专利名称：检测细胞dact2基因启动子区dna甲基化状态的引物对及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测细胞DACT2基因启动子区甲基化状态的引物对及试剂盒。
背景技术：
原发性支气管肺癌(简称肺癌)是全世界范围的高发病率的恶性肿瘤之一，近年来其发病率的上升速度亦高居肿瘤之首。其中大约80%的肺癌为非小细胞性肺癌(Gandara D,Narayan S, Lara PN,Jr. , Goldberg Z,Davies A,Lau DH,et al. Integration of novel therapeutics into combined modality therapy of locally advanced non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 2005 ；ll(13Pt 2) :5057s_5062s·)。2008 年世界范围的统计表明，肺癌占恶性肿瘤发病总数的13% (160万)，因肺癌死亡人数占总人数的18% (140 万)。肺癌是最常见的恶性肿瘤、并且是男性癌症患者死亡的首要原因。而在女性中，是第四位常见的恶性肿瘤，并且排在恶性肿瘤死亡原因的第二位。男性患者肺癌最高发的地区包括欧洲、北美和亚洲。尽管中国女性吸烟率较低(不足成人吸烟者总数的4%)，但却有较高的肺癌摧患率，即每10万人中有21. 3个患者(Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E,Forman D. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin 2011 ；61 (2) :69-90.)。 在发达国家中，肺癌5年存活率仅13% ;80%的患者在诊断肺癌后I年内死亡。由于目前尚缺乏有效的早期发现、早期诊断的方法，肺癌的早期诊断率仅为15%。因此，改善肺癌预后的关键在于早发现、早诊断。胃癌是人类最常见的消化道原发恶性肿瘤之一，在人类恶性肿瘤导致死亡的排位中居第二位，每年新增病例数超过600，000例，以日本、中国、东欧、南美为高发地区， 其中中国占到全世界胃癌发病例数的42 % (Washington K :7th edition of the AJCC cancer staging manual stomach. Ann Surg Oncol 2010,17 :3077-3079 ；Parkin DM,Bray F, Ferlay J, Pisani P. Global cancer statistics,2002. CA J Clin.2005 ；5 :77-108 ； Juan Shang, AS Pena. Muhidisciplinary approach to underamnd the pathogenesis of gastric cancer. World J Gastroenterol, 2005,11 (27) :4131-4139.)。在我国男性、女性的胃癌死亡率均高于世界、发达及发展中国家的平均水平，男性居全世界排位中的第6位， 女性居第10位(段纪俊，陈万青，张思维.中国恶性肿瘤死亡率的国际比较.中国社会医学杂志 2009 年 12 月第 26 卷第 6 期 Chinese Journal of Social Medicine, December2009, Vol. 26 (6) :377-378.)。胃癌起病隐袭，临床症状往往不典型，病程的不同阶段可出现不规律的腹痛、药物不缓解、早饱、乏力、消瘦、便潜血阳性等症状。胃镜检查虽然能够较直观的观测胃内粘膜病变，但最终诊断还是依赖于胃镜下胃组织的病理活检及手术标本的病理诊断。单纯外科手术切除并不能取得满意的临床效果，目前手术切除为主的综合治疗后， M分期I期患者的5年生存率仅为60-70%，而III、IV期患者的5年生存率甚至不超 20% (Hundahl SA, Phillips JL, Menck HR. The National Cancer Data Base Reporton poor survival of U.S. gastric carcinoma patients treated with gastrectomy Fifth Edition American Joint Committee on Cancer staging, proximal disease, and the “different disease，，hypothesis. Cancer 2000,88 :921-932.),因此胃癌预后不良。 