010-2016;秦利，李冰，范玲，等.新疆陆地棉SSR标记指纹图谱构建和杂种纯度鉴定研究杂种纯度鉴定研究[J].新疆农业科学，2005，42 (6):399-401)， 研究结果表明，利用分子标记进行棉花品种纯度鉴定是可行的。“中棉所70”是以双价转基因(Bt + CpTI)抗虫棉新品系sGK中156为母本，陆地棉常规优质系901-001为父本配制成的F1代杂交种(袁有禄，石玉真，李俊文， 刘爱英，翟学军，李悦有，桑文东.转基因抗虫优质杂交棉-中棉所70 (见中国棉花， 2009,36(2) : 17)。2007年获农业部转基因生物安全证书，2008年经第二届国家农作物品种审定委员会第二次会议审定通过，是国内首批通过国家审定的优质抗虫杂交棉。试验示范结果表明，该品种具有优质、高产、稳产、抗虫性强、适应性广、耐枯黄萎病等特点，特别是在黄河流域及长江流域纤维品质均表现突出，HVICC纤维上半部平均长度32. 5mm,断裂比强度33. 5cN/teX，马克隆值4. 3，适纺60支以上的高支纱，是生产优质棉及种植业结构调整的理想品种。为保证该优良品种生产最大的经济效益、产业化的快速发展，需要一种权威、准确、快速稳定的检测方法对其商品种子的真伪及遗传纯度进行鉴定。
发明内容
本发明的目的是提出一种鉴定棉花杂交种中棉所70种子真实性和/或品种纯度的SSR标记方法，以克服现有品种纯度检测工作存在的不足，本发明方法重复性好、多态性高、遗传稳定、不受环境条件影响，而且检测结果稳定可靠、快速准确、操作简单方便、成本低廉，有利于大规模的快速检测。本发明提供的技术方案是一种鉴定优质抗虫杂交棉“中棉所70”种子真实性和/或品种纯度的SSR标记方法，该方法包括以下步骤
(1)提取棉花杂交种“中棉所70”及其亲本种子或幼苗叶片基因组DNA;
(2)以第(I)步提取的基因组DNA为模板，用SSR引物CGR5390、BNL1552、CGR5111和 CIR246中的一个或多个引物，进行PCR扩增，其中，4个SSR特征引物碱基序列为
CGR5390引物其正向序列如SEQ ID No. I所示，反向序列如SEQ ID No. 2所示；BNL1552 引物其正向序列如SEQ ID No.所示，反向序列如SEQ ID No.4所示，CGR5111引物其正向序列如SEQ ID No. 5所示，反向序列如SEQ ID No. 6所示;CIR246引物序列如SEQ ID No. 7 所示，反向序列如SEQ ID No. 8所示
(3)对扩增产物进行凝胶电泳；
(4)对电泳结果进行分析，如果同时具有父母双亲本特异条带的种子或单株鉴定为真正的杂交种，缺少其中的任意一个条带均被视为假杂种，其中，4个SSR引物产生的特异标记带大小为
SSR引物CGR5390产生的母本特异标记CGR53902(I5，条带大小为205bp，产生的父本特异标记CGR539019Q，条带大小为190bp ；
SSR引物BNL1552产生的母本特异标记BNL1552175，条带大小为175bp，产生的父本特异标记BNL155218Q，条带大小为180bp ；
SSR引物CGR5111产生的母本特异标记CGR5111135，条带大小为135bp，产生的父本特异标记CGR5111128，条带大小为128bp ；
SSR引物CIR246产生的母本特异标记CIR246·，条带大小为200bp，产生的父本特异标记CIR24619(I，条带大小为190bp。
所述鉴定优质抗虫杂交棉“中棉所70”种子真实性和/或品种纯度的SSR标记方法，其中，第(4)步还计算种子遗传纯度，具体计算方法如下种子遗传纯度=检测到的与标准中棉所70匕带型相同的个体数/检测总数X 100%。所述鉴定优质抗虫杂交棉“中棉所70”种子真实性和/或品种纯度的SSR标记方法，其中，第(2)步中，以第(I)步提取的基因组DNA为模板，用SSR引物CGR5390、 BNL1552、CGR5111和CIR246中的一个引物，进行PCR扩增，即可进行鉴定。所述鉴定优质抗虫杂交棉“中棉所70”种子真实性和/或品种纯度的SSR标记方法，其中，第(2)步中，PCR扩增反应体系为反应体系为10 μ 1，其中超纯水6.40 μ 1， IOXBuffer I. O μ I, IOmM dNTPs O. 50 μ 1，10 μ M 正向引物 O. 50 μ 1，10 μ M 反向引物
