点状掌跖角化病的致病基因及其用途
【专利摘要】本发明鉴定了与点状掌跖角化病(Punctate?palmoplantar?keratodermas，PPPK，OMIM：148600)相关的致病基因，COL14A1基因。在此基础上，本发明提供了突变的COL14A1基因及其用途，包含突变的COL14A1基因的载体、宿主细胞以及试剂盒。此外，本发明还提供了用于诊断或治疗点状掌跖角化病的方法，用于所述方法的诊断剂或治疗剂，以及包含所述诊断剂或治疗剂的试剂盒。
【专利说明】点状掌跖角化病的致病基因及其用途
【技术领域】[0001]本发明涉及分子遗传学领域以及疾病诊断和治疗领域。特别地，本发明鉴定了与点状掌妬角化病(Punctate palmoplantar keratodermas,PPPK, OMIM: 148600)相关的致病基因，C0L14A1基因。在此基础上，本发明提供了突变的C0L14A1基因及其用途，包含突变的C014A1基因的载体、宿主细胞以及试剂盒。此外，本发明还提供了用于诊断或治疗点状掌跖角化病的方法，用于所述方法的诊断剂或治疗剂，以及包含所述诊断剂或治疗剂的试剂盒。
【背景技术】
[0002]掌妬角化病(palmoplantar keratodermas, PPK)是一类类型多样、发病机制较为复杂、并且具有高度遗传异质性的、以弥漫性或局限性掌跖增厚为主要特征的皮肤疾病。
[0003]点状掌跖角化病(PPPK ；0MIM:148600)是一种以不规则分布于掌跖的大量角化性斑块为特征的罕见的常染色体显性遗传性疾病。Buschke和Fischer在1910年第一次描述了该疾病，Brauer在1913年确定了它的遗传性[13]。因此，该疾病又被命名为点状掌跖角化病Buschke-Fi scher-Brauer型。PPPK疾病在部分国家有报道，并且其发病率在克罗地亚为10万分之1.17 [14]，在斯洛文尼亚为10万分之3.3 [27]。从1991年至今，我国仅报道了 9个PPPK疾病家系，并且在这些家系中，PPPK疾病都以常染色体显性遗传的模式遗传。PPPK疾病患者在手掌与足跖部位具有圆形或卵圆形、较硬的黄色或淡黄色角质丘疹；若去除角质丘疹，则局部可留有火山口样的凹坑。此外，患者还可伴有甲变形[13，14]。典型的点状皮损可以融合成块，这可能与遭受连续性高压有关[12]，并且足跖部位的皮疹通常比掌部的更大。少数患者不仅可累及掌跖部位，而且可累及其他部位如膝部、手足背部、肘部等等。PPPK疾病的组织病理学特征主要表现为，表皮高度角化过度、角质层明显增厚、其下方马尔匹基层被压凹陷低于一般表皮水平、颗粒层和棘层增厚、基底细胞无异型性增生、真皮乳头水肿及小血管扩张、真皮内无炎细胞浸润等。
[0004]PPPK在临床上与一些其他的发生于掌跖部位的角化性皮肤疾病比较相似，如胼胝、跖疣、持久性豆状角化过度(HLP) (0ΜΙΜ: 144150)、掌跖部位的点状汗孔角化症(0ΜΙΜ: 175860)、砷角化症、肢端角化性类弹性纤维病等疾病。然而，PPPK疾病仍然可以与此类疾病相区别。例如，(I)胼胝是因压力所致，跖疣可以通过临床和组织病理学特征(无角化不全或细胞空泡变性)来排除；(2)持久性豆状角化过度(HLP):可以观察到l-5mm点状角化性丘疹，并且在HLP中，tolly样角化过度是其组织病理学特征；(3)掌跖部位的汗孔角化症(又称为棘状角化病):其发病年龄多在12-25岁，掌跖部位的点状汗孔角化症与点状角化非常相似，表现为大量的l_3mm凹陷和角化栓[36，37]，并且其也以常染色体显性遗传模式遗传；然而，该疾病本身具有独特的组织病理学特征，如牛角线和角化不全，汗孔角化等等；(4)肢端角化性类弹性纤维病(0ΜΙΜ: 101850):其属于常染色体显性遗传，在临床上可以观察到多边形或者圆形的火山口样丘疹，分布于手掌与手背交界部及足跖边缘；并且其发病年龄大多开始于20岁左右，但也可见于中年与少年；其组织病理学特征可见角质层增厚与角化过度，颗粒层、棘层增厚，真皮下不可见排列紊乱的弹力纤维[38] ；(5)砷角化症:患者有砷接触史，其可导致针头大小的点状角化斑[39]，类似于寻常疣的表现，多见于手掌与足底，其上可见散在的色素脱失；该疾病可伴发各种恶性皮肤肿瘤，如鲍温病、基底细胞癌、鳞状细胞癌；砷角化症的组织病理学特征可见角化不全、角化过度、可伴轻至中度的角质形成细胞发育不良，表皮突呈不规则向下延伸，在真皮上部可以见到慢性炎性细胞的浸润，也可见到真皮的嗜碱性变，角质形成细胞呈轻度核异形性、核深染；如若伴发其他疾病，则可出现相应疾病的组织病理学特征。
[0005]Martinez-Mir等[12]对3个不同种族的PPPK家系(I个犹太、I个墨西哥、I个阿拉伯)进行了全基因组扫描，将致病基因定位在15q22 - 15q24.1上D15S534和D15S818之间的9.98cM区域中(其物理距离为7.5Mb)。此外，鉴于该区域的L0C123396基因与K8具有高度的同源性，而角蛋白突变可引起多种不同类型的PPK，他们还把该区域的L0C123396基因作候选基因，进行了序列分析。然而，他们并未在该候选基因中检测到有意义的突变，而仅仅发现了两个位点多态性 ，其所对应的氨基酸改变分别为A358T与R392C。
