提高肌苷产量的促进剂及其添加方法

专利名称：提高肌苷产量的促进剂及其添加方法
技术领域：
本发明涉及肌苷，特别涉及提高肌苷产量的促进剂及其添加方法。
背景技术：
肌苷，英文为Inosine，又称之为次黄嘌呤核苷，是次黄嘌呤与核糖的缩合物，其化学名称为9- β -D-呋喃核糖次黄嘌呤。其中，在次黄嘌呤碱基Ν-9的位置上，通过糖苷键的形式联结了以呋喃形式存在的核糖的第I位碳原子。肌苷的分子式为CltlH12N4O5，相对分子质量为268. 23。常见的肌苷为白色针状结晶或呈无水粉末状固体，无臭略带苦味，常温常压下熔点为218°C，易溶于水，20°C时在水中的溶解度约为2. 065，在饱和水溶液中约含肌苷15 g/L ;也易溶于稀盐酸或氢氧化钠，微溶于乙醇，不溶于氯仿。肌苷在食品和医药领域有着非常广泛的应用价值。在食品领域中，肌苷是食品中美味的呈味物，其含量常常作为衡量食品新鲜度的特征指标之一。肌苷是各种调味食品，例如味精、酱油等的营养助鲜剂，同时也是食品工业中有效增鲜剂5’ -肌苷酸、呈味核苷酸二钠的主要原料之一。在医药领域中，肌苷可以直接透过细胞膜，是一种细胞复活剂，具有刺激细胞、增强细胞代谢等功能。医学上通常用于预防和治疗心脏和肝脏等器官的细胞损伤，有助于肝功能恢复正常，并能预防及解除由血防药物引起的对心脏或肝脏的副作用，是治疗冠心病、肝炎、白血球减少症等的良效药物。由于其毒副作用小而且安全性较好，同时也是抗生素生产的原料。此外，异丙肌苷是一种正在开发的肌苷衍生物，除具有抗病毒、增强记忆作用外，还具有延缓衰老的功能。肌苷的生产方法基本上可以分为3大类化学分解法、酶解法以及微生物发酵法。化学合成法生产肌苷设备条件要求较高，合成肌苷工艺比较复杂，而且由于大量使用有机溶剂，造成严重的环境污染，因而被限制投入生产。酶解法由于生产成本较高且造成一定程度的资源浪费，影响其在肌苷工业的大规模生产。微生物发酵法生产肌苷的成本较低，对环境无污染且效益较高，因此，微生物发酵法是目前生产肌苷的主要采用方法。近年来，随着韩国、日本等国家肌苷产业的不断发展，对我国肌苷市场形成了巨大的冲击，国内肌苷发酵产业所面临的挑战日益严峻。因此，优化肌苷发酵方法，提高肌苷得率，降低生产成本，进而提升我国肌苷的市场竞争力，成为肌苷发酵行业亟待解决的问题。目前尝试了很多提高肌苷产量的方法，主要包括菌种选育、基因工程改造、发酵条件的优化等等。此外，由添加促进剂引起的代谢流迁移也可以为肌苷产量的提高提供了一条新思路。工业生产上通常采用枯草芽孢杆菌发酵法生产肌苷，添加促进剂来改进肌苷发酵的方法成为了热门课题。至今已被研究的促进剂不多，如柠檬酸钠，葡萄糖酸钙等，但关于促进剂的组合添加方面仍没有报道。

发明内容
本发明目的在于提供提高肌苷产量的促进剂及其添加方法。所述提高肌苷产量的促进剂包括如下化合物中至少一种次黄嘌呤，NaF, CaCl2,葡萄糖酸钙，柠檬酸钠。所述提高肌苷产量的促进剂包括如下化合物中至少二种次黄嘌呤，NaF, CaCl2,葡萄糖酸钙，柠檬酸钠。所述提高肌苷产量的促进剂包括如下化合物中至少三种次黄嘌呤，NaF, CaCl2,葡萄糖酸钙，柠檬酸钠。所述提高肌苷产量的促进剂包括如下化合物中至少四种次黄嘌呤，NaF, CaCl2,葡萄糖酸钙，柠檬酸钠。所述提高肌苷产量的促进剂包括如下化合物次黄嘌呤，NaF, CaCl2，葡萄糖酸钙，柠檬酸钠。所述提高肌苷产量的促进剂在培养基中的浓度为次黄嘌呤为O. 15%，NaF 2 mg/L, CaCl2 10 mg/L，葡萄糖酸I丐15 g/L，朽1檬酸钠3 g/L。 所述提高肌苷产量的促进剂的添加方法包括将提高肌苷产量的促进剂加入培养基中，用含有该促进剂的培养基发酵培养枯草芽孢杆菌，从而生产肌苷。所述培养基为适宜枯草芽孢杆菌生长的常规培养基。本发明采用在培养基中添加不同的促进剂(柠檬酸钠、葡萄糖酸钙、氟化钠、次黄嘌呤及氯化钙)来提高枯草芽孢杆菌发酵生产的肌苷产量。