O.50 μ 1，30ng/ μ I 模板 DNAL O μ I，5U/ μ ITaq DNA 聚合酶 O. 10 μ I ;反应程序为94°C预变性45s，I个循环；94°C变性30s，57°C退火45s，72。。延伸Imin, 29个循环；94°C变性60s， 57°C退火45s，72°C延伸2min，一个循环；4°C保存待用。本发明具有如下有益效果本发明通过对杂交种“中棉所70”及其亲本基因组DNA 特征SSR引物进行筛选研究，发明出一种适用于鉴定棉花杂交种中棉所70种子真实性和/ 或品种纯度的SSR标记方法，它具有重复性好、多态性高、遗传稳定、不受环境条件影响等优点，而且检测结果稳定可靠、快速准确、操作简单方便、成本低廉，有利于大规模的快速检测。本发明通过对杂交种“中棉所70”及其亲本基因组DNA特征SSR引物进行筛选研究，从所用的大量引物中筛选出能够在杂种一代中同时产生具有父、母本特异标记条带，而且带型清晰、重复性好、可靠性强的引物，作为优质抗虫杂交棉“中棉所70”种子真实性和/或品种纯度鉴定的特征引物。本发明4个特征引物SSR引物对均能鉴定出具有父母本特异互补条带。CGR5390引物产生母本特异标记CGR53902(I5，父本特异标记CGR5390·； BNL1552引物产生母本特异标记BNL15 5 2 325，父本特异标记BNL1552345 ；CGR5111引物产生母本特异标记CGR5111135，父本特异标记CGR5111128 ；CIR246引物产生母本特异标记 CIR2462QQ，父本特异标记CIR24619Q(见图I)。这4个SSR标记引物在多次重复中表现稳定， 可有效用于鉴别棉花杂交种种子的真伪和纯度，并且可以相互验证，有利于棉花商品种子高效准确的质量控制，加快了棉花商品种子的质量检测流程。本发明提供了一种鉴定杂交棉“中棉所70”种子真实性和/或品种纯度的方法，该方法的应用，具有快速准确、经济简便、稳定可靠、不受环境条件及发育时期的影响，且操作简单、统计方便等优点，可以快速、 准确地检测棉花杂交种种子的遗传纯度。
图I为本发明杂交种“中棉所70”种子检测特征引物的SSR-PCR电泳图谱。其中，P1: “中棉所70”母本(sGK中156) ；F1: “中棉所70” F1杂交种；P2: “中棉所70”父本(优质系901-001) ;M:501bp分子量标准,箭头指向亲本间的特异带。图2所示为特征引物对CGR5390对中棉所70商品种子样品的纯度检测结果。其中，M为分子量标准，P1: “中棉所70”母本；F1: “中棉所70” F1杂交种；P2: “中棉所70”父本，1-20号为中棉所70商品样品种子，箭头指向亲本间的特异带。
具体实施例方式下面通过基于PCR技术的SSR标记分析实施例进一步说明本发明。实施例I
方法提取种子DNA，采用SSR分子标记进行PCR扩增，将扩增产物进行凝胶电泳，统计结果并筛选特征性引物。I. 提取棉花基因组DNA。本实施例的实验材料为优质抗虫杂交棉“中棉所70”商品种子(湖南隆平高科亚华棉油种业有限公司提供)。(I))将单粒棉花种子去掉外边的硬壳，充分粉碎后转入2 mL的离心管中，加入 800 μ L SDS 提取液(组成成分1% SDS, O. OImoI/L EDTA, O. 7 mol/L NaCl, O. 05 mol/ L Tris, O. 5%山梨醇，1%PVP，1%β —巯基乙醇)，充分混匀后。(2)65°C水浴30min，间隔10 min左右轻摇一次。