专利名称：一种乙型肝炎病毒基因分型pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒(PCR-荧光探针法)。
背景技术：
乙型肝炎病毒(h印atitis B virus, HBV)是严重危害人类健康的肝炎病毒之一， 是重要的肝脏疾病致病因子。世界上有20亿人感染过HBV，目前全世界慢性HBV感染患者至少有3. 8亿，其中慢性HBV携带者75%分布在东南亚和次撒哈拉地区，而我国就占了 I. 5 亿，其中有2000万人为慢性乙肝患者，每年因此病死亡的人有近50万。估计全球每年有 100-200万人直接死于HBV持续感染。HBV属于嗜肝DNA病毒科，是一种DNA病毒，其基因组由长3. 2kb的部分双链DNA 组成，共有四个开放读码框(Open Readin Frame, ORF) :S、C、P、X,他们编码至少8个不同蛋白表面抗原蛋白，DNA多聚酶蛋白，核心抗原蛋白，X蛋白等。HBV具有病毒复制产量高 (1012—13病毒粒/天)和突变率高(101°-11个点突变/天)的特征，高突变是由于高复制，尤其是由于基因组复制，需先转录为RNA中间体，但聚合酶缺乏校正功能所致。根据HBV全基因核苷酸序列异源性大于8%或S基因区核苷酸序列异源性大于4. 1%，可将HBV分为A、 B、C、D、E、F、G、H8 个基因型。HBV基因型呈一定的地域性分布在世界不同地区基因型分布不同，A型为全世界分布，B型、C型主要分布在亚洲，D型分布在南欧、美、澳大利亚和中东，E型分布在非洲，F 型分布在美洲土著人和波利尼西亚，G型分布在美洲、欧洲，H型在美国发现。目前我国HBV 分布主要以B型和C型为主，兼有少量的A型和D型，在香港、广州等南部地区有少部分D 型分布，另外，华北、新疆地区有A型存在。研究证实，乙肝病毒基因型与乙肝发病机制、转归、抗病毒疗效均有密切关系。不同的基因型其临床感染特点和致病性也不完全相同。因此，对患者血清中HBV-DNA基因型的测定，对于指导临床医生根据不同的基因型及临床表现制定不同的治疗方案和预后判断有着积极的作用。国内外对HBV进行基因分型的方法可分为全基因序列比对和片段基因序列比对两大类。全基因序列比对是以生物系统发生学中的基因同源性为基础的，它主要是通过HBV 全基因序列测定来进行基因分型，另外，也可应用对HBV全基因进行限制性片段长度多态性分析技术(RFLP)。片段基因序列比对是利用HBV中的代表性片段的序列类型来反映全基因序列的类型，主要技术类型有片段基因序列测定、PCR-RFLP、型特异引物(SSP)扩增法和型特异探针(SSO)检测法等。序列测定虽然结果准确可靠，但是由于其技术复杂、实验流程长、实验条件要求高、耗时长和费用昂贵难以作临床常规使用，目前只作为实验室研究使用；RFLP技术相对简单，但是酶切位点易受基因变异影响，且遇混合感染或酶切不完全，会出现复杂条带，影响分型结果判断；应用SSP法进行PCR扩增需要多个扩增管，使用常规的 PCR后产物电泳的方法也容易污染，其灵敏性比特异性探针低；应用SSO法可通过对单管的PCR产物进行检测来分型，因此具有操作相对简单和费用较低等特点，具有实用价值。实时荧光PCR反应是利用热稳定DNA聚合酶5’ 一 3’外切酶活性，在一对特异性引物之外，加入一条和模版互补的基因特异性探针(Taqman探针)，探针上5’端和3’端分别标记了一个报告荧光基团(供体)和一个淬灭荧光基团(受体)，在反应初始(探针完整)时系统激发供体而产生的荧光信号被临近的淬灭基团吸收，所以此时检测不到供体荧光信号；而当PCR反应过程中，随着链的延伸，Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针的结合位置，由于它的5’ 一 3’外切核酸酶活性，将荧光探针切断，释放出报告荧光基团的荧光信号，每合成一条新生链，就有一个报告基团的信号释放，被释放的激离报告荧光基团的数目和PCR产物是一对一的关系。通过荧光PCR仪定时动态监测每一循环，可以得到样品实际扩增曲线，找到PCR扩增的对数期，可以对样本作定性定量检测。突光PCR的优点是反应灵敏、特异性闻具有|旲版序列特异的Taqman探针在引物特异的基础上进一步提高的PCR的专一性；每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，仪器检测的是特异扩增的结果，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性。有多种不同波长的荧光基团对可供选择，使得Taqman探针法可以实现在同一管内检测多重PCR，降低成本也提高效率和准确性避免了荧光染料对PCR反应的影响。