[0006]张等[I]对中国的2个不同地区的PPPK家系进行了连锁分析，并将该疾病的致病基因定位在8q24.13-8q24.21上D8S1804和D8S1720之间的9.02cM区域中。并且，他们的研究结果提示，PPPK具有遗传异质性。该区域包括了 10个已知的基因:CDAI1，MTSSl,KIAA0196, NDUFB9(MIM 601445), TRC8(MIM 603046), NSE2, C8FW, P0U5F1(MIM164177),SQLE (MIM 602019)和MYC (MM 190080)，以及11个预测的基因。然而，在这些基因中，并未发现特异性表达于皮肤的基因。
[0007]高等[2]在一个中国的大家系中进行了精心定位，将PPPK致病基因定位在D15S651和D15S988之间的5.06cM区域中。他们还对该区域内的6个基因:KLPH, MAP2K1 (0MIM: 176872)，MADH6 (0M頂:602931)、RPL4 (0ΜΙΜ: 180479)，FLJ10036和 SNAPC5 (0M頂:605979)进行了检测，然而并未发现有意义的突变位点。
[0008]El Amri I等[16]确定了在染色体15q中的可疑基因座的遗传因素，此区域位于D15S987和D15S153之间。然而，他们也未能最终鉴定出PPPK的致病基因。
[0009]全基因组外显子测序(也称为外显子组测序(exome sequencing))是一种经济的测序方法，其主要是对人类基因组的编码区进行测序，从而探测与罕见和常见疾病相关的新基因。由于该方法只测序全部基因组的编码区(占全部基因组的约1%)，因此，该方法比较经济并且伴有较高的覆盖效率和深度[17，18]。目前公认，大多数单基因疾病由致病基因的功能变异引起，而大部分的此类功能变异又发生于外显子区域中[3，4]，因此，全基因组外显子测序被认为是弥补定位克隆技术的重要技术。
[0010]全基因组外显子测序技术已被证明为减少稀有单基因疾病的候选基因个数甚至发现其致病基因的有力、有效手段。通过对很少的几个个体(包括患者及正常对照)进行外显子组测序，以筛选与疾病相关的变异，其成功率大为提升。自2009年以来，国内外已经利用全基因组外显子测序技术，成功地发现或验证了一些单基因疾病(Freeman - Sheldon综合征、Miller综合征、Kabuki综合征、BVVL综合征、逆向性痤疮、脊髓小脑共济失调、Schinzel-Giedion综合征、非综合征性耳聋)的致病基因[5_11]。另外，还通过将全基因组外显子测序与连锁定位方法相结合，发现了一些单基因疾病的致病基因[8，19-23]。
[0011]本发明基于全基因组外显子测序技术以及全基因组连锁分析法，成功鉴定出了与PPPK相关的致病基因-C0L14A1基因，以及其中的致病突变(C0L14A1基因的杂合变异:NM_021110.1:外显子37:c.4505C_>T ;p.Prol502Leu))。在此基础上，本发明提供了突变的C0L14A1基因及其用途，包含突变的C0L14A1基因的载体、宿主细胞以及试剂盒。此外，本发明还提供了用于诊断或治疗PPPK的方法，用于所述方法的诊断剂或治疗剂，以及包含所述诊断剂或治疗剂的试剂盒。本发明所鉴定的PPPK致病基因，为进一步探明该疾病的发病机制奠定了重要基础，并且有可能为患者的治疗方案提供全新的理论依据。此外，本发明所鉴定的PPPK致病基因还对将来的遗传咨询、产前诊断及基因治疗具有重要意义。
【发明内容】
[0012]在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
[0013]如本文中所使用的，术语“C0L14A1基因”是指编码胶原XIV(CXIV)的基因，其跨度为246，922bp，具有47个外显子，并且其示例性cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。CXIV是一种具有不规则三螺旋结构的纤维相关胶原，它通过与纤维表面相互作用而调节原纤维的形成[28]，并且主要表达在已分化的组织和晚期的胚胎组织中[29]。如本文中所使用的，C0L14A1基因的第N个外显子被简称为外显子N(N为1_47的整数)。
[0014]如本文中所使用的，当用具体的序列来描述基因或核酸时，其不仅包括该具体序列所代表的基因或核酸，而且包括该具体序列的互补序列所代表的基因或核酸。在本申请中，虽然为了方便起见，在多数情况下针对基因或核酸只给出了一条链的序列，然而本领域技术人员可以明确获知其互补链的序列。因此，本申请事实上也公开了所述互补链的序列。
[0015]例如，当提及C0L14A1基因的cDNA序列时，其不仅包括cDNA的实际序列，而且包括所述实际序列的互补序列。又如，当提及SEQ ID NO:1时，其不仅包括SEQ ID NO:1所示的序列，而且包括SEQ ID NO:1的互补序列。
[0016]本申请中的核酸序列包括DNA形式和RNA形式。除非上下文特别指明，否则本发明的核酸序列不仅包括DNA形式，而且包括RNA形式。例如，当提及SEQ ID NO:1时，其不仅包括DNA形式(例如，cDNA序列)，而且包括RNA形式(例如，mRNA序列)。
