专利名称：一种玉米醇溶蛋白基因RNAi载体的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，特别涉及一种适合单子叶植物遗传转化的含植物GUS基因内含子的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体。
背景技术：
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是研究生物发育和基因功能的一种重要工具， 是通过引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA (有义RNA和反义RNA)，从而诱导内源靶基因的mRNA降解，进而抑制其相应的基因表达。RNAi具有特异性、稳定性、效率高、速度快及不改变基因组的遗传组成等优点，为植物功能基因组学研究以及植物遗传改良提供了一个强有力的手段。目前，RNA干扰技术已应用于油脂和淀粉品质改良、营养成分增加与有害物质降低及抗褐化、果实耐贮性等作物品质改良研究，其中构建一种能成功转化并能达到改良目的靶基因的RNAi载体是其核心技术。我国是一个农业大国，粮食安全始终是关系我国国民经济发展、社会稳定和国家自立的全局性重大战略问题。玉米作为我国第二大作物，不仅是重要的粮食来源，而且还是重要的饲料、工业原料，玉米生产状况在粮食安全体系中具有举足轻重的作用。在我国以玉米为支柱产业的饲料工业中，由于玉米籽粒的赖氨酸含量低，在配、混合饲料中必须添加饲料添加剂赖氨酸，才能满足畜禽生长发育的需要，但这些饲料添加剂目前主要依靠进口，因此饲料品质不高特别是赖氨酸含量偏低是目前我国畜牧业发展的主要限制因素之一。另一方面，我国部分省份特别是贫困山区的人群仍以玉米为主食，其营养物质主要依赖于玉米， 但目前生产上种植的玉米大多是普通玉米，营养品质较差，缺乏人体及单胃动物生长发育必需的赖氨酸、色氨酸等。玉米籽粒的蛋白质含量为10%左右，其中50-60%为人畜不能吸收利用的醇溶蛋白。国际玉米小麦改良中心(CIMMYT)在20世纪70年代开始利用隐性突变基因Opaqiw-2 (oJ )及其修饰基因将醇溶蛋白含量由55. 1%降至22. 9%，使赖氨酸含量水平达普通玉米的 2倍，进而选育了大批高赖氨酸玉米即优质蛋白玉米并在全世界广泛应用(谭静等.优质蛋白玉米育种研究进展.玉米科学2006，14 : 15-19)，但该方法转育周期长(7-10年)、效率低、预见性差，加之选育出的高赖氨酸玉米胚乳呈软质及抗病性差等问题，已越来越不适应现代育种目标的需要。研究表明，由于醇溶蛋白特别是22-kD和19-kD醇溶蛋白基因的表达对赖氨酸含量有显著的负面效应，然而传统的育种方法难于找到理想的优质种质，获得赖氨酸含量高而醇溶蛋白低表达的玉米品种难度很大，主要原因在于其表型鉴定即赖氨酸含量测定需要使用高压液相色谱(HPLC)进行分析，由于HPLC运行成本很高，很难在大规模种质筛选及新品种选育过程中的大批量后代选择中广泛应用。因此，如果能通过RNA干扰技术，构建RNAi载体并转化获得赖氨酸含量高而醇溶蛋白低表达的转基因玉米，将是一种简便，快捷和有效的途径
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术(利用OJ 基因及其修饰基因转育获得醇溶蛋白含量低而赖氨酸含量高的玉米品种)转育周期长、效率低、预见性差，以及用现有技术选育出的高赖氨酸玉米品种由于oJ 基因的连锁效应导致其籽粒呈软质胚乳及抗病性差等缺陷和不足，其目的是提供一种能抑制玉米醇溶蛋白的表达，提高赖氨酸含量水平的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体。本发明提供了两个玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD和 pUC19-RNAi-19KD，将两个载体分别导入玉米品种中，成功获得了高赖氨酸含量的玉米转基因植株，在所有转基因植株中，有40-50%的植株其赖氨酸含量得到了提高，与非转基因玉米植株相比，转基因玉米的籽粒赖氨酸含量提高了 15-60%，与现有常规育种技术培育的高赖氨酸玉米品种相比，赖氨酸含量有同等水平的提高或稍高于常规育种技术培育的高赖氨酸玉米，并且与常规育种(5-7年)相比，转育周期显著缩短，只需1-2年。此外本发明通过 RNA干扰技术调节玉米醇溶蛋白的合成，解决了常规育种中利用oJ 基因选育的高赖氨酸玉米品种胚乳呈软质及抗病性差等关键问题。本发明实现了利用RNA干扰原理创制高赖氨酸含量玉米新材料的目的，对玉米品质改良具有重要意义。本发明RNAi载体的获得一方面，通过在构建的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体上加入GUS基因内含子，提高了 RNAi载体的沉默效率；另一方面，比常规RNAi载体的获得缩短了载体构建的时间，提高了效率。常规RNAi载体的构建方法是按启动子、正向目的片段、一段不表达序列、反向目的片段、终止子poly (A)的顺序逐一连接到骨架载体上，本发明RNAi载体的构建将启动子和正向目的片段、反向目的片段和终止子Poly(A)分别连接在骨架载体PUC19上，然后再将两个载体进行酶切和连接，进而将反向目的片段和终止子poly (A)插入到含有启动子和正向目的片段的重组载体上。由于两个中间载体可同时构建，因此缩短了载体构建的时间，提高了效率。本发明所提供的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD是在骨架载体 PUC19上含有胚乳特异表达启动子P-zp22/6，胚乳特异表达启动子P_zp22/6位于所述的 RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的酶切位点&ic I和Sma I间；正向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P位于所述的RNAi载体pUC19_RNAi_22KD的酶切位点Sma I和 Xba I间；反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P位于所述的RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的酶切位点Xba I和Xho I间；在正向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P和反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P之间含有⑶S基因内含子，⑶S基因内含子位于所述的RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的)(ba I 酶切位点间；终止子poly(A)位于所述的RNAi载体pUC19_RNAi_22KD酶切位点Hind III和 Xho I间；所述的胚乳特异表达启动子P-zp22/6的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，所述 22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示，所述⑶S 基因内含子的核苷酸序列如SEQ ID NO: 14所示，所述终止子poly(A)的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示，所述玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19_RNAi_22KD的核苷酸序列如SEQ ID NO: 15所示。