专利名称：一种间充质干细胞及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞工程领域，具体提供了一种间充质干细胞及其制备方法和应用。
背景技术：
间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。近年来有文献报道人脐带Wharton' s(音译华顿氏)胶质也富含间充质干细胞。脐带间充质干细胞和骨髓来源的间充质干细胞类似，表达一些共有的表面标志物，具有较高自我再生能力，能分化成脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、神经细胞、心肌细胞及内皮细胞。Baksh D等实验结果表明脐带间充质干细胞增殖能力高于骨髓间充质干细胞。由于骨髓穿刺手术对于供者是有创性手术，而且自采集骨髓液至培养临床治疗数量级的间充质干细胞需要4-6周时间。健康剖宫产脐带以往属于医疗废物，采集脐带对产妇及新生儿无任何影响，而且制备的合格脐带间充质干细胞可建立间充质干细胞库液氮保存，可短期内扩增获得临床治疗数量级细胞。人脐带Wharton' s胶质来源的基质细胞在再生治疗方面有广阔的应用前景。目前国内外文献报道的培养脐带来源间充质干细胞方法为低糖DMEM或α MEM培养基添加5-20%胎牛血清，同时可加入人间充质干细胞相关生长因子，如成纤维细胞生长因子FGF或血小板源生长因子PDGF。脐带间充质干细胞传代培养至Ρ2代或Ρ3代纯度可达到应用于再生治疗的要求，现有制备方法在传代时用猪胰腺提取的胰酶及EDTA.妝2消化上一代细胞后传代培养。但是应用现有方法制备的间充质干细胞制品中混杂少量牛血清白蛋白、猪胰酶，二者均是明确的高致敏原，患者接受本方法制备的间充质干细胞悬液会产生对应抗体，降低间充质干细胞治疗疗效及增加过敏性反应发生，而且有感染包括牛脑海绵状病在内的牛病毒的潜在风险。此外，Furlani D等研究表明利用胎牛血清培养的间充质干细胞有10%以上的细胞直径大于45 μ m,细胞直径越大对于微循环毛细血管床的阻塞作用越明显，大剂量静脉输注试验条件下严重时可导致小鼠死亡，这为患者利用间充质干细胞进行再生治疗带来了潜在的威胁。同时，在传代时，猪胰酶消化靶点较多，对间充质干细胞的毒性大，进而影响细胞的活力。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种间充质干细胞及其制备方法和应用，使得该制备方法制备的间充质干细胞直径较小，降低引发过敏性反应的几率，提高传代细胞活力。
为实现以上发明目的，本发明提供如下技术方案一种间充质干细胞的制备方法，将脐带去除脐动脉和脐静脉后切成小块，用含有 0. 1% IV型胶原酶的α MEM培养基以及完全培养基消化，然后将脐带小块和消化后得到的细胞悬液离心，去上清后洗涤除去胶原酶和胶原，接着用完全培养基重悬，重悬后的悬液转移至由贴壁基质包被过的培养瓶中培养，至出现梭形贴壁细胞时洗涤除去未贴壁细胞，并更换新的完全培养基继续培养，以后每2天更换一次完全培养基，至梭形贴壁细胞的汇聚度达到80-85%即得；所述完全培养基为含有15-25ng/ml FGF、15_25ng/ml PDGF、15_25ng/ml 人白蛋白、15-25ng/ml胰岛素、15_25ng/ml硒酸钠和15_25ng/ml铁蛋白的α MEM培养基；本发明采用的脐带由苏州大学第一附属医院妇产科提供，采集前经产妇同意并签署知情同意书。现有制备脐带间充质干细胞的方法，由于采用胎牛血清，使得间充质干细胞带有异种动物蛋白，增加其在患者体内引发过敏性反应的几率，同时现有制备的间充质干细胞直径较大，在用于再生治疗时，会对微循环毛细血管床起阻塞作用，给患者造成威胁。为此，本发明优化培养基成分，选用新的无血清无动物异种蛋白的完全培养基进行制备，大大减小了间充质干细胞引发过敏性反应的几率，并且最终制备的间充质干细胞直径经倒置显微镜检测，平均为沈μ m，而利用现有方法制备的细胞直径平均为35 μ m。