[0017]如本文中所使用的，术语“突变”，当用于描述基因或DNA时，是指基因序列或DNA序列中一个或多个(例如，几个)碱基的添加、缺失和/或置换；当用于描述蛋白质时，是指蛋白质氨基酸序列中一个或多个(例如，几个)氨基酸残基的添加、缺失和/或置换。
[0018]如本文中所使用的，术语“沉默突变”是指这样的基因突变，其引起mRNA中的密码子发生改变，但由于密码子的简并性而未引起编码的氨基酸发生改变。如本文中所使用的，术语“非沉默突变”是指除了沉默突变以外的基因突变，包括但不限于，错义突变、无义突变和移码突变等。
[0019]如本文中所使用的，术语“功能丧失性突变”是指这样的突变，其导致突变基因所编码的蛋白丧失了对应的野生型蛋白的生物学功能，或与对应的野生型蛋白相比，具有异常的生物学功能。
[0020]如本文中所使用的，术语“杂合突变”是指这样的突变，其仅存在于一对等位基因中的一个基因中。如本文中所使用的，术语“纯合突变”是指这样的突变，其在一对等位基因中的两个基因中同时存在。
[0021]如本文中所使用的，术语“c.4505”是指cDNA序列的第4505位碱基(以起始密码子ATG的碱基A为第I位碱基)，其中“c.”表示cDNA，数字“4505”表示第4505位碱基。本文中所使用的其他类似的术语具有类似的含义。
[0022]如本文中所使用的，术语“p.1502”是指蛋白质序列的第1502位氨基酸残基，其中“P.”表示蛋白质，数字“1502”表示第1502位氨基酸残基。本文中所使用的其他类似的术语具有类似的含义。 [0023]如本文中所使用的，术语“c.4505C — T”是指cDNA序列的第4505位碱基(以起始密码子ATG的碱基A为第I位碱基)由C突变为T。本文中所使用的其他类似的术语具有类似的含义。
[0024]如本文中所使用的，术语“p.Prol502Leu”是指蛋白质序列的第1502位氨基酸残基由Pro突变为Leu。本文中所使用的其他类似的术语具有类似的含义。
[0025]如本文中所使用的，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。另外，还用“ ”表示终止密码子。
[0026]如本文中所使用的，术语“载体(vector) ”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。此类载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于:质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。
[0027]载体中可包含与目的基因可操作地连接的表达控制序列。如本文中所使用的，术语“可操作地连接”是指所连接的分子的连接方式使得能够实现预期的功能。例如，表达控制序列与基因编码序列的可操作的连接可实现表达控制序列对基因编码序列的表达的控制作用。如本文中所使用的，术语“表达控制序列”是实现基因表达所需要的控制序列，其是本领域熟知的。表达控制序列通常必须包括启动子，常常也包括转录终止序列，并且还可以包含其他序列，如增强子序列。基因表达对于siRNA、miRNA等而言是指转录，并且还可以包括转录后加工；对于蛋白质编码序列而言通常是指转录和翻译，产生蛋白质。
[0028]另外，载体中还可包含选择标记。此类选择标记是本领域技术人员熟知的,例如但不限于抗生素抗性基因，例如青霉素抗性基因、红霉素抗性基因等等。
[0029]如本文中所使用的，“PCR引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或者更多个碱基的多核苷酸片段。
[0030]本领域技术人员公知，引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的，术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增C0L14A1基因是指，在PCR反应中引物只扩增C0L14A1基因，而不扩增其他基因。此类引物的设计是本领域技术人员公知的，参见例如，Sambrook 等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版，ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989);和 Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)。