所构建的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的图谱如图8所示。上述玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi_22KD还可以按以下方法构建获得
(1)构建含有胚乳特异性表达启动子P-ZP22/6的重组载体pUC19-p22/6
①胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的获得以玉米品种的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示序列的特异启动子P引物对进行PCR扩增，得到如SEQ ID N0:3所示序列的胚乳特异性表达启动子 P-zp22/6 ；
②构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6
用he I和)(ba I酶切步骤(1)①得到的带有相应酶切位点的胚乳特异性表达启动子， 然后与同样经Mc I和)(ba I酶切的骨架载体pUC19连接，得到含有胚乳特异性表达启动子 P-zp22/6 的重组载体 pUC19-p22/6 ；
(2)构建插入正向目的片段22-KD-P和胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体 pUC19-p22/6-22KDl
①22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的获得
以玉米籽粒总RNA为模板，以SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:5所示序列的R22-6引物对， 进行RT-PCR扩增，然后以此RT-PCR产物为模板，以SEQ ID NO:6和SEQ ID NO: 7所示序列的R22-7引物对，再进行RT-PCR，得到如SEQ ID NO: 8所示的22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA 片段 22-KD-P ；
②构建插入正向目的片段22-KD-P和胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体 pUC19-p22/6-22KDl
用Sma I和)(ba I双酶切步骤(2)①得到的带有相应酶切位点的目的片段22-KD-P，然后与同样经Sma I和)(ba I双酶切的步骤(1)②构建的重组载体pUC19-p22/6连接，得到插入了正向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P和胚乳特异性表达启动子 P-zp22/6 的重组载体 pUC19-p22/6-22KDl ；
(3)构建插入反向目的片段22-KD-P的重组载体pUC19-22KD2
用Hind III和)(ba I酶切步骤(2)①得到的带有相应酶切位点的目的片段22-KD-P，然后与同样经Hind III和Xba I酶切的pUC19载体连接，得到插入反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的重组载体pUC19_22KD2 ；
(4)构建含有终止子poly(A)的重组载体pUC19-22KD2-poly(A)
以表达载体P3301 DNA为模板，用SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10所示序列的终止子 poly(A)的上下游引物进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO: 11所示序列的终止子poly (A)；进一步用Bio I和Hind III双酶切带有相应酶切位点的终止子poly (A)，然后与同样经B10 I 和Hind III双酶切的步骤(3)得到的重组载体pUC19-22KD2连接，得到含有终止子poly (A) 的重组载体 pUC19-22KD2-poly (A)；
(5)构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6，正、反向目的片段22-KD-P和终止子 poly (A)的重组载体 pUC19-p22/6-22KDl-22KD2-poly (A)
将步骤(2)构建的重组载体pUC19-p22/6-22KDl和步骤(4)构建的重组载体 pUC19-22KD2-poly (A)分别用)(ba I和Hind III双酶切，然后将含有反向目的片段 22-KD-P和终止子poly㈧的酶切产物22KD2_poly㈧连接到步骤(2)构建的重组载体pUC19-p22/6-22KDl上，得到含有胚乳特异性表达启动子P_zp22/6，正、反向目的基因 22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P和终止子poly (A)的重组载体pUC19-p22/6_2 2KDl-22KD2-poly(A)；
