用于检测转mCry1Ac基因抗虫玉米品系的引物、方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物检测【技术领域】，提供了一种用于检测转mCry1Ac基因抗虫玉米品系的引物和探针，正向引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；反向引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；探针核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示，或其互补链，报告荧光基团连接在探针的5′末端，淬灭荧光基团连接在探针的3′末端。又提供了一种检测方法，以样品总DNA为模板，利用上述引物和探针对其进行实时荧光PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。上述引物和探针检测特异性好，用于检测实时荧光PCR，灵敏性高；本发明检测方法准确性高，反应灵敏，为转基因安全提供了保证。
【专利说明】用于检测转mCrylAc基因抗虫玉米品系的引物、方法及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测【技术领域】，具体涉及一种用于检测转mCrylAc基因抗虫玉米品系的引物、方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002]玉米(Zea mays L.)是重要的食物、饲料和工业原料，种植面积仅次于小麦和水稻，在世界粮食生产中占有重要的地位。而害虫是造成玉米产量损失的主要因子之一。世界范围内玉米害虫达350多种之多，其中以蛀茎性和食叶性的欧洲玉米螟和亚洲玉米螟最为严重。玉米螟俗名钻心虫，成虫属鳞翅目螟蛾科，为世界性的蛀食性大害虫，影响玉米产量和品质的重要因素，世界每年因虫害造成的损失约占农作物产量的15%以上。玉米螟可危害玉米植株地上的各个部位，使受害部分丧失功能，降低籽粒产量。目前的防治措施主要是大量使用化学杀虫剂，这不仅严重影响了生态环境和生物多样性，增加了生产成本和劳动强度，也加大了人体中毒几率。解决上述问题的有效途径之一是提高玉米本身的抗虫性。传统的育种方法由于受到多种因素的限制，很难培育出抗虫玉米。而在这种背景下产生的转基因抗虫玉米则可高效专一控制玉米螟，是防治玉米螟的新途径。常用的方法是从微生物中分离得到目的基因，通过基因枪等转化方法将目的基因转移到常规玉米自交系的基因组中，使之稳定遗传从而赋予玉米新的农艺性状一抗虫性。
[0003]Bt是苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)的简称,是一种革兰氏阳性土壤芽胞杆菌。该细菌产生的Bt杀虫蛋白能够破坏昆虫肠道内的细胞渗透压，导致昆虫死亡。Bt基因是第一代抗虫基因的典型代表，它所表达的蛋白统称为Cry晶体蛋白。根据杀虫谱及氨基酸同源性的不同，Cry基因分为不同的类型,其中CrylAb和CrylAc基因对玉米螟等鳞翅目害虫具有专一性毒性。无论是哪种来源的抗虫基因用于基因工程，首要考虑的问题就是提高其表达量。一般来说，表达量越`高，抗虫效果就越好。早期的转抗虫基因植物的杀虫蛋白在植株上的表达量很低(占全部可溶性蛋白的0.001%以下)，抗虫效果不理想。从已有的研究结果来看，通过对Cry基因的修饰与改造，转Bt基因的作物可以获得较好的抗虫效果。
[0004]随着转基因作物的商品化发展，转基因农作物的安全性问题，即它对环境保护、生态平衡存在潜在的危害，以及由它加工而成的转基因食品中含有新的遗传物质和蛋白质而引起的食用安全性受到越来越广泛地关注。目前世界上大多数国家如欧盟、俄罗斯、日本、韩国、澳大利亚、新西兰等国主张对转基因产品加贴限量标签，即规定转基因产品的颗粒比超过一定阈值(如1%，即100粒中有I粒为转基因玉米)则需有强制性标识。我国于2001年5月23日颁布了农业转基因生物安全管理条例，强调了对转基因生物及其产品的管理与控制。不论是对转基因食品进行标注管理，或是对转基因与非转基因原料的分别输送，转基因原料和食品的分析检测技术是必不可少的更具有现实意义和应用前景，这是对转基因产品进行安全性评价和实施监管的基础。[0005]赖锦盛等对CrylAc基因进行了优化改造,通过基因枪共转化的方法把mCryIAc基因转入到具有高转化效率的玉米自交系HiIIA和HiIIB的杂交组合中，用筛选标记基因bar进行筛选。通过实验研究、中间试验及环境释放对获得的转化事件进行分子水平、蛋白水平及田间抗虫性鉴定，将抗性优良的转化事件与郑58进行多代回交及自交，最终筛选出I个优良转基因品系BT-799。实验结果显示在分子水平转基因株系的后代能够稳定遗传抗虫基因mCrylAc，每个世代均表达目标蛋白且世代间表达量基本一致，从田间抗虫性来看每代均有明显的抗虫性，抗虫等级基本一致。