[0031]通常，引物与待扩增的目的基因或其互补链具有大体上的同一性，从而能够特异性扩增目的基因。例如，引物与待扩增的目的基因或其互补链具有至少60%的序列同一性,例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一'I"生。[0032]如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目XlOO的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如 Align 程序(DNAs tar, Inc.)方便地进行的 Needleman 等人(1970) J.Mol.Biol.48:443-453的方法来实现。[0033]如本文中所使用的，术语“杂交”是指相互间具有互补序列的两个单链核酸分子在一定条件下(适宜的温度及离子强度等)按碱基互补配对原则退火形成双链核酸的过程。核酸杂交可以在DNA-DNA之间，也可在DNA-RNA或RNA-RNA之间进行，只要它们之间存在互补序列，可以进行碱基配对。一般而言，杂交的双方是待测核酸分子和已知核酸分子。在杂交体系中已知的核酸分子称作探针(probe)。核酸杂交包括固-液相杂交和液相杂交。液相杂交是在溶液中进行的杂交反应，其是指待测核酸分子与已知核酸分子(探针)在溶液中退火形成杂交复合物。[0034]如本文中所使用的，术语“特异性检测C0L14A1基因突变”是指探针能够区分出含有突变的C0L14A1基因与不含有突变的C0L14A1基因。一般而言，可以通过控制杂交条件的严紧性，使得探针能够区分出含有突变的基因与不含有突变的基因。例如，在高度严紧条件下，与C0L14A1基因精确互补的探针可以与不含有突变的C0L14A1基因杂交，而不与甚至只包含一个点突变的突变的C0L14A1基因杂交，从而将二者区分开。同样，还可以设计与突变的C0L14A1基因精确互补的探针，从而其在高度严紧条件下与突变的C0L14A1基因杂交，而不与不含有突变的C0L14A1基因杂交。[0035]在分子生物学领域中，探针的设计和杂交技术是熟知的，参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989);和 Ausubel 等人，Current Protocols inMolecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)。为了举例说明的目的，杂交的条件可以是严紧条件，例如与滤膜结合的DNA在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中约45°C下杂交，之后在0.2XSSC/0.1%SDS中于约50 — 65°C下进行一次或多次洗涤；高度严紧条件，例如与滤膜结合的核酸在6XSSC中约45°C下杂交，之后在0.1XSSC/0.2%SDS中于约68°C下进行一次或多次洗涤；或本领域技术人员已知的其它严紧杂交条件。[0036]通常，探针是经标记的，从而在杂交反应结束后，通过利用探针上的标记物，可以分离和检测杂交后的双链。同样，也可以对引物进行标记，从而在PCR后，通过利用引物上的标记物，可以分离和检测扩增产物。可用于标记探针和引物的标记物在本领域内是已知的，包括但不限于，放射性同位素如1251、酶、酶的底物、发光物质如异鲁米诺和吖啶酯、荧光物质如荧光素和罗丹明、生物素和有色物质如乳胶颗粒和胶体金等。标记用的酶可以是过氧化物酶(如辣根过氧化物酶HRP)、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。对于这些反应中合适的底物有2，2’ -连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)、鲁米诺-过氧化氢、邻苯二胺-过氧化氢(针对过氧化物酶)、对硝基苯磷酸盐、4-甲基磷酸伞型酮、3_(2’-螺旋金刚烧)_4_甲氧基-4_(3〃-憐酸基)苯基-1,2-二乙氧基烧(针对喊性憐酸酶)、对硝基苯-β-D-半乳糖和甲基伞形酮-β-D-半乳糖(针对β半乳糖苷酶)。其它的标记包括量子点标记、生色团标记、酶标记、亲和配体标记、电磁自旋标记、重原子标记、标记有纳米微粒光散射标记或其它纳米微粒的探针、异硫氰酸荧光素(FI TC)、TRITC、罗丹明、四甲基罗丹明、R-藻红蛋白、Cy-3、Cy-5、Cy_7、得克萨斯红、Phar-Red、异藻红蛋白(APC)、以及酶标记如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、I2-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶和半抗原偶联物如洋地黄毒苷或二硝基苯酚、或能够形成配合物的结合配对如链霉抗生物素蛋白/生物素、抗生物素蛋白/生物素或抗原/抗体配合物如包括兔IgG和抗-兔IgG;突光基团如伞形三糖(umbelliferone)、突光素、异硫氰酸突光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、绿荧光蛋白、藻红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀绿、二苯乙烯、荧光黄、Cascade蓝、二氯三嗪基荧光素、丹磺酰氯、藻红蛋白、荧光镧系络合物如包括铕和铺、Cy3、Cy5、分子信标(molecular beacons)和其突光衍生物、发光材料如鲁米诺；光散射或细胞质基因组共振材料如金或银颗粒或量子斑(quantum dot):或放射性材料如14C、1231、1241、1311、Tc99m、35S 或 3H;或球珠(spherical shell),以及标记有本领域已知的任何其它信号产生标记物的探针。