(6)⑶S基因内含子的连接和玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的构建以质粒载体pGreen-0229 Backbone DNA为模板，用 SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13所示序列的⑶S基因内含子的上下游引物进行PCR扩增，得到如SEQ ID N0:14所示的⑶S基因内含子；进一步用)(ba I单酶切带有相应酶切位点的GUS基因内含子，然后与同样经)(ba I 单酶切后磷酸化处理的步骤(5)构建的重组载体pUC19-p22/6-22KDl-22KD2-poly(A)连接，得到所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD，玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的核苷酸序列如SEQ ID NO: 15所示。本发明所提供的另一个玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi_19KD是在骨架载体PUC19上含有胚乳特异表达启动子P-zp22/6，胚乳特异表达启动子P-zp22/6位于所述的RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的酶切位点Mc I和Sma I间；正向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P位于所述的RNAi载体pUC19_RNAi_19KD的酶切位点Sma I 和)(ba I间；反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P位于所述的RNAi 载体pUC19-RNAi-19KD的酶切位点)(ba I和Β ο I间；在正向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P和反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P之间含有⑶S基因内含子，⑶S基因内含子位于所述的RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的)(ba I 酶切位点间；终止子poly(A)位于所述的RNAi载体pUC19_RNAi_19KD酶切位点Hind III和 Xho I间；所述胚乳特异表达启动子zp22/6的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示，所述19-KD 醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的核苷酸序列如SEQ ID N0:20所示，所述⑶S基因内含子的核苷酸序列如SEQ ID N0:14所示，所述终止子poly(A)的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示，所述玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的核苷酸序列如SEQ ID N0:21所示。所构建的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的图谱如图9所示。本发明所提供的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD还可以按以下方法构建获得
(1)构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6
①胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的获得
以玉米品种的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示序列的特异启动子P引物对进行PCR扩增，得到如SEQ ID N0:3所示序列的胚乳特异性表达启动子 P-zp22/6 ；
②构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6序列的重组载体pUC19-p22/6
用I和)(ba I酶切步骤(1)①得到的带有相应酶切位点的胚乳特异性表达启动子， 然后与同样经Mc I和)(ba I酶切的骨架载体pUC19连接，得到含有胚乳特异性表达启动子 P-zp22/6 的重组载体 pUC19-p22/6 ；
(2)构建插入正向目的片段19-KD-P和胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体 pUC19-p22/6-19KDl
①19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的获得
以玉米籽粒总RNA为模板，以SEQ ID N0:16和SEQ ID N0:17所示序列的R19-4引物对，进行RT-PCR扩增，然后以此RT-PCR产物为模板，以SEQ ID N0:18和SEQ ID N0:19所示序列的R19-5引物对，再进行RT-PCR，得到如SEQ ID N0:20所示序列的19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P ；
②构建插入正向目的片段19-KD-P和胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6-19KDl
用Sma I和)(ba I双酶切步骤(2)①得到的带有相应酶切位点的目的片段19-KD-P，然后与同样经Sma I和)(ba I双酶切的步骤(1)②构建的重组载体pUC19-p22/6连接，得到插入了正向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P和胚乳特异性表达启动子 P-zp22/6 的重组载体 pUC19-p22/6-19KDl ；
(3)构建插入反向目的片段19-KD-P的重组载体pUC19-19KD2
用Hind III和)(ba I酶切步骤(2)①得到的带有相应酶切位点的目的片段19-KD-P，然后与同样经Hind III和Xba I酶切的pUC19载体连接，得到插入反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的重组载体pUC19_19KD2 ；
(4)构建含有终止子poly(A)的重组载体pUC19-19KD2-poly(A)
以表达载体P3301 DNA为模板，用SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10所示的终止子poly (A) 的上下游引物进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO: 11所示的终止子poly (A)；进一步用Bio I 和Hind III双酶切带有相应酶切位点的终止子poly (A)，然后与同样经Bio I和Hind III双酶切的步骤(3)得到的重组载体PUC19-19KD2连接，得到含有终止子poly (A)的重组载体 pUC19-19KD2-poly(A)；
(5)构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6，正、反向目的片段19-KD-P和终止子 poly (A)的重组载体 pUC19-p22/6-19KDl-19KD2-poly (A)
