Bigh3在制备角膜营养不良动物模型中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及BIGH3在制备角膜营养不良动物模型中的应用。建立了一种遗传稳定、表型稳定的角膜营养不良模型，它通过将非人哺乳动物的Bigh3蛋白的第124位由Arg突变为His而实现。以本发明的转基因动物为研究模型，可在基因水平探讨防治角膜营养不良疾病的可行性，为开展颗粒状角膜营养不良的基因诊断及治疗提供了研究基础。
【专利说明】BIGH3在制备角膜营养不良动物模型中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】；更具体地，本发明涉及BIGH3在制备角膜营养不良动物模型中的应用。
【背景技术】
[0002]角膜营养不良(Corneal Dystrophy)是一组与基因遗传相关的原发性、进行性、致盲性角膜病变，是角膜遗传疾病中常见的类型，迄今为止，穿透性角膜移植术仍是治疗这种疾病的主要手段。但研究表明，穿透性角膜移植手术后仍会有角膜营养不良病情的复发和恶化(Yoo SY, Kim T, Lee SY, et al.A simple DNA chip for diagnosis of mostcommon corneal dystrophies caused by beta igh3gene mutations.Proceedings of thefrontiers in the convergence of Bioscience and Information Technologies，2007，69-74)o
[0003]目前已确定的与角膜营养不良相关的染色体有:1、5、9、10、12、16、17、20、21以及X 染色体。致病基因主要有 BIGH3、CHST6、K3、K12、M1S1、GSN 等(Klintworth GK.Advancesin the molecular genetics of corneal dystrophies.Am J Ophthalmol,1999,128 (6): 747-754)。角膜营养不良大多为常染色体显性遗传，少数为常染色体隐性遗传或X染色体连锁遗传。
[0004]研究表明多种类型的角膜营养不良都与BIGH3 (TGFBI)基因的突变有关，因此通常这些由BIGH3基因突变所产生的角膜营养不良被称为BIGH3基因相关性角膜营养不良。BIGH3基因又被称为TGFBI基因，定位于5q31 (人类5号染色体长臂3区I带)，基因跨度 30kb (Skonier J, Bennett K, Rothwell V, et al.Beta~igh3: a transforming growthfactor-beta responsive gene encoding a secreted protein that inhibits cellattachment invitro and suppresses the growth of CHO cells in nude mice[J].DNACell Biol 1994，13(6):571-584)。
[0005]目前已经发现BIGH3基因存在多个突变且与疾病发生相关，对BIGH3基因的多个突变点都有研究。但是，对于BIGH3基因突变仅停留在各突变位点产生的表型性状观察，而对于BIGH3基因突变导致的角膜营养不良的发病机制研究主要集中在研究其基因突变位点的检测，至今未见文献报道关于BIGH3基因突变是否能够成功建立疾病动物模型，以及是否可以获得稳定传代的疾病动物模型。
[0006]由于在人类先天性眼病的研究中存在着许多限制性因素，对于人类的先天性角膜疾病的发生机制及致病基因的克隆等研究难度较大，成功建立疾病动物模型将会对其发病机制的研究带来很大的帮助。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供BIGH3在制备角膜营养不良动物模型中的应用。
[0008]本发明的另一目的在于提供一种制备角膜营养不良动物模型的方法。[0009]在本发明的第一方面，提供一种制备转基因非人哺乳动物的方法，所述方法包括:
