专利名称：一种识别天然结构梅花鹿朊蛋白的单克隆抗体及制备方法
技术领域：
本发明属于生物检验检疫快速领域，通过构建重组蛋白，利用重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体，并为建立一种梅花鹿朊蛋白双抗夹心ELISA检测方法提供必需的高效价、特异性高的单克隆抗体蛋白。
背景技术：
朊病毒(Prion)是一种由蛋白质组成而不含有核酸等遗传物质的病毒。朊病毒 (PrPsc)是生物体内普遍存在的正常细胞型朊蛋白(PrPe),当它由于某种原因结构发生变化，在细胞内发生错误折叠并可以抵抗新陈代谢，进而聚集扩增，最后引起细胞死亡，最终引起宿主发生神经退行性病变，导致不可逆转性死亡。朊病毒病作为一种新型疾病，由于它病原的特异性，传统的消毒措施不能破坏它的传染性，正常的食物加工过程中不能有效灭活朊病毒，因此该病对食品安全造成巨大威胁。当疯牛病在欧洲爆发时，英法等国屠宰牛群达到100万只以上，造成巨大的经济损失， 同时许多人因为使用了病牛肉制品可能在今后的几十年后感染朊病毒病。鹿慢性消耗性疾病(Chronic wasting disease, CWD)和疯牛病(BSE)，羊痒疫 (Scrapy)，人克雅氏病(CJD) —样都属于朊病毒病。鹿慢性消耗性疾病主要感染北美麋鹿、 黑尾鹿、白尾鹿等，广泛分布于北美，主要存在于加拿大和美国。近几年，亚洲国家韩国在引进来自加拿大的鹿体内发现朊病毒，后证实病鹿感染鹿慢性消耗性疾病。梅花鹿是我国重要经济动物，梅花鹿制品品种丰富，具有较高的药用价值和经济价值。由于IM3se可以吸引ftT，并将其转化成IM3se导致疾病的传播，而且朊蛋白在各个物种中均高度保守，梅花鹿朊蛋白和北美麋鹿、黑尾鹿、白尾鹿氨基酸同源性则高达93%。一旦该病在我国出现，必将对我国的财政收入、食品安全造成巨大的危害。当前对于朊病毒病的检测主要是利用抗蛋白酶消化的特点，对动物组织勻浆进行消化前后的对比，既可以判断该病原是否存在。
发明内容
本发明提供一种识别天然结构梅花鹿朊蛋白的单克隆抗体及制备方法。本发明采取的技术方案是
(一)、重组朊蛋白PrPlres的制备如下
(1)制备重组朊蛋白PrPlres基因的人工合成引物为
Fff: GGG AAT TCC ATA TGA AGA AGC GAC CAA AAC CTG ； RV: CGGATC CGA ACT TGC CCC TCG TTG GTA ；
(2)提取梅花鹿总基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得目的基因，克隆至 PMD-IST-Simple载体上，将I^rPlres基因片段插入表达载体pET_Trx中构建重组表达质粒，pET-Trx- PrPres ；将I^rPres基因片段插入表达载体ρΕΤ-His中构建重组表达质粒，pET-His- PrPres ；
(3)将重组表达质粒ρΕΤ- χ-PrPlres和pET-His- PrPres转入BL21 (DE3)中进行表达， 得到两种重组融合蛋白PrPres-Trx和PrPres-His,表达条件为阳性克隆培养物以1%接种于 LB培养基(50mg/L抗生素)，37°C剧烈摇荡培养至0D600=0. 6时加入终浓度为lmmol/L的 IPTG进行诱导，220r/min剧烈摇培4h，离心收集菌体，菌体重新PBS悬浮并经超声波裂解， 离心分别收集上清和沉淀，通过SDS-PAGE分别检测全菌、上清和沉淀，发现PrPres-Trx和 PrPres-His分别以包涵体的形式大量表达；
(4)切胶纯化方法，取500μ L包涵体提取液处理后不插样品梳直接上样，按常规方法进行SDS-PAGE，将胶浸入2 mol/L NaAc溶液中在摇床上染色1 h，将染成银白色的含目的蛋白胶切割下来，置于蒸馏水中在脱色摇床上摇20 min,脱去NaAc，之后将切下来的胶放在密封透析袋内，以电泳的方法使目的蛋白游离出来，将透析袋中的凝胶取出后， 用PEG20000进行浓缩，做透析去除小分子，经SDS-PAGE和flfestern blot鉴定后分装后放入-80度冰箱备用；
(二) 抗重组朊蛋白PrFes单克隆抗体的制备
(1)动物免疫