本发明发现组合添加不同的促进剂时，肌苷产量会比单一添加促进剂时的肌苷产量高。由于不同的促进剂对肌苷合成的作用机理不同，不同的促进剂间存在着优势互补和相互促进作用，组合添加时会呈现出叠加效应。本发明提出添加促进剂来改善肌苷产量的方法，组合添加比单一添加促进剂时更易引发枯草芽孢杆菌内代谢流的迁移，尤其当同时添加O. 15%的次黄嘌呤、2 mg/L的氟化钠、10 mg/L的氯化钙及15 g/L的葡萄糖酸钙时，肌苷产量达到了 14.01 g/L，是对照组肌苷产量的4. 39倍。本发的提高了枯草芽孢杆菌生产肌苷的产率，降低肌苷单位生产成本，增强肌苷在市场上的竞争力。


图I为柠檬酸钠对肌苷积累的影响。在图I中，横坐标柠檬酸钠浓度，单位为g/L，左纵坐标为肌苷产量，单位为g/L，右纵坐标为生物量，以发酵液在600 nm处的吸光度(OD600)表示，曲线▲为肌苷产量，曲线 为生物量。图2为葡萄糖酸钙对肌苷积累的影响。在图2中，横坐标葡萄糖酸钙浓度，单位为g/L，左纵坐标为肌苷产量，单位为g/L，右纵坐标为生物量，以发酵液在600 nm处的吸光度(OD600)表示，曲线▲为肌苷产量，曲线 为生物量。图3为NaF添加对肌苷发酵的影响。在图3中，横坐标NaF浓度，单位为mg/L，左纵坐标为肌苷产量，单位为g/L，右纵坐标为生物量，以发酵液在600 nm处的吸光度(0D_)表示，曲线▲为肌苷产量，曲线 为生物量。图4为次黄嘌呤的添加对肌苷发酵的影响。在图4中，横坐标次黄嘌呤浓度(％)，左纵坐标为肌苷产量，单位为g/L，右纵坐标为生物量，以发酵液在600 nm处的吸光度(0D_)表示，曲线▲为肌苷产量，曲线 为生物量。图5为CaCl2的添加对肌苷发酵的影响。在图5中，横坐标CaCl2浓度，单位为mg/L，左纵坐标为肌苷产量，单位为g/L，右纵坐标为生物量，以发酵液在600 nm处的吸光度(OD600)表示，曲线▲为肌苷产量，曲线 为生物量。图6为不同种类的促进剂对肌苷发酵的影响图。在图6中，横坐标为促进剂的不同组合，其含义分别为A.空白，B. 2 mg/L NaF,C. O. 15%次黄嘌呤，D. 2 mg/L NaF +0. 15%次黄嘌呤，E. O. 15%次黄嘌呤+2 mg/L NaF+15 g/L葡萄糖酸钙；F. O. 15%次黄嘌呤+2 mg/L NaF+10 mg/L CaCl2+15 g/L 葡萄糖酸钙；G. O. 15% 次黄嘌呤+2 mg/L NaF+3 g/L 柠檬酸钠+15 g/L葡萄糖酸|丐+10 mg/L CaCl2 ;左纵坐标为相对肌苷产量(％),右纵坐标为相对蛋白和核酸产量，a为相对肌苷产量，b为相对蛋白含量，c为相对核酸含量。
具体实施例方式为使本领域的技术人员能进一步了解本发明，下面列举本发明实施例，并配合说明书附图，详细说明本发明的技术方案。需强调的这些较佳实施例并非本发明技术方案所有可能实施方式的穷举，故不用于限制本发明的保护范围。I.材料
1.1菌种
枯草芽抱杆菌(Bacillus subtil is)，所述枯草芽抱杆菌(Jiac i I Ius购自
中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC)，编号为 CICC20201、CICC20943、CICC20944、CICC20947、CICC20958 中的一种或几种。本实施例优选CICC20958 ;
1.2培养基
(1)斜面培养基
蛋白胨 1.0 g，牛肉膏 O. 3 g, NaCl 0.5 g，琼脂 2 g，水 100 mL，pH 7.2 ；
(2)种子培养基(g/L)
葡萄糖20，蛋白胨10，酵母粉15，玉米浆12，NaCl 2. 5，尿素2，pH 7.2;
(3)摇瓶发酵初始培养基(g/L)
