专利名称：一种基因修饰的间充质干细胞在肺纤维化治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和基因治疗领域，具体为基因修饰间充质干细胞在肺纤维化治疗中的应用。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)在体内外可以诱导分化为多种细胞，可以改善多种损伤组织的结构与功能。MSC在多种肺脏损伤疾病中(包括肺纤维化)都体现出了其治疗潜能。在药物诱导的动物肺损伤模型中，通过血循环应用骨髓MSC能有效减轻肺脏损伤和纤维化。同时，MSC的以下特点使其在肺损伤引起的肺纤维化治疗中具有独特的优势:(I)无移植排斥反应:MSC属于免疫赦免细胞；(2)MSC可归巢至受损伤的肺脏局部，且可在刺激因子的作用下获得肺泡上皮细胞的表型；(3)调节炎性反应:MSC通过其免疫抑制功能(抑制免疫细胞如树突状细胞、T淋巴细胞、NK细胞等的激活)和改变细胞因子在疾病炎性过程中的表达谱(如抑制TNF-a、IL-1 β、IL_6等多种炎性细胞因子基因及蛋白的表达；抗炎 性细胞因子IL-10、IL-4等分泌增多)来发挥其抗炎作用；(4)抗凋亡:通过释放细胞因子发挥其抗凋亡作用；(5)促血管生成:通过释放血管内皮细胞生长因子(vascular en dothelial cell growth factor, VEGF),肝细胞生长因子(hepatocytegr owth factor,HGF),膜岛素样生长因子(insulin like growth factor, I GF-1)等来发挥其促进血管生成作用；(6)抑制纤维化相关基因和蛋白的表达:包括I型和III型胶原、基质金属蛋白酶(matrix metalloprotei nase,MMP-l)和金属蛋白酶组织抑制剂(tissueinhibitor of metal1pr oteinase, TIMP-1)等。肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor, HGF)是一种多功能的生长因子,它在体内参与并主导促血管生成、抑制纤维化、抑制细胞凋亡和抗炎等病理生理学过程，在肺脏修复过程中具有以下几方面的生理作用:(I)促进肺泡上皮细胞的增殖、迁移和形态发生而利于肺泡修复；(2)抑制炎症因子的表达:如可溶性细胞间粘附分子-1 (sICAM-1)等；
(3)抑制细胞凋亡:通过激活PI3K/Akt信号途径、SPK-SlP信号途径等来发挥其抗凋亡作用；(4)抑制纤维化效应:通过抑制促纤维化因子TGF-β的生成及其诱导的信号转导:激活 β-catenin 和 ρ42/ρ44ΜΑΡΚ 信号途径,诱导环加氧酶-2 (Cyclooxygenase-2, C0X-2)表达，进一步促进前列腺素E2 (Prostaglandin E2,PGE2)的产生来发挥抗纤维化作用；(5)促进血管生成:通过促进血管内皮细胞增殖及血管生成增加血液灌流,改善局部的血液供应与低氧发生。而近期研究报道，HGF重组蛋白可以预防缺血再灌注导致的肺脏损伤；肺泡管HGF基因高表达可以抑制博莱霉素导致的肺纤维化，表明HGF是防治肺损伤及其引起的纤维化的理想的细胞生长因子。MSC和HGF均是防治肺损伤和纤维化的理想措施和手段。但是，它们的应用均存在局限性。MSC植入体内后脱离了特殊的培养环境，通过微循环渗透方式摄取营养，而营养所及范围在100-200 μ m之间。因此，90%以上的细胞在植入的几天内因营养缺乏而很快死亡，细胞并不能很好发挥其抗炎、抗凋亡、促增殖等功能。而重组HGF结构复杂，体内代谢快，为了获得HGF在损伤肺部的高浓度就需要持续大剂量给予重组蛋白。因此，采用基因治疗策略，用携带HGF的重组腺病毒修饰MSC治疗肺损伤及其引起的肺纤维化，具有干细胞治疗和细胞生长因子治疗的双重优势，并发挥协同作用。一方面通过血液循环移植，间充质干细胞最初大部分蓄留或归巢于损伤的肺脏，在发挥干细胞修复作用的同时，使局部高表达HGF,同时发挥HGF的生物学作用；而高表达HGF又可以促进骨髓MSC的存活、增殖以及内源性MSC的迁移和归巢，从而加强MSC的治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供HGF基因修饰的间充质干细胞的新用途，即在肺损伤及其纤维化中的新应用。本发明实现上述目的的技术方案是HGF修饰的间充质干细胞在放射性肺损伤及纤维化治疗中的应用。本发明所属的HGF为人肝细胞生长因子，其基因序列记载于Miyaz awa K，Tsubouchi H， Naka D， et al.molecular cloning and sequence analysis of cDNAfor human hepatocyte growth fator.Biochem.Biop hys.Res.Commun.1989,163 (2):967-973.;所述的间充质干细胞为骨髓或脐带来源间充质干细胞。本发明所述的HGF修饰的间充质干细胞制备方法为:(I)采用细胞内质粒DNA同源重组法制备重组腺病毒Ad-HGF:将人HGF基因克隆到穿梭质粒pXCJLl-cmv/pA的多克隆位点；然后与腺病毒载体GT4050通过脂质体共转染HEK293细胞，使其进行细胞内同源重组，于HEK293细胞包装获得重组腺病毒Ad_HGF。(2)扩增Ad-HGF，并采用CsCl密度梯`度离心进行纯化和滴度测定；(3)分离、纯化骨髓或者脐带MSC，体外培养至第3代，Ad-HGF以150感染复数(MOI)的强度感染第3代MSC。本发明获得的HGF修饰的MSC，分别采用ELISA检测HGF的表达；流式细胞术检测表面分子；Dy670染料法检测细胞增殖；缺氧模型检测细胞抗凋亡性能。本发明采用HGF修饰的MSC干预放射性肺损伤及纤维化的方法是，于Y射线照射后Ih内尾静脉注射HGF修饰的MSC。HGF修饰的MSC可以归巢到损伤肺脏的局部，并表达HGF。HGF不但能够发挥抗炎、抑纤维化、促肺泡上皮细胞增殖等生物学效应，还能促进移植的MSC细胞的存活和增殖，同时诱导内源性HGF的大量表达，并趋化内源性MSC聚集到损伤部位；而130则能够发挥其免疫调节作用，减轻损伤局部的炎症，包括抑制炎症因子和促纤维化因子的分泌等。在HGF和MSC的联合作用下，可有效减轻肺脏损伤，抑制胶原纤维的沉积，从而达到治疗目的。