以复性的重组朊蛋白PrPres-Trx免疫8周龄Balb/c雌性小鼠，100 μ g/只，皮下分点注射，首次免疫用弗氏完全佐剂(1:1)乳化抗原，间隔3周后，采用弗氏不完全佐剂 (1:1)乳化抗原，进行第2、3次免疫，最后加强免疫时，直接用免疫原进行腹腔注射；
(2)间接ELISA筛选方法以及阳性杂交瘤判断标准的建立
分别以重组成熟朊蛋白PrPres-His和空载体菌体蛋白pET-His包被酶标板孔，以测定PrPres-Trx免疫血清效价，以未免疫的小鼠血清和SP2/0细胞上清为阴性对照，分别测定 492 nm光吸收值，经过多次ELISA检测，确定最佳工作条件为抗原的最适合包被浓度为 25μ g/ml，4°C包被过夜；阳性和阴性血清最佳工作浓度为1:800，37°C孵育Ih ； HRP二抗最佳工作浓度为1:4000，37°C孵育lh，以此建立了间接ELISA筛选方法。(3)阳性杂交瘤细胞株的建立和稳定性检测
取加强免疫3d后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞以5 1在PEG1500的作用下融合， 以建立的间接ELISA方法筛选出阳性杂交瘤细胞株，通过多次克隆化和筛选后，获得一株能分泌单克隆抗体的为“3C6”，其2011年12月7日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No. 5556，分类命名产朊蛋白单克隆抗体细胞株， 并用间接ELISA法检测连续培养30代以及冻存5个月复苏后的阳性杂交瘤细胞的上清液，确定其分泌抗体的稳定性；
(4)单克隆抗体生物学特性的鉴定
按试剂盒说明书操作，经鉴定该单克隆抗体为IgG2b型，以10%的梅花鹿脑勻浆包被 Elisa板，以3C6纯化后单抗(1 μ g/ml)检测，同时以SP2/0细胞上清和鼠阴性血清为阴性对照，在492nm下读值，3C6反应孔与阴性孔P/N在1观00倍稀释条件下仍大于2，说明该单克隆抗体具有识别天然结构梅花鹿朊蛋白的能力。本发明单克隆抗体在制备具有识别梅花鹿朊蛋白天然结构的检测试剂中的应用。本发明受到了国家自然科学基金面上项目(30871956)的资助。本发明的优点是单克隆抗体具有识别梅花鹿朊蛋白天然结构的能力，该单克隆抗体具有特异性强的特点，经重复试验，证明该实验结果准确，利用I^rPe制备单克隆抗体主要是为获得检测朊病毒高效的免疫学检测试剂。
图Ia是本发明重组表达载体PET-Trx构建图； 图Ib是本发明重组表达载体PET-His构建图2是PrP-Trx表达图，椭圆标记处为目的蛋白，目的蛋白大小为2. SKd ；
图3是PrP-Trx纯化图，1和2均为切胶纯化后的目的蛋白；
图4是ft~P-HIS表达图，椭圆标记处为目的蛋白；
图5是PrP-HIS纯化图，1和2均为切胶纯化后的目的蛋白；
图6是免疫后血清效价图，在51200X稀释时阳性血清和阴性血清的P/N仍超过2. 1 ；
图7是利用单抗3C6检测梅花鹿脑，在Western blot中可见特异性条带。
具体实施例方式实施例1重组朊蛋白PrFes的制备
(1)制备重组朊蛋白PrP"s基因的人工合成引物为 Fff: GGG AAT TCC ATA TGA AGA AGC GAC CAA AAC CTG RV: CGGATC CGA ACT TGC CCC TCG TTG GTA ；
(2)提取梅花鹿总基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增条件为预变性95°C2分钟，变性93°C 50秒，退火56°C 45秒，延伸72°C 1分钟，30个循环，最后72°C延伸10分钟，获得目的基因，克隆至PMD-IST-Simple载体上，酶切鉴定，目的基因核苷酸序列见SEQ ID UfI^rPlres基因片段插入表达载体pET-TRX和PET-HIS中构建重组表达质粒，pET_TRX_ PrPres, pET-HIS-PrPres ；
(3)将重组表达质粒pET-TrS-PrPlres和PET-His-PrPlres转化BL21(DE3)中进行表达， 得到重组融合蛋白PrFes-Trx和PrFes-His,PrPres-Trx作为免疫原免疫动物，PrFes-His包被ELISA板后作为检测源用来筛选单抗。实施例2重组朊蛋白PrFes的大量制备和切胶回收