将步骤(2)构建的重组载体pUC19-p22/6-19KD和步骤(4)构建的重组载体 pUC19-19KD2-poly (A)分别用)(ba I和Hind III双酶切，然后将含有反向目的片段 19-KD-P和终止子poly㈧的酶切产物19KD2_poly㈧连接到步骤(2)构建的重组载体pUC19-p22/6-19KDl上，得到含有胚乳特异性表达启动子P_zp22/6，正、反向目的基因 19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P和终止子poly (A)的重组载体pUC19-p22/6_l 9KDl-19KD2-poly(A)；
(6)⑶S基因内含子的连接和玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的构建以质粒载体 pGreen-0229 Backbone DNA 为模板，用 SEQ ID N0:12 和 SEQ ID
N0:13所示序列的⑶S基因内含子的上下游引物进行PCR扩增，得到如SEQ ID N0:14 所示序列的GUS基因内含子；进一步用)(ba I单酶切带有相应酶切位点的GUS基因内含子，然后与同样经)(ba I单酶切后磷酸化处理的步骤(5)构建的重组载体 pUC19-p22/6-19KDl-19KD2-poly (A)连接，得到所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体 pUC19-RNAi-19KD，玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19_RNAi_19KD的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID N0:21 所示。序列表中SEQ ID N0:1所示的是本发明所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体 pUC19-RNAi-22KD或RNAi载体pUC19_RNAi_19KD的特异启动子ρ引物的上游引物序列。序列表中SEQ ID Ν0:2所示的是本发明所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体 pUC19-RNAi-22KD或RNAi载体pUC19_RNAi_19KD的特异启动子ρ引物的下游引物序列。序列表中SEQ ID Ν0:3所示的是胚乳特异性表达启动子Ρ-ζρ22/6的核苷酸序列。序列表中SEQ ID Ν0:4所示的是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的 R22-6引物的上游引物序列。序列表中SEQ ID N0:5所示的是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的R22-6引物的下游引物序列。序列表中SEQ ID N0:6所示的是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的 R22-7引物的上游引物序列。序列表中SEQ ID N0:7所示的是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的 R22-7引物的下游引物序列。序列表中SEQ ID N0:8所示的是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的核苷酸序列。序列表中SEQ ID NO:9所示的是终止子poly (A)的上游引物序列。序列表中SEQ ID NO: 10所示的是终止子poly (A)下游引物序列。序列表中SEQ ID NO: 11所示的是终止子poly (A)的核苷酸序列。序列表中SEQ ID N0:12所示的是⑶S基因内含子的上游引物序列。序列表中SEQ ID N0:13所示的是⑶S基因内含子的下游引物序列。序列表中SEQ ID N0:14所示的是⑶S基因内含子的核苷酸序列。序列表中SEQ ID N0:15所示的是本发明所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体 pUC19-RNAi-22KD的核苷酸序列。序列表中SEQ ID N0:16所示的是19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的 R19-4引物的上游引物序列。序列表中SEQ ID N0:17所示的是19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的 R19-4引物的下游引物序列。序列表中SEQ ID N0:18所示的是19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的 R19-5引物的上游引物序列。序列表中SEQ ID N0:19所示的是19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的 R19-5引物的下游引物序列。序列表中SEQ ID N0:20所示的是19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的核苷酸序列。序列表中SEQ ID N0:21所示的是本发明所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体 pUC19-RNAi-19KD的核苷酸序列。序列表中SEQ ID N0:22所示的是RNAi载体pUC19_RNAi_22KD转化Ttl代再生植株的PCR检测22TO引物的上游引物序列。序列表中SEQ ID N0:23所示的是RNAi载体pUC19_RNAi_22KD转化Ttl代再生植株的PCR检测22TO引物的下游引物序列。序列表中SEQ ID N0:24所示的是RNAi载体pUC19_RNAi_19KD转化Tci代再生植株的PCR检测1OT5引物的上游引物序列。序列表中SEQ ID N0:25所示的是RNAi载体pUC19_RNAi_19KD转化Tci代再生植株的PCR检测1OT5引物的下游引物序列。
图 1 是 RNAi 载体 pUC19-RNAi-22KD 或 pUC19_RNAi_19KD 的构建示意图。图2是胚乳特异表达的启动子P-zp22/6的PCR鉴定结果，泳道M. DNA marker, 1.胚乳特异表达的启动子P_zp22/6的PCR产物。图3是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22_KD_P的PCR鉴定结果，