例如，可检测的分子包括但不限于荧光基团以及前面所述其它已知的，如在 Joseph R.Lakowicz (Editor)所编的 Principles of FluorescenceSpectroscopy, Plenum Pub Corp,第二版(July 1999)和 Richard P.Hoagland 的第六版的Molecular Probes Handbook所描述的。在某些实施方式中，标记物包括半导体纳米微晶如量子斑(即 Qdots),参见 U.S.P 6,207,392。Qdots 可从 Quantum Dot Corporation购得。用于本发明的半导体纳米微晶包括Group I1-V半导体的纳米微晶如MgS、MgSe、MgTe, CaS, CaSe, CaTe, SrS, SrSe、SrTe, BaS, BaSe, BaTe, ZnS、ZnSe、ZnTe, CdS, CdSe、CdTe, HgS, HgSe, HgTe和其混合物以及Group II1-V半导体的纳米微晶如GaAs、InGaAs,InP、InAs和其混合物。Group IV半导体如锗或硅的使用，或有机半导体的使用，在某些条件下可能是方便可行的。半导体纳米微晶也可以包括合金，其含有两种或多种选自于Group II1-V化合物、Group I1-VI化合物、Group IV元素和其组合物的半导体。根据使用的标记物，相应的核酸分离和检测方法在本领域内也是已知的。参见例如，Henegariu
O等人，(1999).“Custom fluorescent-nucleotide synthesis as an alternativemethod for nucleic acid labeling，，，Nature Biotechnology 18:345-348 ;Ezaki T 等，1989.Fluorometric Deoxyribonucleic Acid-Deoxyribonucleic Acid Hybridizationin Microdilution Wells as an Alternative to Membrane Filter Hybridization inwhich Radioisotopes Are Used To Determine Genetic Relatedness among BacterialStrains.1nt.J.0f Systemic Bacteriology 29 (3): 224-229 ;和 Herrington C等人，1998.PCR 3:PCR in situ hybridization:a practical approach, Volume 3.0xford:OxfordUniversity Press。
[0037]如本文中所使用的，术语“能够特异性识别/结合突变的C0L14A1蛋白的抗体或其抗原结合片段”是指这样的抗体或其抗原结合片段，其特异性识别/结合突变的C0L14A1蛋白，而不识别或结合野生型C0L14A1蛋白。此类抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术(Nature, 256:495, 1975)来获得。
[0038]如本文中使用的，术语“特异性识别/结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10_5m，例如小于大约10_6M、10_7M、10_8M、10_9M或ΙΟ,Μ或更小的亲和力(Kd)结合该抗原。如本文中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。可使用本领域技术人员公知的技术，例如表面等离子体共振术(SPR)(例如使用BIAC0RE仪)来测定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。
[0039]如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，FundamentalImmunology, Ch.7 (Paul, ff., ed.,第 2 版，Raven Press, N.Y.(1989),其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
[0040]如本文中所使用的，术语“中和性抗体”是指，能阻断或抑制其所识别的抗原的活性或功能的抗体。
[0041]如本文中所使用的，术语“特异性靶向突变的C0L14A1基因的siRNA”是指，siRNA能够通过RNA干扰特异性沉默或抑制突变的COL14AI基因的表达，而不影响野生型COL14AI基因的表达。
[0042]如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如 Remington’s Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR, 19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company, 1995),并且包括但不限于:pH 调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80 ;离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