[0010](I)提供一表达构建物，该表达构建物由5’ 一 3’依次包含以下操作性连接的元件:PGK启动子，人突变型Bigh3基因，IRES基因；其中，所述的突变型Bigh3基因编码的人Bigh3蛋白的第124位由Arg突变为His ；
[0011](2)将(I)的表达构建物注射入非人哺乳动物受精卵细胞的雄原核，注射后的受精卵移植到假孕的非人哺乳动物的输卵管中，使其受孕生产，获得转基因非人哺乳动物。
[0012]在一个优选例中，所述的非人哺乳动物是小鼠或大鼠。
[0013]在另一优选例中，步骤(1)中，在IRES基因的3’端，还包括:EGFP基因。
[0014]在另一优选例中，步骤(1)中，在IRES基因的3’端，还包括:终止子。
[0015]在另一优选例中，所述的人突变型Bigh3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0016]在本发明的另一方面，提供所述的方法获得的转基因非人哺乳动物的用途，用于作为角膜营养不良的动物模型；或用于筛选预防和/或治疗角膜营养不良的药物。
[0017]在一个优选例中，所述的角膜营养不良是颗粒状角膜营养不良。
[0018]在本发明的另一方面，提供一种表达构建物，该表达构建物由5’ 一 3’依次包含以下操作性连接的元件:PGK启动子，人突变型Bigh3基因，IRES基因；其中，所述的突变型Bigh3基因编码的Bigh3蛋白的第124位由Arg突变为His。
[0019]在另一优选例中，在IRES基因的3’端，还包括:EGFP基因和/或终止子。
[0020]在另一优选例中，所述的表达构建物是表达载体。
[0021]在本发明的另一方面，提供所述的表达构建物的用途，用于制备角膜营养不良的转基因非人哺乳动物。
[0022]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1、PGK-BIGH3 (M) -1RES-EGFP 重组表达质粒示意图。
[0024]图2、pPGK_Bigh3 (M)-1RES-EGFP质粒线性化及电泳图；其中，
[0025]泳道1:质粒 DNA of pPGK_Bigh3 (M)-1RES-EGFP ；
[0026]泳道2:质粒DNA of pPGK_Bigh3 (M) -1RES-EGFP经XbaI酶切线性化用于显微注射的片段；
[0027]泳道MW:MBI GeneRuler Ikb DNA Ladder (晶美生物，Cat#SM0311)。
[0028]图3、RT-PCR鉴定转基因阳性F。代小鼠的情况，以人BIGH3基因阳性作为转基因阳性的标志。
[0029]图4、野生型小鼠的透明角膜。
[0030]图5、M53小鼠Fl代小鼠呈现出混浊的角膜。
[0031]图6、野生型小鼠的角膜的OCT图像。
[0032]图7、M53小鼠Fl代小鼠角膜的OCT图像。
【具体实施方式】[0033]本发明人经过深入而广泛的研究，建立了一种遗传稳定、表型稳定的角膜营养不良模型，它通过将非人哺乳动物的Bigh3蛋白的第124位由Arg突变为His而实现。以本发明的转基因动物为研究模型，可在基因水平探讨防治角膜营养不良疾病的可行性，为开展颗粒状角膜营养不良的基因诊断及治疗提供了研究基础。在此基础上完成了本发明。
[0034]本发明中，所述的非人哺乳动物可以选自:小鼠、大鼠、兔、狗、猿猴等；所述的非人哺乳动物在基因组的组成、个体的发育、代谢方式、器官解剖、疾病发病机制等方面和人类接近。优选的，所述的非人哺乳动物是鼠；更优选的是小鼠。
[0035]如本文所用，所述的“角膜营养不良”为一系列与家族遗传有关的原发性进行性角膜病变的总称。该病多数为常染色体显性遗性；原发于角膜。
[0036]如本文所用，所述的“颗粒状角膜营养不良”是角膜营养不良的一种，表现为角膜中央前弹力层下可见灰白色状混浊，合并成大小不等、界限清楚的圆形或不规则团块，形态各异，逐步向角膜实质深层发展，晚期混浊块之间出现弥漫性混浊，严重影响视力。
[0037]如本文所用，所述的“可操作地连接”或“操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如:启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