(3))加入等体积SOOyL酚氯仿异戊醇(25:24:1)，上下颠倒混匀至不分层， 10000 r/min离心10 min，取上清液转移到另一 2mL的离心管种。(4)重复上述步骤(3) —次。(5)加入0.7倍体积异丙醇，缓慢颠倒几次，室温静置30 min，絮状DNA成团析出，用剪口 tip头吸取DNA转移到另外离心管里。(6)用70%乙醇洗涤2次，无水乙醇洗涤I次，倒掉乙醇，自然通风干燥DNA。(7)加入200 μ L TE (ΡΗ8. O)或ddH20充分溶解DNA，琼脂糖凝胶检测质量后，保存于4°C或-20°C备用。2.分子标记分析
PCR 反应体系为 10μ 1，其中超纯水 6. 40μ l，10XBuffer I. 0μ I (含 Mg2+/20mM)， IOmM dNTPs O. 50 μ 1，10 μ M 正向引物 O. 50 μ 1，10 μ M 反向引物 O. 50 μ 1，30ng/μ I 模板 DNAI. O μ I，5U/ μ ITaq DNA 聚合酶 O. 10 μ I。PCR 反应程序为94°C预变性 45s ;94°C变性 30s, 57°C退火 45s, 72°C延伸 lmin, 29 个循环；94°C变性 60s, 57°C退火 45s, 72°C延伸 2min, PCR反应在TGRADIENT、TC-512及PTC-200上进行。电泳仪器采用DYY-6C型稳压稳流电泳仪和DYC2-30型电泳槽，由北京六一仪器公司生产。扩增产物在8%的非变性聚丙烯凝胶中进行电泳，180V恒压电泳40-50分钟。电泳结束后，进行固定-银染-显色-终止，在可见灯箱下观察拍照，记录结果。3.筛选纯度鉴定的特征引物
利用2015对SSR引物(来自布鲁克海文国家实验室(美国)开发的BNL引物379对，来自国际农业研究发展中心(法国)开发的CIR引物392对，孟山都公司开发的CGR引物1244 对)对中棉所70及其父、母本的DNA进行多态性筛选，进行PCR扩增，筛选出能够在一代杂种中同时产生父、母本特异标记条带，且带型清晰、重复性好、可靠性强的共显性SSR引物 4个CGR5390引物产生母本特异标记CGR53902(I5，父本特异标记CGR539019(I ；BNL1552引物产生母本特异标记BNL15 5 2 325，父本特异标记BNL1552345 ；CGR5111引物产生母本特异标记 CGR5111135，父本特异标记CGR5111128 ；CIR246弓I物产生母本特异标记CIR246·，父本特异标记CIR246·(见图1)，作为优质抗虫杂交棉中棉所70种子真实性和/或品种纯度鉴定的特征引物。
这4个SSR引物碱基序列为
CGR5390F: GCGAGATCTTAGCCGGTTT,
CGR5390R: ATCCATTGCATTGAGCTTCC ；
BNL1552F: GTGCCCAGCAATATCGTTTT,
BNL1552R: CTCTCGCCTTGGATTGAAAG ；
CGR5111F: GGAATTCGTGAACTCCTCTGA,
CGR5IIIR: GTGAGGGTGTCCTTTGGAGA;
CIR246F: TTAGGGTTTAGTTGAATGG,
CIR246R: ATGAACACACGCACG;
SSR引物CGR5390产生的母本特异标记CGR53902(I5，条带大小为205bp，产生的父本特异标记CGR539019Q，条带大小为190bp ；
SSR引物BNL1552产生的母本特异标记BNL1552325，条带大小为325bp，产生的父本特异标记BNL1552345，条带大小为345bp ；
SSR引物CGR5111产生的母本特异标记CGR5111135，条带大小为135bp，产生的父本特异标记CGR5111128，条带大小为128bp ；
SSR引物CIR246产生的母本特异标记CIR246·，条带大小为200bp，产生的父本特异标记CIR24619(I，条带大小为190bp。实施例2