【发明内容】
[0006]针对现有技术不足，本发明的目的在于提供一种用于检测转mCrylAc基因抗虫玉米品系的引物和探针，
[0007]其正向引物核苷酸序列为:Bt-799-F:5' -GGAACAAACGATGA TTCA-3 ' (SEQ IDN0.1)；
[0008]其反向引物核苷酸序列为:Bt-799-R:5' -CTTCCCTTTTAGTTG TGTC-3' (SEQ IDN0.2)；
[0009]其探针核苷酸序列为:Bt-799-P:5' -AGCCTCTCATTTTCTTCTT TGAGCT-3' (SEQ IDN0.3)或其互补链，报告荧光基团连接在探针的5,末端，淬灭荧光基团连接在探针的3,末端。
[0010]PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5' — 3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。通过这种方法，能够检测到样品中是否有转mCrylAc基因抗虫玉米品系Bt_799。
[0011]优选的，所述报告荧光基`团为Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、Fite、Cy3或Cy5 ;所述淬灭突光基团为 Tamra、Rox> Dabcy、Bhql 或 Bhq2。
[0012]本发明的又一目的在于提供一种含有上述引物和探针的试剂盒。
[0013]本发明的又一目的在于提供一种用于检测转mCrylAc基因抗虫玉米品系的方法，以样品总DNA为模板，利用上述引物和探针，或者上述试剂盒对其进行实时荧光PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。
[0014]测试样品外源基因检测Ct值在36~40之间，应调整模板浓度，重做实时荧光PCR0再次扩增后的外源基因检测Ct值仍小于40，则可判定为该样品含有所检的外源基因。再次扩增后的外源基因检测Ct值大于或等于40，则可判定为该样品不含所检的外源基因。
[0015]优选的，本发明以样品总DNA为模板进行实时荧光PCR扩增的优化体系为25 μ 1，反应条件为Mixl2.5μ 1，引物终浓度0.2ymol/L，探针终浓度为0.lymol/L。所用Taq DNA聚合酶及其缓冲液为 AB TaqMan Gene Expression Master Mix。
[0016]优选的，PCR反应参数为 95°C 30sec ；95°C 5sec、60°C 30sec，共 4 个循环。
[0017]优选的，实时荧光PCR的反应过程中的退火温度为55°C。
[0018]本发明的有益效果:本发明所述引物、探针是根据转基因玉米品系侧翼序列设计的，检测特异性好，用于检测实时荧光PCR，灵敏性高。本发明检测方法准确性高，反应灵敏，可以快速检测样品是否含有转mCrylAc基因抗虫玉米品系Bt_799，为转基因安全提供了保证。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图lBt-799实时荧光PCR检测结果。
【具体实施方式】
[0020]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0021 ] 实施例1样品总DNA的提取
[0022]1.取样品叶片约0.1g于研钵中，加入液氮迅速研磨至粉末状。
[0023]2.将叶片粉末迅速转入到事先加入700 μ I CTAB缓冲液的2ml离心管中，轻轻混匀后，65°C水浴保温30分钟。每隔十分钟小心摇晃混匀。
[0024]3.取出离心管，待冷至室温后(25°C)，加入等体积酚(350μ I)/氯仿(350μ I)700 μ L.上下颠倒充分混合，抽提5分钟。
[0025]4.室温下，12000rpm离心10分钟,用剪去头部的Iml枪头将上清转移到另一个新的离心管中。加 2μ1 RNaseA (10mg/ml)。
[0026]5.加入与上清等体积的的氯仿700μ 1，上下颠倒充分混合，抽提5分钟。
[0027]6.室温下，12000rpm离心10分钟，吸取上清到另一新的离心管中。
[0028]7.加入等体积的异丙醇(700 μ I),充分混匀，常温放置10分钟后可见沉淀。为沉淀完全，可在_20°C放置I~2小时。`
[0029]8.室温下，12000rpm离心10分钟，沉淀积于管底。弃尽上清液。
[0030]9.加入700 μ 170%乙醇清洗30分钟。
[0031]10.倒去离心管中的乙醇，使DNA沉淀在管中自然晾干。
[0032]11.加入适量TE (50 μ I)溶解，放入_20°C冰箱保存备用。