[0038]如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体，其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。
[0039]所述的转基因非人哺乳动物的构建方法包括:将一基因表达盒通过显微注射的方法导入动物的受精卵中，培育所述受精卵从而获得所述转基因动物；其中，所述表达盒从5’到3’端依次具有以下元件:PGK启动子，人突变型Bigh3基因，IRES基因；其中，所述的突变型Bigh3基因编码的Bigh3蛋白的第124位由Arg突变为His。
[0040]所述的PGK启动子为一种组成型启动子，可在多个组织中广泛表达，在转基因模型的构建中应用广泛。
[0041]所述的Bigh3基因是一个与角膜营养不良密切相关的基因。然而，人们还没有利用Bigh3基因突变来成功构建角膜营养不良的动物模型。这是由于Bigh3基因上多个位点均可能与角膜营养不良相关，而哪个或哪些位点进行突变可以成功获得性状典型的动物模型是未知的。
[0042]本发明所述的突变型Bigh3基因具有SEQ ID NO:1所述的核苷酸序列，其编码的Bigh3蛋白的第124位由Arg(R)突变为His。本发明还涉及所述“突变型Bigh3基因”的变异体，只要其编码的Bigh3蛋白保留与野生型接近的氨基酸序列且第124位为His。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽(突变型Bigh3蛋白)的功能。
[0043]作为本发明的优选方式，在所述的表达盒中，还可设置报告基因。所述的报告基因例如可选自:荧光素酶编码基因，绿色荧光蛋白编码基因、或红色荧光蛋白编码基因。更优选的，所述的报告基因是绿色荧光蛋白编码基因。
[0044]所述的基因表达还包括终止子，适当终止子的选择和构建是本领域熟知的技术，本发明中可以采用本领域已知的终止子。
[0045]所述的基因表达盒被导入动物的受精卵中，通过培育所述受精卵从而获得所述转基因动物。培育受精卵使之生长发育通常需要将受精卵重新移植到母体的子宫内进行，成熟后由母体分娩，从而获得可遗传的转基因的动物品系。所述的转基因动物还可通过交配，从而获得后代动物，可从后代动物中找出基因组中携带所述表达盒的动物。
[0046]本发明还提供了所述转基因动物的用途，所述的转基因动物用于筛选预防或治疗角膜营养不良的药物。
[0047]此外，本发明还提供了一种来源于所述转基因非人哺乳动物的细胞，所述的细胞的基因组中含有一基因表达盒，所述表达盒从5’到3’端依次具有以下元件:PGK启动子，人突变型Bigh3基因，IRES基因；其中，所述的人突变型Bigh3基因编码的Bigh3蛋白的第124位由Arg(R)突变为His。优选地，所述的细胞为体细胞。
[0048]作为本发明的优选方式，以小鼠作为模式生物，和人类相比，它无论在基因组的组成、个体的发育、代谢方式、器官解剖、疾病发病机制等都和人类非常接近，因此可良好地应用于人类疾病发病机制、药物药理学研究等方面。
[0049]筛选方法
[0050]本发明利用转基因技术，获得含有突变型Bigh3基因的转基因动物，可应用这种动物进行角膜营养不良疾病的研究以及防治药物的筛选。利用本发明构建的转基因动物模型筛选药物，既有分子或者细胞筛选模型在机制研究方面的便利，又有动物模型在疾病模拟和药物整体作用方面的优势，是药物筛选和评价的良好模型，并且对于研究和筛选复合药物，例如中药及其复方的药物筛选和研`究具有重要意义。
[0051]作为本发明的一个方面，提供了一种筛选具有防治角膜营养不良的潜在物质(如化合物)的方法，所述方法包括步骤:(I)提供角膜营养不良的转基因动物，所述的转基因动物的基因组中含有一基因表达盒，所述表达盒从5’到3’端依次具有以下元件:PGK启动子，人突变型Bigh3基因，IRES基因；其中，所述的突变型Bigh3基因编码的Bigh3蛋白的第124位由Arg(R)突变为His ;⑵将候选物质给予步骤(1)的转基因动物；和(3)检测动物的角膜状况，若所述候选物质的角膜状况有显著改善，则表明该候选物质是防治角膜营养不良疾病的潜在物质。