用实施例I筛选出来的4个特征引物进行种子遗传纯度鉴定。本实施例的实验材料为优质抗虫杂交棉“中棉所70”商品种子(湖南隆平高科亚华棉油种业有限公司提供)。一般提取100粒种子进行检测，计算遗传纯度。I.提取棉花基因组DNA，提取方法同实施例I。2.用CGR5390、BNL1552、CGR5111和CIR24引物，以上述第I步提取的基因组DNA 为模板，进行PCR扩增。PCR扩增反应体系为10 μ 1，其中超纯水6. 40 μ 1，IOXBuffer I. O μ I (含 Mg2+/20mM), IOmM dNTPs O. 50 μ 1，10μΜ 正向引物 O. 50 μ 1，10μΜ 反向引物 O. 50 μ l，30ng/ μ I 模板 DNAL O μ I，5U/ μ ITaq DNA 聚合酶 O. 10 μ I。PCR 反应程序为94°C预变性 45s ； 94°C变性 30s, 57°C退火 45s，72°C延伸 lmin, 29 个循环；94°C变性 60s, 57°C退火 45s，72°C 延伸 2min，PCR 反应在 TGRADIENT、TC-512 及 PTC-200 等 PCR 仪上进行。3.对扩增产物进行凝胶电泳。电泳仪器米用DYY-6C型稳压稳流电泳仪和DYC2-30型电泳槽，由北京六一仪器公司生产。扩增产物在8%的非变性聚丙烯凝胶中进行电泳，180V恒压电泳40-50分钟。电泳结束后，进行固定-银染-显色-终止，在可见灯箱下观察拍照，记录结果。4.对电泳结果进行分析，只有同时具有父母双亲本特异条带的种子或单株才为真正的杂交种，缺少其中的任意一个条带均被视为假杂种，计算其种子遗传纯度。4个引物均能鉴定出具有父母本特异互补条带，CGR5390引物产生母本特异标记CGR53902Q5及父本特异标记CGR539019Q ；BNL1552引物产生母本特异标记BNL15 5 2 325及父本特异标记BNL1552345 ；CGR5111引物产生母本特异标记CGR5111135及父本特异标记 CGR5111128 ；CIR246引物产生母本特异标记CIR246200及父本特异标记CIR246190 (见图I)。
使用选自CGR5390、BNL1552、CGR5111和CIR246中的一个或多个特征引物对杂交种种子的标记基因型进行分析，统计代表各种基因型的数，即可计算出待测商品中棉所70 种子纯度百分率及杂株率(种子遗传纯度=检测到的与标准中棉所70匕带型相同的个体数 /检测总数X 100%，杂株率=I-种子遗传纯度)。多个特征引物同时使用，取平均值即为待测商品种纯度。4个标记在多次重复中表现稳定，4个标记分析结果可以相互验证。对电泳结果进行分析，参照中棉所70父本、母本及F1标准电泳图谱(见图1)，确定代表父本带型、母本带型、其他杂株带型及F1带型的各种基因型，
图2所示为特征引物对CGR5390对中棉所70种子商品样品种子的纯度检测的结果。 图中M为分子量标准，P1: “中棉所70”母本；F1: “中棉所70” F1杂交种；P2: “中棉所70” 父本，1-20号为中棉所70商品种子。对照图中所示的“中棉所70”母本、父本及其F1的标准电泳谱带可知1-20号中棉所70商品种子中，19号为母本带型，1-18号和20号是真实杂交种带型，因此，这份中棉所70商品种子样品的遗传纯度为95% (遗传纯度= 19/20X100%=95%)。
权利要求