[0043]如本文中所使用的，术语“有效量”是指`足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如PPPK)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如PPPK)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
[0044]本发明至少部分基于发明人的发现:C0L14A1基因的突变可导致PPPK。在此基础上，本发明提供了突变的C0L14A1基因及其用途，包含突变的C0L14A1基因的载体、宿主细胞以及试剂盒。此外，本发明还提供了用于诊断或治疗PPPK的方法，用于所述方法的诊断剂或治疗剂，以及包含所述诊断剂或治疗剂的试剂盒。
[0045]因此，在一个方面，本发明提供了突变的C0L14A1基因，其与SEQ ID N0:1相比具有至少I个非沉默突变，并且所述突变的C0L14A1基因编码与野生型C0L14A1蛋白相比，功能异常(例如丧失了功能)的蛋白，或导致PPPK的发生。
[0046]在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变选自添加，缺失和置换中的一种或多种。在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变位于C0L14A1基因的外显子区域。在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变位于C0L14A1基因的第37个外显子。在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变位于:c.4505。在进一步优选的实施方案中，所述非沉默突变是:c.4505C — T0
[0047]在另一个方面，本发明提供了包含上述突变的C0L14A1基因的载体。
[0048]在一个优选的实施方案中，所述载体包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个优选的实施方案中，所述载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。在一个优选的实施方案中，所述载体是商购可得的。在一个优选的实施方案中，所述载体包含与上述突变的C0L14A1基因可操作地连接的表达控制序列，例如但不限于启动子，增强子和终止子。在一个优选的实施方案中，所述载体任选地还包含选择标记。
[0049]在另一个方面，本发明提供了包含上述突变的C0L14A1基因和/或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的宿主细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。
[0050]本领域技术人员公知，可将致病基因用于产生疾病动物模型和/或用作药物靶点，从而研究疾病的发病机制·和开发有效治疗疾病的药物。因此，在另一个方面，本发明提供了上述突变的C0L14A1基因的用途，其用于产生PPPK动物模型，或用作药物靶点，或用于制备试剂盒，所述试剂盒用于产生PPPK动物模型，或用作药物靶点。在一个优选的实施方案中，所述动物包括但不限于，哺乳动物，例如小鼠，大鼠，兔和猴。
[0051]在另一个方面，本发明提供了上述载体或宿主细胞的用途，其用于产生PPPK动物模型，或用于制备试剂盒，所述试剂盒用于产生PPPK动物模型。
[0052]在另一个方面，本发明提供了试剂盒，其包含上述突变的C0L14A1基因和/或载体和/或宿主细胞。
[0053]在另一个方面，本发明提供了用于诊断PPPK的诊断剂，其包含能够特异性扩增C0L14A1基因或其片段的引物，或能够特异性检测C0L14A1基因突变的探针，或能够特异性识别突变的C0L14A1蛋白的抗体或其抗原结合片段。
[0054]在一个优选的实施方案中，所述引物能够特异性扩增C0L14A1基因的外显子，优选第37个外显子。在一个优选的实施方案中，所述引物的序列选自SEQ ID N0:73和74。在进一步优选的实施方案中，所述引物是如SEQ ID N0:73和74所示的引物对。
[0055]在一个优选的实施方案中，所述C0L14A1基因突变位于C0L14A1基因的外显子，优选第37个外显子，更优选地位于:c.4505。在进一步优选的实施方案中，所述突变是
c.4505C — T0
[0056]在一个优选的实施方案中，所述突变的C0L14A1蛋白包含氨基酸突变p.Prol502Leu。
[0057]在一个优选的实施方案中，所述引物、探针或抗体或其抗原结合片段是经标记的。
[0058]在另一个方面，本发明提供了试剂盒，其包含上文所述的诊断剂。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包含其他试剂，例如用于PCR的试剂(例如dNTP和聚合酶)，用于提取核酸的试剂，用于检测所述抗体或其抗原结合片段的二抗等。