[0052]上述筛选出的潜在物质可构成一个筛选库，可对这些物质进行进一步的细胞实验、动物试验、和/或临床试验，以进一步确证所述潜在物质的防治角膜营养不良的作用。
[0053]与利用传统的动物模型进行药物筛选相比较，利用本发明的转基因动物模型进行筛选能够实现成体通量地评价有关候选物质。
[0054]本发明的主要优点在于:
[0055](a)本发明获得的角膜营养不良动物模型的遗传稳定、表型稳定。
[0056](b)用本发明方法获得的动物模型是可育的，发育正常；Bigh3 (R124H)突变基因的表达改变可以孟德尔规律遗传给后代小鼠。
[0057]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0058]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0059]实施例1、PGK-BIGH3 (M) -1RES-EGFP重组表达质粒的构建
[0060]以PGK-Up和PGK-Down为引物，以PL451质粒(获自上海南方模式生物科技发展有限公司)DNA为模板，运用TaKaRa Ex Taq进行PCR，琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增片段，得到两侧分别具有XhoI和SalI酶切位点的0.5kb的PGK启动子片段。
[0061]PGK启动子(Promoter)构建引物序列:
[0062]PGK-Up:CGACTCGAGACCGGGTAGGGGAGGCGCTTT(SEQ ID NO:2)；
[0063]PGK-Down:GGCGTCGACTCGAAAGGCCCGGAGATGAGG(SEQ ID NO:3)。
[0064]将前述回收获得的PGK启动子片段与质粒pCAG-1RES-EGFP (获自上海南方模式生物科技发展有限公司)进行连接，经XhoI和SalI双酶切、连接、转化，获得pPGK-CAG-1RES-EGFP 重组质粒。
[0065]质粒pPGK-CAG-1RES-EGFP经PhBI酶切，琼脂糖凝胶电泳分离去除其中的CAG-启动子片段，并胶回收载体片段，载体片段经T4连接酶连接反应，转化感受态大肠杆菌以获得pPGK-1RES-EGFP重组质粒。
[0066]人Bigh3 cDNA,与pMD_T18 (获自上海捷瑞生物技术有限公司)连接得到pMD-T18-Bigh3-Mutation质粒(上海捷瑞生物技术有限公司制备)，DNA序列测定证实内含的Bigh3 cDNA片段具有预期的140G — A的突变，该Bigh3Mutation cDNA片段经SalI和SacII双酶切pMD-T18-Bigh3-Mutation和电泳纯化获得，并与SalI和SacII双酶切的pPGK-1RES-EGFP载体片段连接、转化，获得的重组质粒载体命名为pPGK-Bigh3 (M) -1RES-EGFP。该质粒载体结构经DNA序列测定证实构建正确。
[0067]人突变型Bigh3的cDNA序列(SEQ ID NO:1)如下:
[0068]TTAGTCGACGCCACCATGGCGCTCTTCGTGCGGCTGCTGGCTCTCGCCCTGGCTCTGGCCCTGGGCCCCGCCGCGACCCTGGCGGGTCCCGCCAAGT |CAC| CCTACCAGCTGGTGCTGCAGCACAGCAGGCTCCGGGGCCGCCAGCACGGCCCCAACGTGTGTGCTGTGCAGAAGGTTATTGGCACTAATAGGAAGTACTTCACCAACTGCAAGCAGTGGTACCAAAGGAAAATCTGTGGCAAATCAACAGTCATCAGCTACGAGTGCTGTCCTGGATATGAAAAGGTCCCTGGGGAGAAGGGCTGTCCAGCAGCCCTACCACTCTCAAACCTTTACGAGACCCTGGGAGTCGTTGGATCCACCACCACTCAGCTGTACACGGACCGCACGGAGAAGCTGAGGCCTGAGATGGAGGGGCCCGGCAGCTTCACCATCTTCGCCCCTAGCAACGAGGCCTGGGCCTCCTTGCCAGCTGAAGTGCTGGACTCCCTGGTCAGCAATGTCAACATTGAGCTGCTCAATGCCCTCCGCTACCATATGGTGGGCAGGCGAGTCCTGACTGATGAGCTGAAACACGGCATGACCCTCACCTCTATGTACCAGAATTCCAACATCCAGATCCACCACTATCCTAATGGGATTGTAACTGTGAACTGTGCCCGGCTGCTGAAAGCCGACCACCATGCAACCAACGGGGTGGTGCACCTCATCGATAAGGTCATCTCCACCATCACCAACAACATCCAGCAGATCATTGAGATCGAGGACACCTTTGAGACCCTTCGGGCTGCTGTGGCTGCATCAGGGCTCAACACGATGCTTGAAGGTAACGGCCAGTACACGCTTTTGGCCCCGACCAATGAGGCCTTCGAGAAGATCCCTAGTGAGACTTTGAACCGTATCCTGGGCGACCCAGAAGCCCTGAGAGACCTGCTGAACAACCACATCTTGAAGTCAGCTATGTGTGCTGAAGCCATCGTTGCGGGGCTGTCTGTAGAGACCCTGGAGGGCACGACACTGGAGGTGGGCTGCAGCGGGGACATGCTCACTATCAACGGGAAGGCGAT
CATCTCCAATAAAGACATCCTAGCCACCAACGGGGTGATCCACTACATTGATGAGCTACTCATCCCAGACTCAGCCA
AGACACTATTTGAATTGGCTGCAGAGTCTGATGTGTCCACAGCCATTGACCTTTTCAGACAAGCCGGCCTCGGCAAT
CATCTCTCTGGAAGTGAGCGGTTGACCCTCCTGGCTCCCCTGAATTCTGTATTCAAAGATGGAACCCCTCCAATTGA
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CCCTGGAAACTCTGGGCGGCAAAAAACTGAGAGTTTTTGTTTATCGTAATAGCCTCTGCATTGAGAACAGCTGCATC
GCGGCCCACGACAAGAGGGGGAGGTACGGGACCCTGTTCACGATGGACCGGGTGCTGACCCCCCCAATGGGGACTGT
CATGGATGTCCTGAAGGGAGACAATCGCTTTAGCATGCTGGTAGCTGCCATCCAGTCTGCAGGACTGACGGAGACCC
TCAACCGGGAAGGAGTCTACACAGTCTTTGCTCCCACAAATGAAGCCTTCCGAGCCCTGCCACCAAGAGAACGGAGC
AGACTCTTGGGAGATGCCAAGGAACTTGCCAACATCCTGAAATACCACATTGGTGATGAAATCCTGGTTAGCGGAGG
CATCGGGGCCCTGGTGCGGCTAAAGTCTCTCCAAGGTGACAAGCTGGAAGTCAGCTTGAAAAACAATGTGGTGAGTG
TCAACAAGGAGCCTGTTGCCGAGCCTGACATCATGGCCACAAATGGCGTGGTCCATGTCATCACCAATGTTCTGCAG
CCTCCAGCCAACAGACCTCAGGAAAGAGGGGATGAACTTGCAGACTCTGCGCTTGAGATCTTCAAACAAGCATCAGC
GTTTTCCAGGGCTTCCCAGAGGTCTGTGCGACTAGCCCCTGTCTATCAAAAGTTATTAGAGAGGATGAAGCATTAGT
AACCGCGGGCG
[0069]注:在野生型基础上第突变点--第139-141位:C￡C CAC
[0070]pPGK-Bigh3 (M) -1RES-EGFP质粒DNA，经XbaI酶切、酚和氯仿分离纯化后，用于显微注射制备转基因小鼠。pPGK-Bigh3 (M)-1RES-EGFP质粒电泳结果如图2。
[0071]实施例2、制备转基因小鼠