附图1穿梭质粒pXCJLl-cmv/pA-HGF构建图。附图2Real-time PCR检测MSC治疗后肺脏局部人HGF的表达:MSCs_Null为Ad-Null修饰的MSC治疗组;MSCs-HGF为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。附图3流式细胞检测MSC细胞的表面分子:MSCs-Null为Ad-Null修饰的MSC ；MSCs-HGF为Ad-HGF修饰的MSC ；conrol为不标抗体的阴性对照。
附图4Dy670染色法检测MSC细胞的增殖能力:control为Dye670处理MSC细胞后即刻检测结果；MSCs-HGF 48h为感染Ad-HGF后48h检测结果；MSCs_HGF 96h为感染Ad-HGF后96h检测结果；MSCs-Null 48h为感染Ad-Null后48h检测结果；MSCs_Null 96h为感染Ad-Null后96h检测结果。附图5HGF对MSC细胞凋亡的作用:1为常氧培养的MSC对照；2为低氧培养的Ad-Null感染的MSC细胞；3为低氧培养的Ad-HGF感染的MSC细胞。附图6C57小鼠放射性肺损伤动物模型建立:A为正常对照的HE染色；B为照射后28天的HE染色；C为照射后6个月的HE染色；D为照射后6个月的天狼猩红染色。附图7ELISA测定肺灌洗液中总蛋白、白蛋白和IgM(l个月):A为总蛋白；B为白蛋白；(:为 IgM。radiation 为 PBS 治疗组；MSCs_Null 为 Ad-Null 修饰的 MSC 治疗组；MSCs_HGF为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。附图8ELISA测定血清中TNF-α表达结果:radiation为PBS治疗组；MSCs_Null为Ad-Null修饰的MSC治疗组;MSCs-HGF为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。附图9Real_time PCR检测MSC治疗I个月后肺脏局部TNF- α表达结果:MSCs-NulI为Ad-Null修饰的MSC治疗组；MSCs_HGF为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。附图10ELISA测定血清中ICAM表达结果:radiation为PBS治疗组；MSCs_Null为Ad-Null修饰的MSC治疗组；MSCs-HGF为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。附图1lMSC治疗后肺脏局部colIal的表达:control为正常对照；radiation为PBS治疗组；MSCs-Null为Ad-Null修饰的MSC治疗组；MSCs_HGF为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。附图12MSC治疗后肺脏局部col3al的表达:control为正常对照；radiation为PBS治疗组；MSCs-Null为Ad-Null修饰的MSC治疗组；MSCs_HGF为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。附图13ELISA检测小鼠血清中TGF-β的表达结果:radiation为PBS治疗组；MSCs-NulI为Ad-Null修饰的MSC治疗组；MSCs_HGF为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。附图14Real-time PCR检测MSC治疗I个月后肺脏局部TGF-β的表达结果:MSCs-NulI为Ad-Null修饰的MSC治疗组；MSCs_HGF为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。附图15HGF对照射诱导的肺泡上皮细胞凋亡的保护作用(治疗后14天):A为正常对照为PBS治疗组；C为Ad-Null修饰的MSC治疗组；D为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。附图16Real_time PCR检测肺脏局部内源性HGF表达的结果:Non-radiation为正常对照；radiation为PBS治疗组；MSCs_Null为Ad-Null修饰的MSC治疗组；MSCs_HGF为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。