[0059]在另一个方面，本发明提供了用于治疗PPPK的治疗剂，其包含分离的正常的C0L14A1基因，或含有所述基因的载体，或具有正常生物学功能的C0L14A1蛋白，或特异性靶向突变的C0L14A1基因的siRNA，或特异性结合突变的C0L14A1蛋白的中和性抗体。如本文中所使用的，术语“正常的C0L14A1基因”是指编码具有正常生物学功能的C0L14A1蛋白的C0L14A1基因，其例如但不限于，如SEQ ID NO:1所示的C0L14A1基因。
[0060]在一个优选的实施方案中，所述突变的C0L14A1基因所包含的突变位于C0L14A1基因的外显子，优选第37个外显子，更优选地位于:c.4505。在进一步优选的实施方案中，所述突变是c.4505C — T0在一个优选的实施方案中，所述突变的C0L14A1蛋白包含氨基酸突变 P.Prol502Leu。
[0061]在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含上文所述的治疗剂，和药学上可接受的载体和/或赋形剂。
[0062]在另一个方面，本发明提供了诊断受试者是否患有PPPK或处于发展PPPK的风险中的方法，其包括，检测受试者的C0L14A1基因是否存在非沉默突变，如果存在所述非沉默突变，则判断受试者患有PPPK或处于发展PPPK的风险中。
[0063]在一个优选的实施方案中， 所述非沉默突变选自添加，缺失和置换中的一种或多种。在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变位于C0L14A1基因的外显子区域。在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变位于C0L14A1基因的第37个外显子。在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变位于c.4505。在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变是c.4505C — T0
[0064]在另一个方面，本发明提供了诊断受试者是否患有PPPK或处于发展PPPK的风险中的方法，其包括:
[0065]I)获得来自所述受试者的核酸样品(例如，基因组DNA样品或总mRNA样品)；
[0066]2)在所述核酸样品中确定C0L14A1基因中是否存在导致C0L14A1基因编码功能异常的蛋白的非沉默突变；和
[0067]3)如果存在所述非沉默突变，则判断受试者患有PPPK或处于发展PPPK的风险中。
[0068]在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变选自添加，缺失和置换中的一种或多种。在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变位于C0L14A1基因的外显子区域。在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变位于C0L14A1基因的第37个外显子。在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变位于c.4505。在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变是c.4505C — T0
[0069]在另一个方面，本发明提供了检测C0L14A1基因的突变的方法，其包括使用上文所述的诊断剂。在一个优选的实施方案中，所述方法不是诊断方法。例如，所述方法可以用于研究目的。
[0070]在另一个方面，本发明提供了治疗受试者的PPPK的方法，其包括给有此需要的受试者施用有效量的上文所述的治疗剂。
[0071]在另一个方面，本发明提供了上文所述的诊断剂在制备用于检测C0L14A1基因的突变和/或用于诊断PPPK的试剂盒中的用途。
[0072]在另一个方面，本发明提供了上文所述的治疗剂在制备用于治疗PPPK的药物组合物中的用途。
[0073]本发明的试剂、试剂组合物、药物组合物或试剂盒中可进一步包含与活性成分相容的缓冲液、载体或媒介等，例如选自下列的一种或多种:水、生理盐水、磷酸缓冲液、左旋糖、甘油、乙醇和其他类似物，以及上述物质的组合。此类缓冲液、载体或媒介可进一步包括微量辅助物质，例如湿润剂、乳化剂、表面活性剂、防腐剂或助悬剂等。
[0074]发明的有益效果
[0075]本发明通过外显子组测序技术确定了 PPPK的致病基因，这至少带来了以下有益效果。
[0076]一方面，本发明为PPPK的诊断和治疗提供了新的方法和工具。特别地，本发明所提供的诊断方法以及用于该方法的引物和/或探针和/或抗体可用于快速、有效地确定受试者是否患有PPPK或处于发展PPPK的风险中。
[0077]另一方面，本发明为PPPK的发病机制研究奠定了重要基础，为PPPK患者的治疗提供全新的理论依据。另外，PPPK的致病基因的鉴定对将来的遗传咨询、产前诊断及基因治疗具有重要意义。此外，利用PPPK致病基因所获得的疾病动物模型是研究PPPK的发病机制和治疗方法的有力工具。