多项大规模多中心对照研究均提示早诊断、早治疗、寻求更为有效的化疗药物是提高胃癌生存率的有效措施。因此发现胃癌的早期诊断和治疗的有效方法具有十分重要的意义。肺癌和胃癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤，目前由于尚缺乏早期诊断和治疗的有效方法，病人预后常不良。因此针对肺癌和胃癌的诊断和治疗手段，尤其是对肿瘤的早期诊断、残留病灶及复发的检测方法仍然十分有限，是目前迫切需要解决的问题。近年来，表观遗传学(Epigenetics)已逐渐成为生命科学研究领域的前沿和热点。表观遗传学是相对于遗传学而言的，其定义是指研究不依赖于DNA序列改变的可遗传的基因表达变化的科学。表观遗传学概念的提出可以解释部分经典遗传学所不能解释的问题如同卵双生的双胞胎具有完全相同的基因型，并在相同环境下成长，但仅其中一人罹患肿瘤，而另一人身体健康，因此表观遗传改变为这一现象提供了合理的解释。在肿瘤研究中，表观遗传学研究的范畴主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA调控。DNA甲基化是表观遗传学调控的主要方式，基因启动子区CpG岛的高甲基化或全基因组范围的低甲基化可以导致肿瘤。DNA甲基化是指在甲基化转移酶作用下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到CG 二核苷酸胞嘧啶的5号碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化改变可以是细胞癌变过程中的早期、频发事件，因此特定基因的异常甲基化往往可以作为肿瘤早期诊断的分子标志物、治疗靶点和预后判断的手段等。近年来甲基化检测手段不断丰富，目前主要包括两大类一是亚硫酸氢钠法(Sodium Bisulfite),包括亚硫酸氢钠法依赖的基因测序法、亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法(COBRA)、甲基化特异性 PCR(Methylation Specific PCR, MSP)、甲基化敏感的单核苷酸扩增法(Ms-SNuE)等；另一类是甲基化敏感的限制性内切酶法，包括Southern法、甲基化敏感的限制性图谱(MSRF)、 限制性标记基因组扫描技术(RLGS)、差异性甲基化杂交分析(DMH)、甲基化CpG岛扩增子分析(MCA)等。特别是 1996 年 Herman 等(Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. Methylation-specific PCR :a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci U S A 1996 ；93(18) :9821-9826.)发明了甲基化特异性PCR(Methylation Specific PCR,MSP)技术后，优化了 DNA甲基化的检测方法，其突出优点在于高特异性、高灵敏度、操作简便、费用及耗时均较少、不受限制性内切酶的限制。MSP 的基本原理是DNA经过亚硫酸盐硫化修饰后，CpG岛上没有发生甲基化的CG二核苷酸中的胞嘧啶就转化为尿嘧啶，最后转化为胸腺嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶则保持不变，因此设计甲基化引物及非甲基化引物，分别进行PCR扩增，产物进行凝胶电泳分析结果，得出是否为甲基化的结论。人类DACT (dapper, antagonist of beta-catenin)基因又名 dapper、dpr 和 frodo，该基因家族包括三个成员DACT1、DACT2和DACT3。人类DACT2基因是2003年由 Kaoth 等(Katoh M. Identification and characterization of human DAPPERI and DAPPER2 genes in silico. Int J Oncol 2003 ；22(4) :907-913.)发现，该基因位于人类染色体6q27，此位点是乳腺癌、肺癌和胃癌等恶性肿瘤常见的染色体缺失位点，因此推测 DACT2可能是一个潜在的抑癌基因并参与肿瘤发生发展。