[0033]实施例2引物探针设计
[0034]在获得外源基因转mCrylAc基因抗虫玉米品系Bt_799全序列的基础上，设计一对转基因玉米Bt-799外源基因Bt-799检测PCR弓丨物和TaqMan探针。设计软件用Primer5.0。引物序列为:
[0035]Bt-799-F (正向):5' -GGAACAAACGATGATTCA-3'；
[0036]Bt-799-R (反向):5' -CTTCCCTTTTAGTTGTGTC-3'；
[0037]Bt-799-P (探针):5' -FAM-AGCCTCTCATTTTCTTCTTTGAGC T-Eclipse-3'。
[0038]所用探针5'端用报告荧光基团FAM标记，3'端用淬灭荧光基团Eclipse标记。
[0039]实施例3实时荧光PCR扩增方法的建立
[0040]1.实时荧光PCR反应体系
[0041]以样品总DNA为模板进行实时荧光PCR反应，优化后的实时荧光PCR反应体系为25 μ 1，反应条件为Mixl2.5μ 1，引物终浓度0.2ymol/L，探针终浓度为0.1 μ mol/L。
[0042]2.实时荧光PCR反应参数
[0043]实时荧光PCR反应参数为95°C 30sec ；95°C 5sec、60°C 30sec，共4个循环。反应结束后根据扩增曲线判定结果。[0044]实施例4转mCrylAc基因抗虫玉米品系Bt_799的特异性检测
[0045]以转mCrylAc基因抗虫玉米品系Bt_799 (GM0+)、非转基因玉米郑58 (GM0-)、转基因番茄(华番I号)、转基因水稻Bt63、转基因棉花(转Bt抗虫基因)及转基因玉米Mon810、Mon88017、nk603、油菜RT73、T45、、大豆GST40-3-2的总DNA为模板，进行实时荧光PCR反应，检测引物探针的特异性。
[0046]如图1所示，基线以下为阴性对照:Bt63、KF6号、华番I号、Mon810、Mon88017、nk603、油菜RT73、T45、大豆GST40-3-2，检测转mCrylAc基因抗虫玉米品系Bt-799的引物探针只在品系Bt-799有信号，在其它材料中均无信号。
[0047]虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。`
【权利要求】
1.一种用于检测转mCrylAc基因抗虫玉米品系的引物和探针，其特征在于， 其正向引物核苷酸序列为:Bt-799-F:5' -GGAACAAACGATGA TTCA-3' (SEQ ID N0.1)； 其反向引物核苷酸序列为:Bt-799-R:5 ' -CTTCCCTTTTAGTTG TGTC-3 ' (SEQ IDN0.2)； 其探针核苷酸序列为:Bt-799-P:5' -AGCCTCTCATTTTCTTCTT TGAGCT-3 ' (SEQ IDN0.3)或其互补链，报告荧光基团连接在探针的5,末端，淬灭荧光基团连接在探针的3,末端。
2.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，所述报告荧光基团为Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、Fite、Cy3 或 Cy5 ;所述淬灭突光基团为 Tamra> Rox> Dabcy、Bhql 或 Bhq2。
3.含有权利要求1或2所述的引物和探针的试剂盒。
4.一种用于检测转mCrylAc基因抗虫玉米品系的方法，其特征在于，以样品总DNA为模板，利用权利要求1或2所述的引物和探针，或者权利要求3所述的试剂盒对其进行实时荧光PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，根据扩增曲线判定结果，测试样品外源基因检测Ct值大于或等于40，内源基因检测Ct值小于或等于24，则可判定该样品不含所检的外源基因；测试样品外源基因检测Ct值小于或等于36，判定该样品含有所检的外源基因。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR反应参数为95°C30sec ；95°C 5sec、60°C 30sec，共4个 循环。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，实时荧光PCR的反应过程中的退火温度为55。。。
【文档编号】C12N15/11GK103882126SQ201410090599
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月12日 优先权日:2014年3月12日
【发明者】付伟, 杜智欣, 彭萱子, 赖锦盛, 朱水芳 申请人:中国检验检疫科学研究院