发明内容
本发明的目的充分利用了 Taqman探针技术的优点，针对HBV各基因型设计特异探针，各探针标记不同的荧光染料，在不同波长检测，从而达到分型的目的。本发明技术方案为提供一种乙型肝炎病毒基因分型PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括B/C型PCR反应液和D型PCR反应液； 所述B/C型PCR反应液包括特异性扩增乙型肝炎病毒B和C型基因片段的引物Y1，所述Yl碱基序列如SEQ ID NO 1所示；特异性扩增乙型肝炎病毒B和C型基因片段的的引物Y2，所述Y2碱基序列如SEQ ID NO 2 所示；用于检测乙型肝炎病毒B型基因片段的探针Y5，所述Y5碱基序列如SEQ ID NO 5所示；用于检测乙型肝炎病毒B型基因片段的探针Y6，所述Y6碱基序列如SEQ ID NO 6所示；用于检测乙型肝炎病毒C型基因片段的探针Y7，所述Y7碱基序列如SEQ ID NO 7所示；用于检测乙型肝炎病毒C型基因片段的探针Y8，所述Y8碱基序列如SEQ ID NO 8所示；所述D型PCR反应液包括特异性扩增乙型肝炎病毒D型基因片段的的引物Y3，所述Y3碱基序列如SEQ ID NO 3所示；特异性扩增乙型肝炎病毒D型基因片段的的引物Y4，所述Y4碱基序列如SEQ ID NO 4所示；
用于检测乙型肝炎病毒D型基因片段的探针Y9，所述Y9碱基序列如SEQ ID NO 9所示；所述探针5’端用荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。优选的，所述荧光染料选自FAM、JOE或HEX，所述淬灭荧光染料选自BHQ、Eclipse 或 TAMRA。优选的，所述探针Y5、Y6和Y9的5’端用FAM标记，3’端用TAMRA标记；探针Y7 和Y8的5’端用HEX标记，3’端用TAMRA标记，优选的，所述引物的浓度为IOii M，所述探针的浓度为10iiM。优选的，所述B/C型PCR反应液还包括纯水、10XPCR buffer,25mM MgCl2, 20mM dNTP、Taq 酶、UNG 酶，所述 D 型 PCR 反应液还包括纯水、10XPCR buffer,25mM MgCl2, 20mM dUTP、Taq 酶和 UNG 酶，所述 dNTP 包括 dATP、dUTP、dGTP 和 dCTP。优选的，所述试剂盒包括DNA提取液、阳性参考品、阴性参考品、精密度参考品和灵敏度参考品。本发明的有益效果为本品采用聚合酶链式反应(PCR)结合Taqman荧光探针技术， 检测样品中B、C和D型乙型肝炎病毒，可检测B、C和D型单独感染和混合感染。采用双色探针，FAM波长检测B (或D)型乙型肝炎病毒，HEX波长检测C型乙型肝炎病毒。本品的优点在于一次实验同时检测B、C和D型乙型肝炎病毒，操作简单。试剂盒中使用dUTP和 UNG酶，能够有效消除污染的扩增产物对检测结果的干扰。本发明在大量分析现有已分型的 HBV-DNA序列的基础上，找出HBV基因型的型特异性碱基的分布规律，采取了特异性引物和特异性探针结合的荧光PCR检测方法，既提高了分型灵敏度、准确度，又延续了荧光PCR检测方法的快速简便性能，实现了本项目的目的。
图I.阳性参考品P1-P7的PCR扩增曲线；图2.阴性参考品N1-N3的PCR扩增曲线；图3.精密度参考品Pl重复10次的PCR扩增曲线；图4.灵敏度参考品S-I到S-6的PCR扩增曲线。