表达条件为阳性克隆培养物以1%接种于LB培养基(50mg/L抗生素)。37°C剧烈摇荡培养至0D600=0. 6时，加入终浓度为lmmol/L的IPTG进行诱导，220r/min，剧烈摇培4h。离心收集菌体，菌体重新PBS悬浮并经超声波裂解，离心分别收集上清和沉淀，通过SDS-PAGE 分别检测全菌、上清和沉淀，发现I^rFes-Trx和PrFes-His分别以包涵体的形式大量表达。切胶纯化方法，取500 μ L包涵体提取液处理后不插样品梳直接上样，按常规方法进行SDS-PAGE。将胶浸入2 mol/L NaAc溶液中在摇床上染色1 h，将染成银白色的含目的蛋白胶切割下来，置于蒸馏水中在脱色摇床上摇20 min，脱去NaAc。之后将切下来的胶放在密封透析袋内，之后以电泳的方法使目的蛋白游离出来，将透析袋中的凝胶取出后， 用PEG20000进行浓缩，然后做透析去除小分子。经SDS-PAGE和flfestern blot鉴定后，分装后放入-80度冰箱备用。实施例3动物免疫
以复性的重组朊蛋白PrPres-Trx免疫8周龄Balb/c雌性小鼠，100 μ g/只，皮下分点注射，首次免疫用弗氏完全佐剂(1:1)乳化抗原，间隔3周后，采用弗氏不完全佐剂 (1:1)乳化抗原，进行第2、3次免疫，最后加强免疫时，直接用免疫原进行腹腔注射。实施例4间接ELISA的建立
分别以重组成熟朊蛋白PrPres-His和空载体菌体蛋白pET-His包被酶标板孔，以测定PrPres-Trx免疫血清效价，以未免疫的小鼠血清和SP2/0细胞上清为阴性对照，分别测定 492 nm光吸收值，经过多次ELISA检测，确定最佳工作条件为抗原的最适合包被浓度为 25μ g/ml，4°C包被过夜；阳性和阴性血清最佳工作浓度为1:800，37°C孵育Ih ； HRP二抗最佳工作浓度为1:4000，37°C孵育lh，以此建立了间接ELISA筛选方法。实施例5阳性杂交瘤细胞株的建立和稳定性检测
取加强免疫3d后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞以5:1在PEG1500的作用下融合，以建立的间接ELISA方法筛选出阳性杂交瘤细胞株，通过多次克隆化和筛选后，获得一株能分泌的抗体为“3C6”，2011年12月7日其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No. 5556，分类命名产朊蛋白单克隆抗体细胞株，并用间接 ELISA法检测连续培养30代以及冻存5个月复苏后的阳性杂交瘤细胞的上清液，确定其分泌单克隆抗体的稳定性。实施例6单抗生物学特性的鉴定
按试剂盒说明书操作，鉴定单克隆抗体为IgG2b型，以10%的梅花鹿脑勻浆包被Elisa 板，以纯化后单抗(1 μ g/ml)检测，同时以SP2/0细胞上清和鼠阴性血清为阴性对照。在 492nm下读值，该单克隆抗体反应孔与阴性孔P/N在1观00倍稀释条件下仍大于2，说明该单克隆抗体具有识别天然结构梅花鹿朊蛋白的能力。
权利要求
1. 一种识别天然结构梅花鹿朊蛋白的单克隆抗体，其特征在于是由下列方法得到的(一)、重组朊蛋白PrFes的制备如下(1)制备重组朊蛋白PrP"s基因的人工合成引物为Fff: GGG AAT TCC ATA TGA AGA AGC GAC CAA AAC CTG ； RV: CGGATC CGA ACT TGC CCC TCG TTG GTA ；(2)提取梅花鹿总基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得目的基因，克隆至 PMD-18T-Simp 1 e载体上，将PrFes基因片段插入表达载体pET_Trx中构建重组表达质粒，pET-Trx- PrPres ；将PrFes基因片段插入表达载体ρΕΤ-His中构建重组表达质粒， pET-His- PrPres ；(3)将重组表达质粒ρΕΤ- χ-PrPlres和pET-His- PrPres转入BL21 (DE3)中进行表达， 得到两种重组融合蛋白PrPres-Trx和PrPres-His,表达条件为阳性克隆培养物以1%接种于 LB培养基(50mg/L抗生素)，37°C剧烈摇荡培养至0D600=0. 