1.一种鉴定优质抗虫杂交棉“中棉所70”种子真实性和/或品种纯度的SSR标记方法，其特征在于包括以下步骤(1)提取棉花杂交种“中棉所70”及其亲本种子或幼苗叶片基因组DNA;(2)以第(I)步提取的基因组DNA为模板，用SSR引物CGR5390、BNL1552、CGR5111和 CIR246中的一个或多个引物，进行PCR扩增，其中，4个SSR特征引物碱基序列为CGR5390引物其正向序列如SEQ ID No. I所示，反向序列如SEQ ID No. 2所示；BNL1552 引物其正向序列如SEQ ID No.所示，反向序列如SEQ ID No.4所示，CGR5111引物其正向序列如SEQ ID No. 5所示，反向序列如SEQ ID No. 6所示；CIR246引物序列如SEQ ID No. 7 所示，反向序列如SEQ ID No. 8所示；(3)对扩增产物进行凝胶电泳；(4)对电泳结果进行分析，如果同时具有父母双亲本特异条带的种子或单株鉴定为真正的杂交种，缺少其中的任意一个条带均被视为假杂种，其中，4个SSR引物产生的特异标记带大小为SSR引物CGR5390产生的母本特异标记CGR53902(I5，条带大小为205bp，产生的父本特异标记CGR539019Q，条带大小为190bp ；SSR引物BNL1552产生的母本特异标记BNL1552175，条带大小为175bp，产生的父本特异标记BNL155218Q，条带大小为180bp ；SSR引物CGR5111产生的母本特异标记CGR5111135，条带大小为135bp，产生的父本特异标记CGR5111128，条带大小为128bp ；SSR引物CIR246产生的母本特异标记CIR246·，条带大小为200bp，产生的父本特异标记CIR24619(I，条带大小为190bp。
2.根据权利要求I所述鉴定优质抗虫杂交棉“中棉所70”种子真实性和/或品种纯度的SSR标记方法，其特征在于，第(4)步还计算种子遗传纯度，具体计算方法如下种子遗传纯度=检测到的与标准中棉所70匕带型相同的个体数/检测总数X 100%。
3.据权利要求I所述鉴定优质抗虫杂交棉“中棉所70”种子真实性和/或品种纯度的SSR标记方法，其特征在于第(2)步中，以第(I)步提取的基因组DNA为模板，用SSR引物 CGR5390、BNL1552、CGR5111 和 CIR246 中的一个引物，进行 PCR 扩增。
4.根据权利要求I所述鉴定优质抗虫杂交棉“中棉所70”种子真实性和/或品种纯度的SSR标记方法，其特征在于第(2)步中，PCR扩增反应体系为反应体系为10μ 1，其中超纯水 6. 40 μ 1，IOXBuffer I. O μ I, IOmM dNTPs O. 50 μ 1，10 μ M 正向引物 O. 50 μ 1， ΙΟμΜ 反向引物 O. 50μ l,30ng/y I 模板 DNAl.Oy I ,5U/y ITaq DNA 聚合酶 0· 10 μ I ;反应程序为941预变性458，1个循环;94°C变性30s，57°C退火45s，72°C延伸lmin，29个循环； 94°C变性60s，57°C退火45s，72°C延伸2min，一个循环；4°C保存待用。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定优质抗虫杂交棉“中棉所70”种子真实性和／或品种纯度的SSR标记方法，其包括以下步骤(1)提取棉花杂交种“中棉所70”及其亲本种子或幼苗叶片基因组DNA；(2)以第(1)步提取的基因组DNA为模板，用SSR引物进行PCR扩增；(3)对扩增产物进行凝胶电泳；(4)对电泳结果进行分析，如果同时具有父母双亲本特异条带的种子或单株鉴定为真正的杂交种，缺少其中的任意一个条带均被视为假杂种。本发明方法重复性好、多态性高、遗传稳定、不受环境条件影响，而且检测结果稳定可靠、快速准确、操作简单方便、成本低廉，有利于大规模的快速检测。
文档编号C12Q1/68GK102586426SQ20121000920
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月12日 优先权日2012年1月12日
发明者刘爱英, 商海红, 张金凤, 李俊文, 王涛, 石玉真, 葛瑞华, 袁友禄, 龚万奎, 龚举武 申请人:中国农业科学院棉花研究所