泳道M. DNA Marker, 1. 22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的PCR产物。图4是终止子poly (A)的PCR鉴定结果，泳道M. DNA Marker, 1.终止子poly (A) 的PCR产物。图5是⑶S基因内含子的PCR鉴定结果，
泳道M. DNA marker, 1. GUS基因内含子的PCR产物。图6是19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19_KD_P的PCR鉴定结果，
泳道M. DNA Marker, 1. 19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的PCR产物。图 7 是 RNAi 载体 pUC19_RNAi_22KD 和 pUC19_RNAi_19KD 的酶切检测，
A 是 pUC19-RNAi-22KD 酶切分析，B 是 pUC19_RNAi_19KD 酶切分析；泳道 M. DNA Marker, 1 和 5: Xba I 和 Hind III双酶切，2 和 6: Xba I 单酶切，3 和 7: Sac I 和 Xba I 双酶切，4和8: Sac I和Hind III双酶切。图 8 是 pUC19-RNAi_22KD 载体图谱。图 9 是 pUC19-RNAi_19KD 载体图谱。图10是玉米胚性愈伤组织。图11是以pUC19-RNAi_19KD载体为例说明玉米醇溶蛋白基因RNAi载体基因枪转化后的愈伤组织。图12是以pUC19-RNAi_19KD载体为例说明玉米醇溶蛋白基因RNAi载体基因枪转化后愈伤组织的再生。图13是以pUC19-RNAi_19KD载体为例说明玉米醇溶蛋白基因RNAi载体转化后分化小苗的壮苗培养。图14是以pUC19-RNAi_19KD载体为例说明玉米醇溶蛋白基因RNAi载体转化得到的Ttl代转基因植株的田间表现。图15是以pUC19-RNAi-19KD载体为例说明玉米醇溶蛋白基因RNAi载体转化得到的Ttl代转基因植株的结实情况。图16是pUC19-RNAi-22KD载体转化的Ttl代转基因植株的PCR鉴定，
泳道M. DNA Marker, CK+ 阳性对照(pUC19-RNAi_22KD干扰载体扩增)，CK-阴性对照 (B73非转基因植株扩增)，CK 空白对照(水为模板)，1-9 =T0代转基因植株扩增。图17是pUC19-RNAi-19KD载体转化的Ttl代转基因植株的PCR鉴定，
泳道M. DNA Marker, CK+ 阳性对照(pUC19_RNAi_19KD干扰载体扩增)，CK-阴性对照 (B73非转基因植株扩增)，CK 空白对照(水为模板)，1-7 =T0代转基因植株扩增。
具体实施例方式实验中所用的各种试剂均可从商业渠道购买，实验中使用的骨架载体pUC19、质粒载体pGreen-02^ BacWxme、表达载体P3301、T载体及质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、 Marker、高保真DNA聚合酶、dNTPs、大肠杆菌DH5 α感受态细胞和bar基因均购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶、T4-DNA连接酶购自美国NEB公司；氨苄青霉素、 IPTG、X-gal等试剂均购自大连宝生物工程有限公司；RQ DNA酶、逆转录酶、5X反应缓冲2,基因组DNA的PCR扩增
1)反应体系
IOXBuffer (Γ含 Mg， IOmM dNTr' .ddftO
.上游引物(2+0+μ mo TB^ 功丨20μιηο1/1.' Τ-. m_ ( ΠΓ； α ι ■ 基 ill 组 DNA_
液、dNTP、RNA酶抑制剂购自Promega公司；其他化学试剂为国产分析纯；基因枪PDS-1000/ He及其消耗品购自Bio-Rad公司。核苷酸测序均由华大基因公司完成。所用的引物序列均由北京奥科生物技术公司合成。实验中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1 玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi_22KD的构建
一、供试材料玉米(Zm mays L.)自交系B73，是目前广泛应用于玉米遗传研究及育种实践的玉米种质，能够从种子公司(如云南田瑞种业有限公司，地址云南省昆明市北郊龙头街)直接购买。二、实验方法
1、B73玉米基因组DNA的提取
1)取玉米叶片300mg，加液氮充分研磨；
2)加入700μ 1 65°C预热的2%CTAB提取液，轻轻混勻；
3)置于65°C水浴 30-60 min ；
4)室温放置2min，加入300 μ 1氯仿-异戊醇(24:1)，充分震荡1-2 h ；
5)10，000 rpm 离心 10 min ；
6)取上层水相至新的离心管中，加入600μ 1异丙醇，室温放置10 min ；
7)10,000 rpm 离心 1 min，弃上清；
8)加入75%的乙醇500μ 1，室温放置30 min ；
9)重复步骤7和8；
10)10,000 rpm离心30 s，弃上清，自然干燥DNA ；
11)加入100μ 1 TE缓冲液溶解DNA ；
12)检测后分装，-70°C保存。2)反应条件95°C预变性 5 min，(95°C变性 50 s，57°C退火 50 s，72°C延伸 1 min) 35个循环，72°C延伸10 min。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测。3、B73玉米籽粒总RNA的提取
1)取自交授粉后18天的玉米籽粒50-100mg，用液氮充分研磨；
2)加入1ml Trizol试剂，剧烈震荡混勻；
3)12，000 rpm 离心 10 min，取上清；
4)加入200μ 1氯仿，剧烈震荡混勻，冰浴3 min ；
5)12，000 rpm 离心 15 min (4°C)；
ι—I Tx Tx Ix Tx Tx Ix
HKU-H^ =L ζ! β =L
O 6 15 5 3 O
2.1.3.0.0.0.2. 1
O
206)取上层水相至新的离心管中，加入等量体积的异丙醇，_20°C放置10min ；
7)12,000 rpm离心15 min (4°C )，弃上清，加入700 μ 1 70%乙醇洗涤沉淀；
8)8,000 rpm 离心 10 min (4°C)，弃上清;
9)沉淀用30μ 1 DEPC-H2O溶解；
10)1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA。
4、RNA反转录体系