[0072]选择小鼠品系C57BL/6J (上海南方模式生物研究中心)，采用4~5周龄的杂交一代SPF级清洁小鼠(Fl)，采用雄原核注射方法，将上述构建的表达质粒线性化后注射到雄原核中；注射后的受精卵在体外培养I天后，选取分裂正常的受精卵移植到假孕小鼠的输卵管中，使其受孕并等待出生。突变小鼠出生后，取少量尾端组织提取DNA，用PCR方法验证是否有转基因的导入，取PCR阳性的小鼠为首建者小鼠，分别和野生型C57BL/6J小鼠配种，建立稳定的背景一致的转基因小鼠品系。
[0073]结果，显微注射出生81只R)代小鼠，于2-3周龄剪尾抽提基因组DNA，经PCR筛选，得到5只转基因阳性小鼠。阳性小鼠和3只野生型小鼠(Neg)再次剪尾抽提基因组DNA，双盲法再次进行PCR检测，确认该5只为转基因阳性小鼠(M25、M28、M32、M53、M81)，其中雄性2只，雌性3只。转基因小鼠的PCR鉴定结果的电泳图如图3。
[0074]转基因小鼠鉴定引物序列(人R124H突变bigh3基因):
[0075]bigh3-Up:GACTAGCCCCTGTCTATCAAAAGTT(SEQ ID NO:4)；
[0076]bigh3-Down:AACCTCGACTAAACACATGTAAAGC(SEQ ID NO:5)。
[0077]目前R)代小鼠与野生型C57BL/6J杂交，PCR鉴定转基因阳性小鼠共40只，肉眼可及角膜有白斑共10只，角膜及前节OCT表现如图5和图7，呈现角膜全层增厚，中央基质层内出现边界清晰的灰白色混浊块的表型。作为参照，野生型小鼠角膜如图4和图6所示。
[0078]综上，本发明人成功建立BIGH3基因突变的颗粒状角膜营养不良的小鼠模型，小鼠角膜上有明显的白斑病变，其为典型的角膜营养不良症状。并且，这种病变能稳定遗传。
[0079]在本发明提 及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【权利要求】
1.一种制备转基因非人哺乳动物的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)提供一表达构建物，该表达构建物由5’一3’依次包含以下操作性连接的元件:PGK启动子，人突变型Bigh3基因，IRES基因；其中，所述的突变型Bigh3基因编码的人Bigh3蛋白的第124位由Arg突变为His ； (2)将(I)的表达构建物注射入非人哺乳动物受精卵细胞的雄原核，注射后的受精卵移植到假孕的非人哺乳动物的输卵管中，使其受孕生产，获得转基因非人哺乳动物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非人哺乳动物是小鼠或大鼠。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，在IRES基因的3’端，还包括:EGFP基因。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，在IRES基因的3’端，还包括:终止子。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的人突变型Bigh3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示。
6.权利要求1所述的方法获得的转基因非人哺乳动物的用途，用于作为角膜营养不良的动物模型；或用于筛选预防和/或治疗角膜营养不良的药物。
7.一种表达构建物，其特征在于，该表达构建物由5’一 3’依次包含以下操作性连接的元件:PGK启动子，人突变型Bigh3基因，IRES基因；其中，所述的突变型Bigh3基因编码的Bigh3蛋白的第124位由Arg突变为His。
8.如权利要求7所述的表达构建物，其特征在于，在IRES基因的3’端，还包括:EGFP基因和/或终止子。
9.如权利要求7所述的表达构建物，其特征在于，所述的表达构建物是表达载体。
10.权利要求7-9任一所述的表达构建物的用途,用于制备角膜营养不良的转基因非人哺乳动物。
【文档编号】C12N15/89GK103571874SQ201210282649
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年8月9日 优先权日:2012年8月9日
【发明者】王方, 廖昕, 崔红平 申请人:上海市第十人民医院