目前针对DACT2的研究主要集中在胚胎发育领域，Waxman等(Waxman JS. Zebrafish Dapperl and Dapper2 play distinct roles in ffnt-mediated developmental processes. Development. 2004 ；131 :5909-21.) 认为DACT2增强WNT/Ca2+-PCP信号通路中Stbm/Wntll的作用，调控原肠胚形成过程中细胞的运动。Cheyette 等(Cheyette BN, Waxman JS, Miller JR, Takemaru K, Sheldahl LC, Khlebtsova N,et al. Dapper, a Dishevelled-associated antagonist of beta-catenin and JNK signaling, is required for notochord formation. Dev Cell. 2002 ；2 :449-61.) 在非洲爪蟾胚胎脊索形成中发现DACT2是脊椎动物脊索及头部发育所必需的调节因子，其过表达能够增强WNT信号通路中Axin和GSK-3活性使β -catenin降解，同时DACT2是 Dvl的抑制因子,可抑制Dvl介导的β -catenin非依赖型Wnt通路中JNK活化。Hikasa等 (Hikasa H. The involvement of Frodo in TCF-dependent signaling and neural tissue development. Development. 2004 ；131 :4725-34.)发现在胚胎神经发育过程中 DACT2 通过影响Dvl和TCF调节Wnt下游靶基因。DACT2抑制Wntl介导β-catenin报告基因的荧光活性，抑制 WNT 信号通路激活(Waxman JS, Hocking AM, Stoick CL, Moon RT. Zebrafish Dapperl and Dapper2play distinct roles in ffnt-mediated developmental processes. Development 2004 ；131 (23) :5909-5921.)。相反的观点认为，DACT2 可能是 WNT 信号通路所必需的正向调控因子。此外，DACT2在TGF-β信号通路中的作用也已被发现。DACT2 促进Nodal/TGF-β的I型受体经溶酶体途径降解抑制斑马鱼DACT2Nodal信号的中胚层诱导活性(Su Y, Zhang L, Gao X, Meng F, Wen J, Zhou H, et al. The evolutionalIy conserved activity of Dapper2in antagonizing TGF-beta signaling. FASEBJ 2007 ； 21(3) :682-690.)。Meng 等(Meng F,Cheng X,Yang L,Hou N,Yang X’Meng A. Accelerated re-epithelialization in Dpr2~deficient mice is associated with enhanced response to TGFbeta signaling. J Cell Sci2008 ； 121 (Pt 17) :2904-2912.)利用基因打靶技术制备了 DACT2基因完全敲除小鼠模型(Dact2-/_)，缺失DACT2基因对小鼠胚胎发育、 生长和脑的形态没有影响，但是DACT2可以通过抑制TGF- β信号通路来抑制创伤皮肤的再表皮化，影响表皮细胞的迁移及粘附能力。综上所述，DACT2在发育学中对WNT信号通路的调控作用尚存争议，其在肺癌和胃癌中的表观遗传学改变及功能的研究目前尚未见报道。本发明人应用甲基化特异性PCR(MSP)方法率先对肺癌和胃癌细胞系及肿瘤组织进行检测，首次发现细胞DACT2基因呈高甲基化状态，预实验结果提示细胞DACT2基因可能是肺癌和胃癌中新的抑癌基因，此外细胞DACT2基因的启动子区高甲基化状态可能是一个崭新的肿瘤分子标记物。在此基础上，本发明人应用MSP方法对大量肺癌和胃癌肿瘤组织标本以及正常的肺组织及胃组织标本进行检测，以明确细胞DACT2基因启动子区甲基化状态。