6时加入终浓度为lmmol/L的 IPTG进行诱导，220r/min剧烈摇培4h，离心收集菌体，菌体重新PBS悬浮并经超声波裂解， 离心分别收集上清和沉淀，通过SDS-PAGE分别检测全菌、上清和沉淀，发现PrPres-Trx和 PrPres-His分别以包涵体的形式大量表达；(4)切胶纯化方法，取500μ L包涵体提取液处理后不插样品梳直接上样，按常规方法进行SDS-PAGE，将胶浸入2 mol/L NaAc溶液中在摇床上染色1 h，将染成银白色的含目的蛋白胶切割下来，置于蒸馏水中在脱色摇床上摇20 min,脱去NaAc，之后将切下来的胶放在密封透析袋内，以电泳的方法使目的蛋白游离出来，将透析袋中的凝胶取出后， 用PEG20000进行浓缩，做透析去除小分子，经SDS-PAGE和flfestern blot鉴定后分装后放入-80度冰箱备用；抗重组朊蛋白PrPres单克隆抗体的制备(1)动物免疫以复性的重组朊蛋白PrPres-Trx免疫8周龄Balb/c雌性小鼠，100 μ g/只，皮下分点注射，首次免疫用弗氏完全佐剂(1:1)乳化抗原，间隔3周后，采用弗氏不完全佐剂 (1:1)乳化抗原，进行第2、3次免疫，最后加强免疫时，直接用免疫原进行腹腔注射；(2)间接ELISA筛选方法以及阳性杂交瘤判断标准的建立分别以重组成熟朊蛋白PrPres-His和空载体菌体蛋白pET-His包被酶标板孔，以测定PrPres-Trx免疫血清效价，以未免疫的小鼠血清和SP2/0细胞上清为阴性对照，分别测定 492 nm光吸收值，经过多次ELISA检测，确定最佳工作条件为抗原的最适合包被浓度为 25μ g/ml，4°C包被过夜；阳性和阴性血清最佳工作浓度为1:800，37°C孵育Ih ； HRP二抗最佳工作浓度为1:4000，37°C孵育lh，以此建立了间接ELISA筛选方法；(3)阳性杂交瘤细胞株的建立和稳定性检测取加强免疫3d后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞以5 1在PEG1500的作用下融合， 以建立的间接ELISA方法筛选出阳性杂交瘤细胞株，通过多次克隆化和筛选后，获得一株能分泌单克隆抗体的为“3C6”，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No. 5556，分类命名产朊蛋白单克隆抗体细胞株，并用间接ELISA法检测连续培养30代以及冻存5个月复苏后的阳性杂交瘤细胞的上清液，确定其分泌抗体的稳定性；(4)单克隆抗体生物学特性的鉴定按试剂盒说明书操作，经鉴定该单克隆抗体为IgG2b型，以10%的梅花鹿脑勻浆包被 Elisa板，以3C6纯化后单抗(1 μ g/ml)检测，同时以SP2/0细胞上清和鼠阴性血清为阴性对照，在492nm下读值，3C6 反应孔与阴性孔P/N在1观00倍稀释条件下仍大于2，说明该单克隆抗体具有识别天然结构梅花鹿朊蛋白的能力。
2.如权利要求1所述的一种识别天然结构梅花鹿朊蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括下列步骤(一)、重组朊蛋白PrFes的制备如下(1)制备重组朊蛋白PrP"s基因的人工合成引物为Fff: GGG AAT TCC ATA TGA AGA AGC GAC CAA AAC CTG ； RV: CGGATC CGA ACT TGC CCC TCG TTG GTA ；(2)提取梅花鹿总基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得目的基因，克隆至 PMD-18T-Simple载体上，将PrFes基因片段插入表达载体pET_Trx中构建重组表达质粒，pET-Trx- PrPres ；将PrFes基因片段插入表达载体ρΕΤ-His中构建重组表达质粒， pET-His- PrPres ；(3)将重组表达质粒ρΕΤ- χ-PrPlres和pET-His- PrPres转入BL21 (DE3)中进行表达， 得到两种重组融合蛋白PrPres-Trx和PrPres-His,表达条件为阳性克隆培养物以1%接种于 LB培养基(50mg/L抗生素)，37°C剧烈摇荡培养至0D600=0. 