反应体系玉米籽粒总RNA 8 μ ，加入1 μ RQ DNA酶和1 μ RQ缓冲液，37°C水浴 30 min，取出后置于冰上，加入1 μ RQ终止缓冲液，65°C水浴10 min ；然后取出9 μ 1 作为RNA模板，加入OligodT 1 μ ，混勻后置于70°C水浴5 min，然后冰上冷却2 min ；再加入5倍RT MLV缓冲液4 μ , 10 mM dNTP 4 Pl，RNA酶抑制剂1 μ (20U)，M-MLV反转录酶 1 μ (200U)，42°C水浴 1 h;72°C灭活 10 min，冰浴 10 min，于 _20°C保存。
5、RT-PCR 反应fl
10 X Buffer (.含 Mg，2.0μ 1
IOmM dNTP1. Oμ
ddftO13. 7μ
上游引物(20 prnol/1)0. 5μ
下游引物(20 pmol/1)0.5μ
Taqll (5U/μ 1)0. 3μ
反转录产物2.0μ
总体枳
1 U.
O
O 2反应条件94°C预变性 5 min，(94°C变性 40 s，59°C退火 45 s，72°C延伸 1 min) 35个循环，72°C延伸10 min。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测。
6, PCR产物与T载体的连接反应体系
PCR产物4 μ pEASY- Tl 载体(5 I■ig) 1 μ!总体积5 Jul
反应
轻轻棍合后室温反应5 Mn,然后将离心管置于冰上< 7、连接产物向大肠杆菌的转化
1)取感受态细胞DH5a100 μ ，加入T载体连接物2 μ ，冰浴30 min
2)42°C水浴热激90 s，立即置于冰上2 min ；
3)加入500μ LB培养基，在37°C条件下200Xg摇1 h;
4)；3500 Xg离心1 min，静置1 h后弃部分上清；
5)力口人5 μ ZPTG 禾口 50 μ X-Gal ；6)涂板、封口；
7)37°C培养 16 h ；
8)挑白色单菌落，37°C进行摇菌。8、重组载体DNA的提取
用北京全式金生物技术有限公司质粒提取试剂盒提取，步骤如下 1)取4 ml过夜培养的细菌10，000 X g离心1 min ；
2)加入250μ 1无色RB (含RNase Α)，震荡悬浮细菌沉淀；
3)加入250μ 1蓝色LB，不超过5 min ；
4)加入；350μ 1黄色ΝΒ，室温静置2 min ；
5)15，000Xg离心5 min，取上清加入吸附柱中；
6)15，000 Xg离心1 min，弃流出液；
7)加入650μ 1溶液WB，15，000 Xg离心1 min，弃流出液；
8)15，OOOXg离心2 min，彻底去除残留的WB ；
9)将吸附柱置于干净的离心管中，在柱中加入50μ 70°C预热的EB或去离子水 (pH>7.0)室温静置 1 min ；
10)10，000Xg 离心 1 min，洗脱 DNA，于-20°C保存。9、重组载体DNA的酶切
权利要求
1.一种玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD是在骨架载体pUC19上含有胚乳特异表达启动子P-zp22/6，胚乳特异表达启动子P-zp22/6位于所述的RNAi载体 pUC19-RNAi-22KD的酶切位点I和Sma I间；正向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分 cDNA片段22-KD-P位于所述的RNAi载体pUC19_RNAi_22KD的酶切位点Sma I和Xba I 间；反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P位于所述的RNAi载体 pUC19-RNAi-22KD的酶切位点Xba I和Xho I间；在正向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P和反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P之间含有⑶S基因内含子，⑶S基因内含子位于所述的RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的)(ba I 酶切位点间；终止子poly(A)位于所述的RNAi载体pUC19_RNAi_22KD酶切位点Hind III和 Xho I间；所述的胚乳特异表达启动子P-zp22/6的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，所述 22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示，所述⑶S 基因内含子的核苷酸序列如SEQ ID NO: 14所示，所述终止子poly(A)的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示，所述玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19_RNAi_22KD的核苷酸序列如SEQ ID NO: 15所示。
2.根据权利要求1所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD，其特征在于所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD按以下方法构建获得(1)构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6①胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的获得以玉米品种的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示序列的特异启动子P引物对进行PCR扩增，得到如SEQ ID N0:3所示序列的胚乳特异性表达启动子 P-zp22/6 ；②构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体pUC19-p22/6用he I和)(ba I酶切步骤(1)①得到的带有相应酶切位点的胚乳特异性表达启动子， 然后与同样经Mc I和)(ba I酶切的骨架载体pUC19连接，得到含有胚乳特异性表达启动子 P-zp22/6 的重组载体 pUC19-p22/6 ；(2)构建插入正向目的片段22-KD-P和胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体 pUC19-p22/6-22KDl①22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的获得以玉米籽粒总RNA为模板，以SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:5所示序列的R22-6引物对， 进行RT-PCR扩增，然后以此RT-PCR产物为模板，以SEQ ID NO:6和SEQ ID NO: 