附图17免疫组化检测肺脏局部c-met表达的结果:A为PBS治疗28天；B为PBS治疗6个月；C为Ad-Null修饰的MSC治疗28天；D为Ad-Null修饰的MSC治疗6个月；E为Ad-HGF修饰的MSC治疗28天；B为Ad-HGF修饰的MSC治疗6个月。附图18Real_time PCR检 测肺脏局部c_met表达的结果:Non_radiation为正常对照；radiation 为 PBS 治疗组；MSCs_Null 为 Ad-Null 修饰的 MSC 治疗组；MSCs_HGF 为 Ad-HGF修饰的MSC治疗组。附图19Real-time PCR检测肺脏局部的SlP受体表达的结果:A为SlP受体I出为SlP 受体 3 ;C 为 SlP 受体 5。radiation 为 PBS 治疗组;MSCs_Null 为 Ad-Null 修饰的 MSC治疗组；MSCs-HGF为Ad-HGF修饰的MSC治疗组。28days为治疗后28天；6months为治疗后6个月。
具体实施例方式实施例1重组腺病毒-肝细胞生长因子(Ad-HGF)的制备和纯化其方法是目的基因将人HGF基因克隆到穿梭质粒pXCJLl-cmv/pA的多克隆位点，获得pXCJLl-cmv/pA-HGF ;然后与腺病毒载体GT4050通过脂质体共转染HEK293细胞，使其进行细胞内同源重组，于HEK293细胞包装获得重组腺病毒Ad-HGF。基因组水平鉴定正确后，进行扩增、纯化和滴度测定。(I)穿梭质粒 pXCJLl-cmv-HGF 的构建:首先用PCR方法从人胎盘cDNA文库中扩增肝细胞生长因子cDNA，将PCR产物克隆至pBluescript SK(pSK)载体的BamHI和Sail酶切位点中，命名为pSK_HGF。以限制性内切酶Apa I酶切质粒pBLUESCRIPTSK-HGF后，用DNA聚合酶Klenow大片段将该端补平，然后再用Not I酶切，回收大小约2.2kb的DNA片段(HGF cDNA);将HGF cDNA克隆至pXCJLl-CMV/PA载体的Hind III和Not I位点之间，从而获得携带人肝细胞生长因子基因表达盒以及腺病毒基因组左端序列的穿梭质粒pXCJLl-CMV/pA-HGF(如附图1)。根据pXCJLl_CMV/pA的酶切图谱和结构图谱，结合pXCJLl-CMV/pA-HGF的构建过程，用Hind III和Sal I双酶切pXCJLl-CMV/PA-HGF，0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，进行鉴定。(2)重组腺病毒Ad-HGF的制备、纯化和滴度测定通过脂质体介导的方法使鉴定正确的穿梭质粒pXCJLl-CMV/HGF/P和腺病毒质粒GT4050共转染293细胞，使其进行细胞内同源重组，产生重组腺病毒。普通显微镜观察细胞形态改变，9天可见噬斑形成，并逐渐扩大，直至12d出现完全病变。收集细胞和上清，反复冻溶3次后收集上清，获得重组腺病毒Ad-HGF。采用Hirt法提取病毒基因组DNA，并经PCR鉴定正确。经大量扩增后，采用氯化铯密度梯度离心纯化，并保存于10%甘油的Hank’s液中备用。紫外分光光度计法(波长260nm)和有限稀释法(Median Tissue CultureInfective Dose，TCID50)分别测定辅助腺病毒 Ad5/Fllp_HV 的颗粒滴度(Viral ParticleUnits per Milliliter, vp/ml),纯度(0D260nm/280nm)和感染滴度(Infection Units perMilliliter, IU/ml)。结果如表 I 所示。表I重组腺病毒Ad-HGF的纯度和滴度测定结果
权利要求
1.HGF基因修饰的间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)在肺损伤及纤维化治疗中的应用；
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，治疗肺损伤及纤维化的MSC来源于脐带或骨髓，并通过感染150M0I的重组腺病毒获得HGF修饰的MSC ；
3.根据权利要求2所述的肺损伤及纤维化，包括放射性肺损伤、矽肺、尘肺等多种急、慢性肺损伤 。
全文摘要
一种基因修饰的间充质干细胞在肺纤维化治疗中的应用，涉及生物技术和基因治疗领域，包括骨髓或脐带来源的间充质干细胞(mesenchy mal stem cell，MSC)的体外分离培养和扩增，重组腺病毒Ad-HGF介导肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)体外修饰MSC。基因修饰的MSC移植C57小鼠，干预放射所致肺损伤和纤维化，其可减少肺泡腔多种蛋白的渗出，包括白蛋白、IgM等；可减轻肺脏局部炎症反应，并抑制TNF-α和可溶性ICAM-1等多种因子表达；可抑制促纤维化因子TGF-β、胶原蛋白基因col1α1和col 3α1的表达，减少肺组织胶原纤维的沉积。内源性HGF和及其受体cmet表达的结果，表明可诱导内源性HGF表达和内源性MSC归巢到损伤部位。因此，采用HGF修饰的MSC治疗多种病因引起的肺损伤及其纤维化意义重大。
文档编号C12N5/10GK103203025SQ20121000981
公开日2013年7月17日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者王 华, 王立生, 吴祖泽, 杨月峰, 肖凤君, 段海峰, 李庆芳, 张群伟 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所