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测细胞DACT2基因启动子区甲基化状态的引物对，即用于检测细胞DACT2基因启动子区甲基化和非甲基化状态的一对特异性引物对，其包括甲基化引物和非甲基化引物，同时本发明还提供一种含有上述甲基化引物或非甲基化引物的试剂盒。本发明提供一种用于检测细胞DACT2基因启动子区甲基化状态的引物对，包括甲基化引物和非甲基化引物，其中，所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列为5’ -GCGCGTGTAGATTTCGTTTTTCGC-3’，下游引物核苷酸序列为 5’ -AACCCCACGAACGACGCCG-3’;所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列为5’ -TTGGGGTGT GTGTAGATITTGITITTTGT-3’，下游引物核苷酸序列为5’ -CCCAAACCCCACAAACAACACCA-3’。本发明还提供一种用于检测肺癌和胃癌细胞的试剂盒，其中，该试剂盒含有上述甲基化引物或非甲基化引物。本发明具有如下优点利用本发明所述引物对及试剂盒检测肺组织及胃组织细胞，在肺癌及胃癌细胞中DACT2基因启动子区呈高甲基化状态，甲基化率分别为41%和 56%，而在正常肺组织及胃组织细胞中，DACT2基因启动子区呈非甲基化状态，表明该基因启动子区的甲基化状态对于肺癌及胃癌细胞具有特异性；同时应用本发明所述引物对及试剂盒可使检测肺癌及胃癌细胞的灵敏度达到O. 5%，即1000个细胞中有5个甲基化的细胞就能够被检测出，这说明DACT2基因启动子区甲基化状态可作为肺癌和胃癌中新的分子标志。本试剂盒首次选用细胞DACT2基因作为目标基因，该基因是本发明人应用MSP技术率先在肺癌和胃癌中筛选出的启动子区呈高甲基化状态的基因，具有首创性。因此，应用本发明引物及试剂盒来检测细胞DACT2基因启动子区高甲基化状态可作为肺癌和胃癌诊断、疗效观察、预后判断、残留病灶及复发检测等的有力手段，而且，操作简便、稳定性好，具有深远的临床意义和推广性。
图I以硫化修饰后的正常胃组织细胞DNA(非甲基化对照)、硫化修饰后的胃癌 PHM82细胞系DNA(甲基化对照)和ddH20(系统对照)建立对照体系，分别用甲基化引物及非甲基化引物对肺癌组织标本进行MSP检测，扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果如图所
/Jn ο图2以硫化修饰后的正常胃组织细胞DNA(非甲基化对照)、硫化修饰后的胃癌 PHM82细胞系DNA(甲基化对照)和ddH20(系统对照)建立对照体系，分别用甲基化引物及非甲基化引物对胃癌组织标本进行MSP检测，扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果如图所图3以硫化修饰后的正常胃组织细胞DNA(非甲基化对照)、硫化修饰后的胃癌 PHM82细胞系DNA(甲基化对照)和ddH20(系统对照)建立对照体系，分别用甲基化引物及非甲基化引物对正常肺组织标本和正常胃组织标本进行MSP检测，扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果如图所示。图4将胃癌PHM82细胞系DNA(DACT2基因启动子区100%甲基化)与正常胃组织细胞DNA(DACT2基因启动子区100%非甲基化)按比例混合，进行硫化修饰，此后用甲基化弓I物进行扩增，扩增产物电泳结果如图所示。
具体实施例方式经过反复的试验与推敲，本发明人选出一对特异性很好的甲基化及非甲基化的引物对，应用琼脂糖凝胶电泳技术作为结果的检出手段，得到了可靠的实验结果。实验结果表明DACT2基因启动子区的高甲基化状态在人类肺癌和胃癌中具有较高的检测特异性及灵敏性。利用所述引物对及试剂盒检测细胞DACT2基因甲基化状态的灵敏度高，解决了上述现有技术中其他方法的检出率低、结果不易分析、临床难以推广等一系列技术问题，因此本发明所述的引物对及试剂盒可用于肺癌和胃癌的早期诊断、疗效判定、残留病灶及复发的检测等。本发明提供的用于检测细胞DACT2基因启动子区甲基化状态的引物对，包括甲基化引物和非甲基化引物，其中，所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列如Primer-MF所述，即5’ -GCGCGTGTAGATTTCGTTTTTCGC-3’，下游引物核苷酸序列如Primer-MR所述，即 5’ -AACCCCACGAACGACGCCG-3’ ；所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列如Primer-UF所述，即5’ -TTGGGGTGTGTGTAGATTTTGTTTTTTGT-3’，下游引物核苷酸序列如 Primer-UR 所述， 即5， -CCCAAACCCCACAAACAACACCA-3，。