[0078]下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
【专利附图】
【附图说明】
[0079]图1展示了实施例1中所使用的PPPK家系(PPPK703)的家系图谱。其中，〇表示正常女性；□表示正常男性；表示男性患者；?表示女性患者。其中，“+”表示对来自该受试者的样品进行了全基因组外显子测序，表示使用Sanger测序法对来自该受试者的样品进行了家系内点验证。
[0080]图2示例性显示了 PPPK703家系中患者和正常人的C0L14A1基因的Sanger测序法的测序结果，其中患者具有杂合突变:c.4505C — T (p.Prol502Leu)，而正常人在c.4505处具有纯合的碱基C，而不具有该杂合突变。
[0081]序列信息
[0082]本发明涉及的序列的信息提供于下面的表1中。
[0083]
【权利要求】
1.突变的C0L14A1基因，其与SEQID NO:1相比具有至少I个非沉默突变，并且所述突变的C0L14A1基因编码与野生型C0L14A1蛋白相比，功能异常(例如丧失了功能)的蛋白，或导致PPPK的发生； 例如，所述非沉默突变选自添加，缺失和置换中的一种或多种； 例如，所述非沉默突变位于C0L14A1基因的外显子区域； 例如，所述非沉默突变位于C0L14A1基因的第37个外显子； 例如，所述非沉默突变位于:c.4505 ； 例如，所述非沉默突变是:c.4505C — T0
2.一种载体，其包含权利要求1的突变的C0L14A1基因； 例如，所述载体选自克隆载体和表达载体； 例如，所述载体还包含与所述突变的C0L14A1基因可操作地连接的表达控制序列，例如但不限于启动子，增强子和终止子； 例如，所述载体还包含选择标记。
3.一种宿主细胞，其包含权利要求1的突变的C0L14A1基因或权利要求2的载体。
4.权利要求1的突变的C0L14A1基因或权利要求2的载体或权利要求3的宿主细胞的用途，其用于产生PPPK动物模型，或用于制备试剂盒，所述试剂盒用于产生PPPK动物模型。
5.诊断受试者是否患有PPPK或处于发展PPPK的风险中的方法，其包括， 1)获得来自所述受试者的核酸样品(例如，基因组DNA样品或总mRNA样品)； 2)在所述核酸样品中确定C0L14A1基因中是否存在导致C0L14A1基因编码功能异常的蛋白的非沉默突变；和 3) 如果存在所述非沉默突变，则判断受试者患有PPPK或处于发展PPPK的风险中； 例如，所述非沉默突变选自添加，缺失和置换中的一种或多种； 例如，所述非沉默突变位于C0L14A1基因的外显子区域； 例如，所述非沉默突变位于C0L14A1基因的第37个外显子； 例如，所述非沉默突变位于:c.4505 ； 例如，所述非沉默突变是:c.4505C — T0
6.用于诊断PPPK的诊断剂，其包含能够特异性扩增C0L14A1基因或其片段的引物，或能够特异性检测C0L14A1基因突变的探针，或能够特异性识别突变的C0L14A1蛋白的抗体或其抗原结合片段； 例如，所述引物能够特异性扩增C0L14A1基因的外显子，优选第37个外显子； 例如，所述引物的序列选自SEQ ID NO:73和74 ； 例如，所述引物是如SEQ ID NO:73和74所示的引物对; 例如，所述C0L14A1基因突变位于C0L14A1基因的外显子，优选第37个外显子，更优选地位于:c.4505 ； 例如，所述C0L14A1基因突变是c.4505C — T ； 例如，所述突变的C0L14A1蛋白包含氨基酸突变p.Prol502Leu ； 例如，所述引物、探针或抗体或其抗原结合片段是经标记的。
7.一种试剂盒，其包含权利要求6的诊断剂； 优选地，所述试剂盒还包含其他试剂，例如用于PCR的试剂(例如dNTP和聚合酶)，用于提取核酸的试剂，用于检测所述抗体或其抗原结合片段的二抗。
8.权利要求6的诊断剂在制备用于检测C0L14A1基因的突变和/或用于诊断PPPK的试剂盒中的用途。
9.用于治疗PPPK的治疗剂，其包含分离的野生型C0L14A1基因，或含有所述基因的载体，或野生型COL14AI蛋白，或特异性靶向突变的COL14AI基因的s iRNA，或特异性结合突变的C0L14A1蛋白的中和性抗体； 例如，所述野生型C0L14A1基因具有如SEQ ID NO:1所示的序列； 例如，所述突变的C0L14A1基因所包含的突变位于C0L14A1基因的外显子，优选第37个外显子，更优选地位于:c.4505,更优选地，所述突变是c.4505C — T ； 例如，所述突变的C0L14A1蛋白包含氨基酸突变p.Prol502Leu。
10.一种药物组合物，其包含权利要求9的治疗剂，和药学上可接受的载体和/或赋形剂。`
【文档编号】C12Q1/68GK103571848SQ201210282602
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年8月10日 优先权日:2012年8月10日
【发明者】张学军, 杨森, 孙良丹, 崔勇, 肖风丽, 张青, 肖晶晶, 王俊, 汪建, 杨焕明 申请人:安徽医科大学第一附属医院, 深圳华大基因科技有限公司