7所示序列的R22-7引物对，再进行RT-PCR，得到如SEQ ID NO: 8所示的22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA 片段 22-KD-P ；②构建插入正向目的片段22-KD-P和胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体 pUC19-p22/6-22KDl用Sma I和)(ba I双酶切步骤(2)①得到的带有相应酶切位点的目的片段22-KD-P，然后与同样经Sma I和)(ba I双酶切的步骤(1)②构建的重组载体pUC19-p22/6连接，得到插入了正向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P和胚乳特异性表达启动子 P-zp22/6 的重组载体 pUC19-p22/6-22KDl ；(3)构建插入反向目的片段22-KD-P的重组载体pUC19-22KD2用HindII^n^Cba I酶切步骤(2)①得到的带有相应酶切位点的目的片段22-KD-P，然后与同样经Hind III和Xba I酶切的pUC19载体连接，得到插入反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的重组载体pUC19_22KD2 ；(4)构建含有终止子poly(A)的重组载体pUC19-22KD2-poly(A)以表达载体P3301 DNA为模板，用SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10所示序列的终止子 poly(A)的上下游引物进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO: 11所示序列的终止子poly (A)；进一步用Bio I和Hind III双酶切带有相应酶切位点的终止子poly (A)，然后与同样经B10 I 和Hind III双酶切的步骤(3)得到的重组载体pUC19-22KD2连接，得到含有终止子poly (A) 的重组载体 pUC19-22KD2-poly(A)；(5)构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6，正、反向目的片段22-KD-P和终止子 poly (A)的重组载体 pUC19-p22/6-22KDl-22KD2-poly (A)将步骤(2)构建的重组载体pUC19-p22/6-22KDl和步骤(4)构建的重组载体 pUC19-22KD2-poly (A)分别用)(ba I和Hind III双酶切，然后将含有反向目的片段 22-KD-P和终止子poly (A)的酶切产物22KD2_poly (A)连接到步骤(2)构建的重组载体pUC19-p22/6-22KDl上，得到含有胚乳特异性表达启动子P_zp22/6，正、反向目的基因 22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P和终止子poly (A)的重组载体pUC19-p22/6_2 2KDl-22KD2-poly(A)；(6)⑶S基因内含子的连接和玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的构建以质粒载体pGreen-0229 Backbone DNA为模板，用 SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13所示序列的⑶S基因内含子的上下游引物进行PCR扩增，得到如SEQ ID N0:14所示的⑶S基因内含子；进一步用)(ba I单酶切带有相应酶切位点的GUS基因内含子，然后与同样经)(ba I 单酶切后磷酸化处理的步骤(5)构建的重组载体pUC19-p22/6-22KDl-22KD2-poly(A)连接，得到所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD，玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD的核苷酸序列如SEQ ID NO: 15所示。
3.一种玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD是在骨架载体pUC19上含有胚乳特异表达启动子P-zp22/6，胚乳特异表达启动子P-zp22/6位于所述的RNAi载体 pUC19-RNAi-19KD的酶切位点I和Sma I间；正向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分 cDNA片段19-KD-P位于所述的RNAi载体pUC19_RNAi_19KD的酶切位点Sma I和Xba I 间；反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P位于所述的RNAi载体 pUC19-RNAi-19KD的酶切位点Xba I和Xho I间；在正向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分 cDNA片段19-KD-P和反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P之间含有 ⑶S基因内含子，⑶S基因内含子位于所述的RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的)(ba I酶切位点间；终止子poly (A)位于所述的RNAi载体pUC19-RNAi_19KD酶切位点Hind III和Xho I 间；所述胚乳特异表达启动子zp22/6的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示，所述⑶S基因内含子的核苷酸序列如SEQ ID NO: 14所示，所述终止子poly (A)的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11 所示，所述玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的核苷酸序列如SEQ ID NO: 21 所示。