利用上述甲基化引物，以硫化修饰后的DNA为模板进行MSP扩增，如果DACT2基因启动子区存在甲基化，则会得到152bp大小的片段；如果DACT2基因未发生甲基化，则不产生扩增产物。基于此，本申请将该引物称为甲基化引物。所述甲基化引物，其上游引物的 Tm(50mM Na.) 52. 3，GC 含量 50% ;下游引物的 Tm(50mM Na+) 52. 4，GC 含量 68. 4%。利用上述非甲基化引物，以硫化修饰后的DNA为模板进行MSP扩增，如果DACT2 基因未发生甲基化，则会得到161bp大小的片段。基于此，本申请将该引物称为非甲基化引物。所述非甲基化引物，其上游引物的Tm(50mM Na+) 50. 8，GC含量34. 5% ;下游引物的 Tm(50mM Na+) 5L 9，GC 含量 52. 2% 0本发明提供的用于检测肺癌和胃癌细胞的试剂盒含有上述甲基化引物或非甲基化引物。进一步地，本发明的试剂盒还含有甲基化对照MSP模板，该模板为硫化修饰后的细胞DACT2基因启动子区为100%甲基化的癌细胞DNA。在此，对该癌细胞没有特别的限制，只要满足“硫化修饰后的细胞DACT2基因启动子区100%甲基化”即可，例如可以为胃癌 PHM82细胞、肺癌H23细胞等。进一步地，本发明的试剂盒还含有非甲基化对照MSP模板，该模板为硫化修饰后的细胞DACT2基因启动子区为100%非甲基化的正常细胞DNA。在此，对该正常细胞没有特别的限制，只要满足“硫化修饰后的细胞DACT2基因启动子区100%非甲基化”即可，例如可以为正常胃组织细胞、肺组织细胞等。进一步地，本发明的试剂盒还含有作为双阴性系统对照的ddH20。进一步，本发明的试剂盒还含有MSP反应所需的下列成分50mMMgCl2，10XMSP buffer,IOmM dNTP mixture, Hot start Taq 酶。为更详细地了解本发明，以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例一I、模板的制备(基因组DNA的提取及硫化修饰过程)DNA的制备获取肺癌、胃癌组织标本以及正常肺组织和胃组织标本。在本实施例中各取5个肺癌组织标本(LCl LC5)、5个胃癌组织标本(GCl GC5)，2个正常肺组织标本(NmLl和NmL2)以及2个胃组织标本(NmGl和NmG2)。应用酚-氯仿抽提的方法分别对上述标本进行基因组DNA提取，紫外分光光度仪测定吸光度(A)值确定其含量及纯度。亚硫酸盐修饰参考herman (J. G. Herman, J. R. Graff, S. Myohanen, B. D. Nelkinand S.B.Baylin, Methylation-specific PCR :a novel PCR assay for methylation status of CpG islands, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996)，9821-9826.)等报道的方法。取上述制备的基因组DNA，经稀释后精确取2ugDNA，加去离子水至终体积50ul，加入新鲜配制的3M的NaOH 5ul，37°C孵育25min。之后加入新鲜配制的IOmM的氢醌30ul及3M 亚硫酸氢钠520ul混合均匀(其内已加入新鲜配制的3M的NaOH，计算方法10ml 3M亚硫酸氢钠中加入3M的NaOH 740ul)，50°C孵育16h，此后应用DNA纯化试剂盒(Promega公司产品)纯化并回收DNA，应用50ul去离子水洗脱DNA，向其内加入5ul 3M的NaOH以终止硫化修饰,用3倍体积的无水乙醇沉淀DNA，最终硫化修饰后的DNA重新溶解在20ul去离子水中，得到DNA模板，立即使用或_20°C保存备用。2、MSP 扩增以甲基化引物进行扩增的MSP反应体系，以总体积25ul计，包括模板(硫化修饰后的DNA) 2ul ；甲基化引物(50pmol/ul)上游引物(5，-GCGCGTGTAGATTTCGTTTTTCGC-3’) 0. 5ul,下游引物(5，-AACCCCACGAACGACGCCG-3’) 0. 