具体实施例方式实时荧光PCR是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质。随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。实时荧光PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。原材料的选取和制备一、找出HBV基因型的各型特异性碱基分布规律，根据HBV各型特异序列，设计引物和探针。I、引物乙型肝炎病毒(HBV)基因结构包括4个部分重叠的开放读码框(ORF)，即前S/S区、前C/C区、P区和X区，其中S区基因差异是HBV基因分型的依据，而P区则集中了核苷类似物耐药基因突变位点，S区短于P区并与之完全重叠。据此，查阅GenBank数据库中已经登录的HBV基因组全序列，其中B、C、D基因型HBV序列均在30例以上，进行比对分析设计引物。引物扩增片段必须包括HBV-B、C、D基因型区别位点。引物(Y1、Y2)可同时扩增HBV B/C型基因片段，引物(Υ3、Υ4)可扩增HBV D型基因片段。引物序列如表一(注 碱基简并Y = C/To )所示。表 I
权利要求
1.一种乙型肝炎病毒基因分型PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括B/C型 PCR反应液和D型PCR反应液；所述B/C型PCR反应液包括特异性扩增乙型肝炎病毒B和C型基因片段的引物Y1，所述Yl碱基序列如SEQ ID NO: I所示；特异性扩增乙型肝炎病毒B和C型基因片段的的引物Y2，所述Y2碱基序列如SEQ ID NO 2所示；用于检测乙型肝炎病毒B型基因片段的探针Y5，所述Y5碱基序列如SEQ ID NO :5所示；用于检测乙型肝炎病毒B型基因片段的探针Y6，所述Y6碱基序列如SEQ ID NO :6所示；用于检测乙型肝炎病毒C型基因片段的探针Y7，所述Y7碱基序列如SEQ ID NO :7所示；用于检测乙型肝炎病毒C型基因片段的探针Y8，所述Y8碱基序列如SEQ ID NO :8所示；所述D型PCR反应液包括特异性扩增乙型肝炎病毒D型基因片段的的引物Y3，所述Y3碱基序列如SEQ ID NO 3所示；特异性扩增乙型肝炎病毒D型基因片段的的引物Y4，所述Y4碱基序列如SEQ ID NO 4所示；用于检测乙型肝炎病毒D型基因片段的探针Y9，所述Y9碱基序列如SEQ ID NO :9所示；所述探针5’端用荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。
2.根据权利要求I所述的乙型肝炎病毒基因分型PCR检测试剂盒，其特征在于，所述荧光染料选自FAM、JOE或HEX，所述淬灭荧光染料选自BHQ、Eclipse或TAMRA。
3.根据权利要求I所述的基因分型PCR检测试剂盒，其特征在于，探针Y5、Y6和Υ9的 5’端用FAM标记，3’端用TAMRA标记；探针Υ7和Υ8的5’端用HEX标记，3’端用TAMRA标记。
4.按权利要求I所述的乙型肝炎病毒基因分型PCR检测试剂盒，其特征在于，所述引物的浓度为10 μ Μ,所述探针的浓度为10 μ M0
5.按权利要求I所述的乙型肝炎病毒基因分型PCR检测试剂盒，其特征在于，所述B/ C 型 PCR 反应液还包括纯水、10 XPCR buffer,25mMMgCl2,20mM dNTP、Taq 酶和 UNG 酶，所述 dNTP 包括 dATP、dUTP、dGTP 和 dCTP。
6.按权利要求I所述的乙型肝炎病毒基因分型PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括DNA提取液、阳性参考品、阴性参考品、精密度参考品和灵敏度参考品。
全文摘要
本发明的目的充分利用了Taqman探针技术的优点，针对HBV各基因型设计特异探针，各探针标记不同的荧光染料，在不同波长检测，从而达到分型的目的。本发明试剂盒针对HBV各基因型设计引物和特异探针，检测样品中B、C和D型乙型肝炎病毒，可检测B、C和D型单独感染和混合感染。采用双色探针，FAM波长检测B(或D)型乙型肝炎病毒，HEX波长检测C型乙型肝炎病毒。本试剂盒的优点在于一次实验同时检测B、C和D型乙型肝炎病毒，操作简单，试剂盒中使用dUTP和UNG酶，能够有效消除污染的扩增产物对检测结果的干扰。
文档编号C12Q1/70GK102586473SQ20121000956
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月12日 优先权日2012年1月12日
发明者阳卫超, 陈宁 申请人:泰普生物科学(中国)有限公司