4.根据权利要求3所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD，其特征在于所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD按以下方法构建获得(1)构建含有胚乳特异性表达启动子P-ZP22/6的重组载体pUC19-p22/6①胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的获得以玉米品种的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示序列的特异启动子P引物对进行PCR扩增，得到如SEQ ID N0:3所示序列的胚乳特异性表达启动子 P-zp22/6 ；②构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6序列的重组载体pUC19-p22/6用I和)(ba I酶切步骤(1)①得到的带有相应酶切位点的胚乳特异性表达启动子， 然后与同样经Mc I和)(ba I酶切的骨架载体pUC19连接，得到含有胚乳特异性表达启动子 P-zp22/6 的重组载体 pUC19-p22/6 ；(2)构建插入正向目的片段19-KD-P和胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体 pUC19-p22/6-19KDl①19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的获得以玉米籽粒总RNA为模板，以SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17所示序列的R19-4引物对，进行RT-PCR扩增，然后以此RT-PCR产物为模板，以SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19所示序列的R19-5引物对，再进行RT-PCR，得到如SEQ ID NO: 20所示序列的19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P ；②构建插入正向目的片段19-KD-P和胚乳特异性表达启动子P-zp22/6的重组载体 pUC19-p22/6-19KDl用Sma I和)(ba I双酶切步骤(2)①得到的带有相应酶切位点的目的片段19-KD-P，然后与同样经Sma I和)(ba I双酶切的步骤(1)②构建的重组载体pUC19-p22/6连接，得到插入了正向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P和胚乳特异性表达启动子 P-zp22/6 的重组载体 pUC19-p22/6-19KDl ；(3)构建插入反向目的片段19-KD-P的重组载体pUC19-19KD2用Hind III和)(ba I酶切步骤(2)①得到的带有相应酶切位点的目的片段19-KD-P，然后与同样经Hind III和Xba I酶切的pUC19载体连接，得到插入反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的重组载体pUC19_19KD2 ；(4)构建含有终止子poly(A)的重组载体pUC19-19KD2-poly(A)以表达载体P3301 DNA为模板，用SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10所示的终止子poly (A) 的上下游引物进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO: 11所示的终止子poly (A)；进一步用Bio I 和Hind III双酶切带有相应酶切位点的终止子poly (A)，然后与同样经Bio I和Hind III双酶切的步骤(3)得到的重组载体pUC19-19KD2连接，得到含有终止子poly(A)的重组载体 pUC19-19KD2-poly(A)；(5)构建含有胚乳特异性表达启动子P-zp22/6，正、反向目的片段19-KD-P和终止子 poly (A)的重组载体 pUC19-p22/6-19KDl-19KD2-poly (A)将步骤(2)构建的重组载体pUC19-p22/6-19KD和步骤(4)构建的重组载体 pUC19-19KD2-poly (A)分别用)(ba I和Hind III双酶切，然后将含有反向目的片段 19-KD-P和终止子poly㈧的酶切产物19KD2_poly㈧连接到步骤(2)构建的重组载体pUC19-p22/6-19KDl上，得到含有胚乳特异性表达启动子P_zp22/6，正、反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P和终止子poly (A)的重组载体pUC19-p22/6_l 9KDl-19KD2-poly(A)；(6)⑶S基因内含子的连接和玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD的构建以质粒载体 pGreen-0229 Backbone DNA 为模板，用 SEQ ID NO: 12 和 SEQ ID NO: 13所示序列的⑶S基因内含子的上下游引物进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO: 14 所示序列的GUS基因内含子；进一步用)(ba I单酶切带有相应酶切位点的GUS基因内含子，然后与同样经)(ba I单酶切后磷酸化处理的步骤(5)构建的重组载体 pUC19-p22/6-19KDl-19KD2-poly (A)连接，得到所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体 pUC19-RNAi-19KD，玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19_RNAi_19KD的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO:21 所示。
全文摘要
本发明公开了一种玉米醇溶蛋白基因RNAi载体。所提供的玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-22KD含有胚乳特异表达启动子P-zp22/6，正、反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P，GUS基因内含子和终止子poly(A)。还提供了另一个玉米醇溶蛋白基因RNAi载体pUC19-RNAi-19KD，该载体含有胚乳特异表达启动子P-zp22/6，正、反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P，GUS基因内含子和终止子poly(A)。该载体导入玉米品种能成功获得高赖氨酸含量的玉米转基因植株，赖氨酸含量提高15-60%，转育周期只需1-2年。
文档编号C12N15/66GK102517314SQ20121001054
公开日2012年6月27日 申请日期2012年1月14日 优先权日2012年1月14日
发明者刘丽, 王琨, 番兴明, 陈威 申请人:云南田瑞种业有限公司, 云南省农业科学院粮食作物研究所