葡萄糖 140，玉米浆 16，酵母粉 15，尿素 13，(NH4)2SO4 22，MgSO4 ·7Η20 2，K2HPO4 5，CaCO320 (分消),pH 7. O ；
(4)摇瓶发酵培养基(g/L)
葡萄糖 140，玉米浆 15，酵母膏 17，尿素 15，(NH4)2SO4 20，MgSO4 ·7Η20 I，K2HPO4 5，CaCO320 (分消),pH 7. O ；
2. 方法
2. I.菌种活化
将保存的菌种接种于斜面培养基上，37 1恒温培养18 h ；
2.2液体种子培养
从活化18 h的斜面上取一环菌种转接到装有25 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，220 r/min, 34 °C培养 18 h ；
2.3液体发酵培养
取培养18 h的新鲜种子液，以5%接种量接入装有35 mL培养基的250 mL三角瓶中，220 r/min，34°C 培养 96 h ；
2.4测定方法2. 4. I生物量的测定；
取O. 2 mL的发酵液用蒸馏水稀释30倍，蒸馏水作空白，用分光光度计在660 nm波长处测定其吸光度值；
2. 4. 2肌苷产量的测定
利用高效液相色谱法(HPLC法)进行测定；
2.4.3残糖浓度的测定
取发酵液样品3500 r/min离心5 min,将上清液逐级稀释后取ImL,加入3 mL的DNS (3，5-二硝基水杨酸)试剂，沸水浴煮沸15 min显色，取出立即冷却，再用蒸馏水稀释至
25mL，于520 nm波长处测其吸光度值。样品糖浓度可从葡萄糖标准曲线计算可得；
2. 4. 4氨基氮浓度的测定
采用甲醛滴定法取一定体积的发酵液，离心后取上清，用O. 05 mol/L的NaOH标准溶液滴定PH值为8. 2，然后加入适当的甲醛溶液，混匀后继续用O. 05 mol/L的NaOH标准溶液滴定PH值为9. 2，记录所用NaOH溶液体积；
2.4.5蛋白质浓度的测定
采用考马斯亮兰法取一定体积的发酵液，先经过离心得到菌体，然后洗涤菌体，破壁后得到一定体积的裂解液，适当稀释后加入考马斯亮蓝，利用分光光度计在595 nm下测其吸光度值；
2. 4. 6核酸浓度的测定
采用三氯乙酸抽提法取一定体积的发酵液，离心后弃去上清，在沉淀中加入三氯乙酸充分搅拌，再离心除去上清；重复操作，沉淀加入三氯乙酸充分搅拌，并在80 1水浴中搅拌抽提，冷却后再经过离心弃去沉淀，上清液用5%三氯乙酸(TCA)适当稀释，利用核酸蛋白快速测定仪测定其核酸浓度；
2.. 5数据分析方法
所有数据采用统计学软件SPSS 17. O进行差异显著性分析(显著水平a=0. 05)；
3结果与分析
3.I单一促进剂的选择及对肌苷发酵的影响；
采用枯草芽孢杆菌；在发酵培养基中添加不同的促进剂；摇瓶培养条件为34°C，25mL/250 mL三角瓶，220 r/min, 96 h。实验结果及对比情况见下图I-图3 ;
从图I可知，添加适量的柠檬酸钠对枯草芽孢杆菌生物量、肌苷产量均有一定的提高作用，其中当添加量为3 g/L时，肌苷的发酵产量比对照组增加13.9%。从图2可以看出，添加适量的葡萄糖酸钙对枯草芽孢杆菌生物量、肌苷产量也有明显的提高作用，其中当添加量为15 g/L时，肌苷发酵产量比对照组增加27.8%。添加柠檬酸钠和葡萄糖酸钙能提高枯草芽孢杆菌生产肌苷的机理，是由于抑制了 EMP途径而增大HMP途径引发代谢流迁移造成的结果；
根据类似的调节机理，除了以上两种促进剂以外，NaF、次黄嘌呤和CaCl2的添加对肌苷的积累也有显著的影响(见图3-图5);
从图3可知，适量的添加NaF对肌苷产量具有显著的提高作用，当添加2 mg/L时，肌苷 产量比对照组提高了 23. 9% ;但过量的NaF会对枯草芽孢杆菌的生物量有较强的抑制作用。这可能是由于NaF是EMP途径的强烈抑制剂，EMP途径的抑制将导致代谢流在EMP，HMP途径和TCA循环之间的重新分配，故由此引发的代谢流迁移导致了肌苷合成途径代谢通量的增大，从而提高了肌苷产量；