同时，经小鼠注射试验检测，本发明间充质干细胞注射后小鼠死亡率仅为10 %，而现有方法制备的间充质干细胞小鼠死亡率为100%。其中，本发明所述完全培养基优选采用MesenCult-ACF无血清培养基，购自于加拿大Memcell公司，产品目录号为05420。所述贴壁基质可采用本领域常规贴壁基质，本发明优选采用含有纤连蛋白的贴壁基质，更优选采用MesenCult贴壁基质，购自于加拿大 Memcell公司。含有0. 1 % IV型胶原酶的α MEM培养基购自于Worthington公司。α MEM 培养基为本领域经常使用的培养基，是alpha改良的Earle培养基，购自于美国Gibco公司ο本发明所述消化优选为在37°C、250rpm下消化2小时，所述培养优选为在37°C、 5% CO2浓度、95%相对湿度下培养。在实际的消化过程中，脐带小块并不能完全消化成细胞悬液，仍有部分较小的小块残留，其上含有许多间充质干细胞，可随细胞悬液一并进入下个制备环节，避免浪费原材料。本发明在消化后的洗涤是为了去除胶原酶和胶原，而在梭形贴壁细胞出现后的洗涤是为了去除未贴壁细胞，两次洗涤可采用本领域常规的不影响细胞生长的试剂，如PBS，本发明优选采用α MEM培养基。在本发明继续培养过程中，按照本领域公知常识需要定期更换培养基，本发明优选每隔2天更换一次完全培养基，为了保证一定的细胞数量，本发明优选在梭形贴壁细胞汇聚度达到80-85%时收集。现有技术在传代时采用猪胰酶来消化贴壁细胞，但是猪胰酶是一种含有多种蛋白的混合物，间充质干细胞会带有一些猪胰酶，猪胰酶中的多种异种动物蛋白无疑会增加引发过敏性反应的几率。并且，猪胰酶对于间充质干细胞的毒性较大，在传代时影响细胞的活力。为此，作为优选方案，本发明还包括传代培养步骤，将上述培养的梭形贴壁细胞(即上一代间充质干细胞)洗涤，然后用TrypLE细胞分散酶消化至梭形贴壁细胞从贴壁基质上分离，将消化后得到的细胞悬液加入完全培养基离心去上清，与洗涤贴壁基质后的溶液混合离心去上清，再次洗涤去上清后用完全培养基重悬，将所得悬液接种于由贴壁基质包被过的培养瓶中，加入完全培养基培养，培养后的梭形贴壁细胞即为下一代间充质干细胞；所述完全培养基、贴壁基质、培养方法同上述制备方法。在本发明传代培养中，第一次洗涤是为了除去上一代间充质干细胞中残留的完全培养基中的蛋白，第二次洗涤是为了最大化收集用于传代培养的间充质干细胞，而第三次洗涤的目的与第一次洗涤相同，这三次洗涤均可采用本领域常规的不影响细胞生长的试剂，如PBS。本发明将用完全培养基重悬后的悬液以一定的细胞密度接种于由贴壁基质包被过的培养瓶中，经过培养即可得到下一代间充质干细胞。其中，作为优选，接种的细胞密度优选为3X IO3个/cm2 ；为了保证细胞充分的营养物质以及收集到一定量的细胞，本发明在传代培养中优选每隔2天更换一次完全培养基，并在下一代梭形贴壁细胞汇聚度达到 80-85%时收集。本发明采用TrypLE klect重组酶进行细胞的消化分离，它是一种不含动物来源蛋白的重组细胞消化酶，不含牛及猪来源异种蛋白，可用来消化贴壁细胞如CHO、HEK 293,
等贴壁细胞、是一种能降解细胞表面蛋白的酶，对细胞表面突起蛋白的降解损伤较常用的胰酶弱，购自于美国Gibco公司，目录号为12563-001。本发明的传代方法和现有的传代方法相比，其传代后的细胞活力较后者的细胞活力提高了 5%左右。由于本发明所述制备方法制备的间充质干细胞具有上述优点，故本发明还提供一种由本发明所述制备方法制备的间充质干细胞，其可以应用于再生治疗制品的制备过程中。由以上技术方案可知，本发明所述制备方法优化培养基成分，采用无血清无动物异种蛋白的培养基制备，所制备的间充质干细胞直径较小且能够降低过敏性反应的发生几率，增加了患者再生治疗的安全性；传代培养采用细胞毒性小、成分单一的重组酶，提高了细胞的活力。