5ul ；50mM MgCl2 (Invitrogen 公司)0. 75ul ；10XMSPbuffer (缓冲液,Invitrogen 公司)2. 5ul ；IOmM dNTP mixture (Invitrogen 公司)1. 25ul ；Hot start Taq 酶(Invitrogen 公司，浓度为 5U/ μ L) 0. Iul ；ddH20 17. 4ul以非甲基化引物进行扩增的MSP反应体系与以甲基化引物进行扩增的MSP反应体系的不同之处仅在于引物不同。具体地，以非甲基化引物进行扩增的MSP反应体系，以总体积25ul计,包括非甲基化引物(50pmol/ul)上游引物(5，-TTGGGGTGTGTGTAGATTTTGTTTTTTGT-3’) :0. 5ul,下游引物(5，-CCCAAACCCCACAAACAACACCA-3，)0. 5ul ；其余组分及其用量均与以甲基化引物进行扩增的MSP反应体系中的相同。以上仅分别列举了以甲基化引物和非甲基化引物进行扩增的MSP反应体系中各组分的用量的一个例子，使用不同公司生产的MgCl2、MSP buffer缓冲液、dNTP mixture、Hot start Taq酶时，反应体系中各组分的用量会有所不同，可以根据实际需要进行调整。本发明对MSP反应体系中各组分的用量没有特别的限制，使用常规的用量即可。应用上述MSP反应体系对已制备的DNA模板(5个肺癌组织标本LCl LC5、5个胃癌组织标本GCl GC5，2个正常肺组织标本NmLl和NmL2以及2个正常胃组织标本NmGl 和NmG2)分别进行扩增，并以胃癌PHM82细胞系DNA为甲基化对照，以正常胃组织标本(NG) 为非甲基化对照，以ddH20作为双阴性的系统对照，扩增程序为95°C预变性5min，接着进入循环，在95°C下变性30s，在62°C下退火30s，在72°C下延伸40s，共35个循环，之后，继续在72°C下延伸5min。3. MSP反应产物的检测MSP产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射分析仪检测并照相。
4.结果图I以硫化修饰后的正常胃组织细胞DNA(非甲基化对照)、硫化修饰后的胃癌 PHM82细胞系DNA(甲基化对照)和ddH20(系统对照)建立对照体系，分别用甲基化引物及非甲基化引物对肺癌组织标本进行MSP检测，扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果如图所
/Jn ο图中，LCl，LC2，LC3，LC4和LC5分别代表肺癌组织标本；PHM82为M阳性的胃癌细胞系，此处作为甲基化对照；ddH20为双阴性的系统对照，用以评估体系是否存在PCR产物的污染，如ddH20检测的结果为双阴性(M和U均为阴性)，则体系结果可信；NG为U阳性的正常胃组织标本，此处作为非甲基化对照。U代表非甲基化结果…代表甲基化结果；Marker为DL2000marker (分子量标准),上下两条带分别代表200bp和IOObp ；本体系扩增产物大小，U带为161bp，M带为152bp。图2以硫化修饰后的正常胃组织细胞DNA(非甲基化对照)、硫化修饰后的胃癌 PHM82细胞系DNA(甲基化对照)和ddH20(系统对照)建立对照体系，分别用甲基化引物及非甲基化引物对胃癌组织标本进行MSP检测，扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果如图所
/Jn ο图中，GCl，GC2，GC3，GC4和GC5分别代表胃癌组织标本；PHM82为M阳性的胃癌细胞系，此处作为甲基化对照；ddH20为双阴性的系统对照，用以评估体系是否存在PCR产物的污染，如ddH20检测的结果为双阴性(M和U均为阴性)，则体系结果可信；NG为U阳性的正常胃组织标本，此处作为非甲基化对照。U代表非甲基化结果…代表甲基化结果；Marker为DL2000marker (分子量标准),上下两条带分别代表200bp和IOObp ；本体系扩增产物大小，U带为161bp，M带为152bp。图3以硫化修饰后的正常胃组织细胞DNA(非甲基化对照)、硫化修饰后的胃癌 PHM82细胞系DNA(甲基化对照)和ddH20(系统对照)建立对照体系，分别用甲基化引物及非甲基化引物对正常肺组织标本和正常胃组织标本进行MSP检测，扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果如图所示。