6时加入终浓度为lmmol/L的 IPTG进行诱导，220r/min剧烈摇培4h，离心收集菌体，菌体重新PBS悬浮并经超声波裂解， 离心分别收集上清和沉淀，通过SDS-PAGE分别检测全菌、上清和沉淀，发现PrPres-Trx和 PrPres-His分别以包涵体的形式大量表达；(4)切胶纯化方法，取500μ L包涵体提取液处理后不插样品梳直接上样，按常规方法进行SDS-PAGE，将胶浸入2 mol/L NaAc溶液中在摇床上染色1 h，将染成银白色的含目的蛋白胶切割下来，置于蒸馏水中在脱色摇床上摇20 min,脱去NaAc，之后将切下来的胶放在密封透析袋内，以电泳的方法使目的蛋白游离出来，将透析袋中的凝胶取出后， 用PEG20000进行浓缩，做透析去除小分子，经SDS-PAGE和flfestern blot鉴定后分装后放入-80度冰箱备用；抗重组朊蛋白PrPres单克隆抗体的制备(1)动物免疫以复性的重组朊蛋白PrPres-Trx免疫8周龄Balb/c雌性小鼠，100 μ g/只，皮下分点注射，首次免疫用弗氏完全佐剂(1:1)乳化抗原，间隔3周后，采用弗氏不完全佐剂 (1:1)乳化抗原，进行第2、3次免疫，最后加强免疫时，直接用免疫原进行腹腔注射；(2)间接ELISA筛选方法以及阳性杂交瘤判断标准的建立分别以重组成熟朊蛋白PrPres-His和空载体菌体蛋白pET-His包被酶标板孔，以测定PrPres-Trx免疫血清效价，以未免疫的小鼠血清和SP2/0细胞上清为阴性对照，分别测定 492 nm光吸收值，经过多次ELISA检测，确定最佳工作条件为抗原的最适合包被浓度为 25μ g/ml，4°C包被过夜；阳性和阴性血清最佳工作浓度为1:800，37°C孵育Ih ； HRP二抗最佳工作浓度为1:4000，37°C孵育lh，以此建立了间接ELISA筛选方法；(3)阳性杂交瘤细胞株的建立和稳定性检测取加强免疫3d后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞以5 1在PEG1500的作用下融合， 以建立的间接ELISA方法筛选出阳性杂交瘤细胞株，通过多次克隆化和筛选后，获得一株能分泌单克隆抗体的为“3C6”，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No. 5556，分类命名产朊蛋白单克隆抗体细胞株，并用间接ELISA法检测连续培养30代以及冻存5个月复苏后的阳性杂交瘤细胞的上清液，确定其分泌抗体的稳定性；(4)单克隆抗体生物学特性的鉴定按试剂盒说明书操作，经鉴定该单克隆抗体为IgG2b型，以10%的梅花鹿脑勻浆包被 Elisa板，以3C6纯化后单抗(1 μ g/ml)检测，同时以SP2/0细胞上清和鼠阴性血清为阴性对照，在492nm下读值，3C6 反应孔与阴性孔P/N在1观00倍稀释条件下仍大于2，说明该单克隆抗体具有识别天然结构梅花鹿朊蛋白的能力。
3.如权利要求1所述的识别天然结构梅花鹿朊蛋白的单克隆抗体在制备具有识别梅花鹿朊蛋白天然结构的检测试剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种识别天然结构梅花鹿朊蛋白的单克隆抗体及制备方法，属于生物检验检疫快速领域。包括制备重组蛋白PrPres，制备抗重组蛋白PrPres单克隆抗体，本发明的单克隆抗体具有识别梅花鹿朊蛋白天然结构的能力，该单克隆抗体具有特异性强的特点，经重复试验，证明该实验结果准确，利用PrPC制备单克隆抗体主要是为获得检测朊病毒高效的免疫学检测试剂。
文档编号C12N15/12GK102558349SQ20121000910
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月12日 优先权日2012年1月12日
发明者任洪林, 刘 东, 卢士英, 周玉, 宋杰, 张茂林, 李岩松, 柳增善 申请人:吉林大学