图1所示为间充质干细胞CM9、CD73免疫表型检测的流式细胞结果图；图2所示为间充质干细胞⑶105、⑶44免疫表型检测的流式细胞结果图；图3所示为间充质干细胞HLA-ABC、CD45免疫表型检测的流式细胞结果图；图4所示为间充质干细胞HLA-DR、CD31免疫表型检测的流式细胞结果图；图5所示为间充质干细胞CD34免疫表型检测的流式细胞结果图。
具体实施例方式本发明公开了一种间充质干细胞及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。下面结合实施例，进一步阐述本发明。实施例1 利用本发明所述制备方法制备间充质干细胞脐带运送选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的剖宫产脐带，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书。术前准备250ml无菌聚苯乙烯储液瓶作为脐带运送瓶，内装IOOml α MEM培养基(Gibco公司产品)添加1000U肝素钠及100U青霉素/链霉素。10-30cm长脐带装入瓶内，4°C条件下2小时内送到实验室。脐带消化脐带运送到实验室后，使用磷酸盐缓冲液PBS (Gibco公司产品)洗涤2 遍去除血液及羊水。在2级生物安全柜内进行脐带处理。准备一个无菌包内含1把中号手术直剪、1把中号手术直镊、1个直径为IOcm的玻璃培养皿、1个IOOml烧杯。将脐带剪为 2_3cm的脐带段，分别取出脐动脉和脐静脉弃去。脐带段剪成3mmX3mmX5mm小块，转移至 50ml锥形底聚丙乙烯离心管内，以含0. 1 % IV型胶原酶α MEM培养基(Worthington公司) 和MesenCuk -ACF (目录号05420)无血清无动物成分的完全培养基(Stemcell公司) 为消化液，加入25ml置于恒温摇床以37°C、250rpm消化2小时，消化后用3倍与消化液体积的α MEM培养基洗涤3遍去除胶原酶和胶原。细胞培养瓶包板提前1天进行包板。以1 观比例用PBS稀释贴壁基质成分 (Stemcell公司)，T-75cm2培养瓶加入5ml贴壁基质，拧紧瓶盖水平放置室温过夜。次日使用前用IOml移液管吸尽液体成分避免接触细胞贴壁面。无菌灭菌水洗涤1遍，洗净灭菌水，室温静置15min。脐带间充质干细胞原代培养将消化后脐带小块及细胞悬液用 75-150ml MesenCult -ACF (Catalog#05420)无血清无动物成分的完全培养基重悬。悬液转移至贴壁基质成分包被过的T-75cm2培养瓶，置于37°C及5% C02、95%湿度培养箱内培养48小时。培养48小时候可见梭形贴壁细胞，吸尽培养液并用α MEM培养基洗涤1遍， 加入新鲜MesenCult -ACF无血清培养基，此后每2天换液一次。直至梭形贴壁细胞汇聚度达到80% -85%，一般时间为8-12天，即得PO代间充质干细胞。实施例2 间充质干细胞免疫表型检测制备PO代间充质干细胞悬液，调整细胞密度为4X IO5个/ml，每管加入0. 5ml细胞悬液，每管分别加入 PE 标记抗 CD29、CD105、CD73、CD44、HLA-DR、HLA-ABC, CD34、CD45、 CD31单克隆抗体，FC500流式细胞仪检测，结果见图1。由图1可知，本发明制备的间充质干细胞细胞免疫表型完全符合公认的间充质干细胞表型。实施例3 间充质干细胞分化潜能检测1、脂肪细胞分化PO代间充质干细胞按5 X IO3个/cm2细胞密度接种6孔板，诱导分化完全培养基为添加1 μ M地塞米松、500 μ M异丁基甲基黄嘌呤、60 μ M吲哚美辛、5mg/L胰岛素及10%胎牛血清的低糖DMEM培养基。每3天换新诱导分化液一次。诱导培养21天，吸尽培养液，10% 中性甲醛固定1小时，取ImlO. 16%油红0染色20min。