图中，NmLl和NmL2为正常肺组织标本2例，NmGl和NmG2为正常胃组织标本2例；PHM82为M阳性的胃癌细胞系，此处作为甲基化对照；ddH20为双阴性的系统对照，用以评估体系是否存在PCR产物的污染，如ddH20检测的结果为双阴性(M和U均为阴性)，则体系结果可信；NG为U阳性的正常胃组织标本，此处作为非甲基化对照。U代表非甲基化结果…代表甲基化结果；Marker为DL2000marker (分子量标准),上下两条带分别代表200bp和IOObp ；本体系扩增产物大小，U带为161bp，M带为152bp。结果判读方法如下应用甲基化引物(图中以M表示)进行扩增，有扩增产物，并且应用非甲基化引物(图中以U表示)进行扩增，无扩增产物的标本则判读为完全甲基化结果；应用甲基化引物及非甲基化引物进行扩增，均有扩增产物的标本判读为部分甲基化结果；应用非甲基化引物进行扩增，有扩增产物，并且用甲基化引物进行扩增，无扩增产物的标本则判读为非甲基化结果。部分甲基化及完全甲基化的标本均判读为甲基化结果。如图I所示，肺癌组织中，LCl、LC4和LC5为非甲基化结果，LC2和LC3为甲基化结果。如图2所示，胃癌组织中，GC4和GC5为非甲基化结果，GCU GC2和GC3为甲基化结果。如图3所示，正常肺组织(NmLl和NmL2)和正常胃组织(NmGl和NmG2)均为非甲基化结果。对照体系反应正常，结果可信。实施例二临床标本检测取106例肺癌组织标本、95例胃癌组织标本，4例正常肺组织标本和7例正常胃组织标本，进行MSP扩增，模板制备、MSP扩增体系及条件、扩增产物的检测均与实施例一中的相同，检测结果请见下表I :表I
权利要求
1.一种用于检测细胞DACT2基因启动子区甲基化状态的引物对，包括甲基化引物和非甲基化引物，其中，所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列为5’-GCGCGTGTAGATTTCGTTTTTCGC-3’，下游引物核苷酸序列为 5’ -AACCCCACGAACGACGCCG-3’;所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列为5’ -TTGGGGTGT GTGTAGATITTGITITTTGT-3’，下游引物核苷酸序列为5’ -CCCAAACCCCACAAACAACACCA-3’。
2.一种检测肺癌和胃癌细胞的试剂盒，其特征在于含有权利要求I中所述的甲基化引物或非甲基化引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于还含有甲基化对照MSP模板，该模板为硫化修饰后的细胞DACT2基因启动子区100%甲基化的癌细胞DNA。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于还含有非甲基化对照MSP模板，该模板为硫化修饰后的细胞DACT2基因启动子区100%非甲基化的正常细胞DNA。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于还含有作为双阴性系统对照的ddH20。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的试剂盒，其特征在于还含有MSP反应所需的下列成分50mM MgCl2,10XMSP buffer, IOmMdNTP mixture, Hot start Taq 酶。
全文摘要
本发明提供用于检测细胞DACT2基因启动子区甲基化状态的引物对及试剂盒。本试剂盒首次选用细胞DACT2基因作为目标基因，该基因是本发明人应用MSP技术率先在肺癌和胃癌细胞系及肿瘤组织中筛选出的启动子区呈高甲基化状态的基因，具有首创性。利用本发明所述试剂盒及特异性引物对检测肺癌和胃癌肿瘤组织甲基化状态的特异性好，可分别达到41％和56％；灵敏度高，达到5‰，即1000个细胞中有5个甲基化的细胞就能够被检测出。应用本发明试剂盒来检测细胞DACT2基因启动子区高甲基化状态可作为肺癌和胃癌诊断、疗效观察、预后判断、残留病灶及复发检测等的有力手段，而且，操作简便、稳定性好，具有深远的临床意义和推广性。
文档编号C12N15/11GK102586425SQ20121000916
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月12日 优先权日2012年1月12日
发明者于源滋, 杨云生, 贾岩, 郭明洲, 韦立新, 韩为东 申请人:中国人民解放军总医院