由图4可知，添加适量的次黄嘌呤对枯草芽孢杆菌的生长没有明显的促进作用，但对肌苷产量的积累却又显著地提高作用，尤其当添加O. 15%次黄嘌呤时，肌苷产量比对照组提高了 89. 9%，这与次黄嘌呤是肌苷合成途径的前体物质有关。加入的次黄嘌呤为枯草芽孢杆菌提供了完整的嘌呤环，从而使得枯草芽孢杆菌便于通过补救途径大量合成肌苷；
此外，添加不同浓度的CaClj^肌苷的积累也有一定的影响(见图5。从图5可知，适量添加氯化钙对枯草芽孢杆菌的生长以及肌苷的积累均有一定的促进作用。其中，当添加5mg/L的CaCl2时，生物量可以达到最大值；而当加入10 mg/L的CaCl2时，肌苷产量达到最大值，比对照组的肌苷产量高出了 23. 1%。这主要是因为CaCl2的添加可以提高5'-核苷酸酶的活力，而5'-核苷酸酶是肌苷合成途径中的关键酶，5'-核苷酸酶活力的增加有助于肌苷的积累，因此CaCl2的适量添加可以提高肌苷的产量；
3.2两种有效促进剂的复合添加对肌苷发酵的影响
根据上述实验，申请人选择了柠檬酸钠、葡萄糖酸钙、NaF、次黄嘌呤、CaCl2这五种对肌苷积累有显著促进作用的有效促进剂。但由于不同的促进剂对肌苷积累的促进作用不同，复合添加不同组合的促进剂时也许存在着叠加效应，所以复合添加不同组合的促进剂时也许比添加单一的促进剂对肌苷产量的积累会有更明显的促进作用。两种不同组合的促进剂对肌苷积累的影响见表I ;
表I两种不同组合的有效促进剂的添加对肌苷积累的影响
权利要求
1.提高肌苷产量的促进剂，其特征在于，所述提高肌苷产量的促进剂包括如下化合物中至少一种次黄嘌呤，NaF, CaCl2，葡萄糖酸钙，柠檬酸钠。
2.如权利要求I所述提高肌苷产量的促进剂，其特征在于，所述提高肌苷产量的促进剂包括如下化合物中至少二种次黄嘌呤，NaF, CaCl2，葡萄糖酸钙，柠檬酸钠。
3.如权利要求I所述提高肌苷产量的促进剂，其特征在于，所述提高肌苷产量的促进剂包括如下化合物中至少三种次黄嘌呤，NaF, CaCl2，葡萄糖酸钙，柠檬酸钠。
4.如权利要求I所述提高肌苷产量的促进剂，其特征在于，所述提高肌苷产量的促进剂包括如下化合物中至少四种次黄嘌呤，NaF, CaCl2，葡萄糖酸钙，柠檬酸钠。
5.如权利要求I所述提高肌苷产量的促进剂，其特征在于，所述提高肌苷产量的促进剂包括如下化合物次黄嘌呤，NaF, CaCl2，葡萄糖酸钙，柠檬酸钠。
6.如权利要求I至5任一项所述的提高肌苷产量的促进剂，其特征在于，所述提高肌苷产量的促进剂在培养基中的浓度为次黄嘌呤为0. 15%，NaF 2 mg/L, CaCl2 10 mg/L，葡萄糖酸钙15 g/L，柠檬酸钠3 g/L。
7.提高肌苷产量的促进剂的添加方法，其特征在于包括将提高肌苷产量的促进剂加入培养基中，用含有该促进剂的培养基发酵培养枯草芽孢杆菌，生产肌苷。
全文摘要
提高肌苷产量的促进剂及其添加方法，涉及肌苷，提供提高肌苷产量的促进剂及其添加方法。所述提高肌苷产量的促进剂包括如下化合物中至少一种次黄嘌呤，NaF，CaCl2，葡萄糖酸钙，柠檬酸钠。所述提高肌苷产量的促进剂在培养基中的浓度为次黄嘌呤为0.15%，NaF2mg/L，CaCl210mg/L，葡萄糖酸钙15g/L，柠檬酸钠3g/L。本发明采用在培养基中添加不同的促进剂来提高枯草芽孢杆菌发酵生产的肌苷产量。本发明提高了枯草芽孢杆菌生产肌苷的产率，降低肌苷单位生产成本，增强肌苷在市场上的竞争力。
文档编号C12R1/125GK102796788SQ20121028334
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月10日 优先权日2012年8月10日
发明者肖安风, 蔡慧农, 倪辉, 杨尚彤, 李利君, 杨远帆, 黄高凌, 杜希萍 申请人:集美大学