吸尽染液，70%乙醇快速洗涤1遍， 加入ImlPBS镜下观察。镜检结果显示，所制备的间充质干细胞能够分化为脂肪细胞。2、成骨细胞分化PO代间充质干细胞按5X IO3个/cm2胞密度接种6孔板，诱导分化完全培养基为添加IOnM地塞米松、5mM β -glycerophosphate、IOnM维生素D3、50mg/L抗坏血酸及10%胎牛血清的低糖DMEM培养基。每3天换新诱导分化液一次。诱导培养21天，进行von Kossa 染色。吸尽培养液，10%中性甲醛固定1小时，取Iml 5%硝酸银室温避光静置20min。吸尽硝酸银，蒸馏水洗涤1遍，紫外灯下照射20min，5 %硫代硫酸钠溶液洗涤1遍，蒸馏水洗涤 1遍镜下观察。镜检结果显示，所制备的间充质干细胞能够分化为骨细胞。
3、软骨细胞分化
PO代间充质干细胞调整为1.6X107个/ml细胞密度，用移液器接无菌黄枪头 10-20 μ 1多点接种6孔板，饱和湿度下37°C培养箱静置孵育20min。静置后缓慢加入诱导分化完全培养基为含添加IOOnM地塞米松、10 μ g/L TGF- β 3及10%胎牛血清的低糖DMEM 培养基。每3天换新诱导分化液一次。诱导培养21天，进行Alcian Blue染色。吸尽诱导分化液，10%中性甲醛固定1小时，取Imll %酸性Alcian Blue室温孵育20min。吸尽染液， 蒸馏水洗涤1遍，镜下观察。镜检结果显示，所制备的间充质干细胞能够分化为软骨细胞。
实施例4 间充质干细胞的细胞直径检测
采用相同来源、质量的脐带，分别利用本发明所述方法和传统方法(加胎牛血清培养)制备间充质干细胞，其他培养条件一致，将各自制备的间充质干细胞制成细胞悬液静置于培养瓶内，采用LEICA或NIKON带相机的高端倒置显微镜下测量，以微米为单位。
结果显示，本发明所述制备方法制备的间充质干细胞的细胞直径介于18-39 μ m， 平均^ym ；利用传统方法制备的间充质干细胞的细胞直径介于20-61 μ m,平均35 μ m。
实施例5 间充质干细胞的小鼠注射试验
将实施例4制备的两种间充质干细胞分别静脉注射到10只20-23克正常雌性 BALB/c小鼠中，注射量为1.5X106个细胞。注射本发明所制备的间充质干细胞的10只小鼠中仅有1只出现呼吸循环衰竭而死亡，而注射传统方法制备的间充质干细胞的10只小鼠中全部出现呼吸循环衰竭而死亡。表明注射本发明所制备的间充质干细胞可减轻静脉注射时微血管阻塞程度，减少注射不良反应，降低再生治疗时的危险。
实施例6 利用PO代传代培养制备间充质干细胞
吸尽培养基，将实施例1制备的PO代间充质干细胞用PBS洗涤1遍并吸尽弃去。培养瓶中加入anl TrypLE klect重组酶(Gibco公司，目录号12563-011)覆盖细胞生长面， 置于37°C培养箱内消化7-lOmin直至贴壁细胞自表面分离。将细胞悬液吸出置于50ml锥形底离心管，加入等体积MesenCult -ACF无血清培养基混勻，300 X g离心Smin去上清， 并与用:3ml PBS洗涤培养瓶1遍后的溶液混合，离心去上清，再次用PBS洗涤去上清后，用 MesenCult -ACF无血清培养基洗涤细胞悬液1遍。T-75cm2培养瓶提前1天包被贴壁基质，按3XIO3个/cm2细胞密度接种间充质干细胞，加入预温至37°C的MesenCult -ACF 无血清培养基，此后每2天换液一次，直至梭形贴壁细胞汇聚度达到80%-85%,即得Pl代间充质干细胞。从Pl代传至P2代可参照此方法。
实施例7 间充质干细胞活力检测
采用实施例1的PO代间充质干细胞，分别采用本发明所述传代培养方法和传统传代培养方法(采用猪胰酶消化分离细胞)，其他培养条件一致，将制备的下一代细胞采用0. 4%台盼蓝染色后镜检，即细胞悬液与等体积0. 4%台盼蓝混合后2分钟后计数， 活细胞有折光性且不染色，死细胞染蓝色，细胞活力=活细胞数+ (活细胞数+死细胞数)X100%。
结果显示，利用本发明传代培养方法制备的下一代间充质干细胞活力介于 94-96%，平均95% ；利用传统传代培养方法制备的下一代间充质干细胞活力介于88-94%， 平均90 %，本发明的细胞活力较传统传代方法高5 %左右。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种间充质干细胞的制备方法，其特征在于，将脐带去除脐动脉和脐静脉后切成小块，用含有0. 1% IV型胶原酶的α MEM培养基以及完全培养基消化，然后将消化后得到的细胞悬液离心，去上清后洗涤，接着用完全培养基重悬，重悬后的悬液转移至由贴壁基质包被过的培养瓶中培养，至出现梭形贴壁细胞时洗涤，并更换新的完全培养基继续培养，培养后的梭形贴壁细胞即为间充质干细胞；所述完全培养基为含有15_25ng/ml FGF、15_25ng/ml PDGF、15_25ng/ml人白蛋白、 15-25ng/ml胰岛素、15_25ng/ml硒酸钠和15_25ng/ml铁蛋白的α MEM培养基；所述含有 0.1% IV型胶原酶的α MEM培养基和完全培养基的体积比为4 1。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述完全培养基为MesenCult-ACF无血清培养基。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述贴壁基质为含有纤连蛋白的贴壁基质。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述贴壁基质为MesenCult贴壁基质。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述消化为在37°C、250rpm下消化2小时。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述培养为在37°C、5%CO2浓度、95% 相对湿度下培养。
7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，还包括传代培养步骤，将权利要求1所述梭形贴壁细胞洗涤，然后用TrypLE Select重组酶消化至梭形贴壁细胞从贴壁基质上分离，将消化后得到的细胞悬液加入完全培养基离心去上清，与洗涤贴壁基质后的溶液混合离心去上清，再次洗涤去上清后用完全培养基重悬，将所得悬液接种于由贴壁基质包被过的培养瓶中，加入完全培养基培养，培养后的梭形贴壁细胞即为下一代间充质干细胞；所述完全培养基、贴壁基质、培养方法同权利要求1。
8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述接种的细胞密度为3X IO3个/cm2。
9.权利要求1至8任意一项所述制备方法制备的间充质干细胞。
10.权利要求9所述间充质干细胞在制备再生治疗制品中的应用。
全文摘要
本发明涉及细胞工程领域，公开了一种间充质干细胞及其制备方法和应用。该方法将脐带去除脐动脉和脐静脉后切成小块，用含有0.1％IV型胶原酶的αMEM培养基以及完全培养基消化，然后将消化后得到的细胞悬液离心，去上清后洗涤，接着用完全培养基重悬，重悬后的悬液转移至由贴壁基质包被过的培养瓶中培养，至出现梭形贴壁细胞时洗涤，并更换新的完全培养基继续培养，培养后的梭形贴壁细胞即为间充质干细胞。本发明所述制备方法采用无血清无异种蛋白的培养基制备和用成分单一的重组酶传代，所制备的间充质干细胞直径较小且无致敏原，提高了细胞的活力，增加了患者再生治疗的安全性。
文档编号C12N5/0775GK102517251SQ20121000890
公开日2012年6月27日 申请日期2012年1月12日 优先权日2012年1月12日
发明者吴德沛, 孙爱宁, 陈广华 申请人:苏州大学附属第一医院