专利名称：维生素c二步发酵法中小菌的选育方法
技术领域：
本发明涉及生物与医药技术领域，特别是涉及一种维生素C 二步发酵法中小菌的选育方法。
背景技术：
维生素C(VitanunC，Vc)是人体营养必需的维生素，其不仅作为重要的医药产品用于治疗多种疾病，也广泛用于食品、饲料及化妆品中。随着维生素C应用范围的增加，市场需求量日益增大，使人们对VC生产技术不断地进行研究、改进。目前，维生素C的发酵生产采用二步法实现，即采用芽孢杆菌(俗称大菌，主要有巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌)和氧化葡糖杆菌(俗称小菌)混菌发酵，其中小菌为产酸菌，可以产生2-酮基-L-古龙酸，但单独存在产酸能力较小；而大菌不 产酸，但与小菌共同发酵明显促进小菌产酸，为小菌伴生菌，整个发酵中小菌起到关键的作用。研究证实，大菌营养体在变成芽孢过程中，释放细胞内含物，使蛋白质含量增加，可以促进小菌生长，缩短小菌生长的延迟期。现有技术中，VC 二步发酵法中小菌的选育是通过将种子液分离至平板培养，收集一定数量的小菌混合液，经物理诱变或者化学诱变后，涂布至平板培养，然后收集诱变后小菌混合液接斜面，搭接大菌培养，最后进行筛选。由于小菌个体微小，如单菌落不进一步进行增值培养，仅仅采用现有技术，将诱变后小菌收集一定数量混合进行整体考察，因为不是逐一筛选，致使未变异菌落与变异菌落、正突变与负突变的菌落无法单独体现，所以目的菌株优良特性很难得到充分表达，给筛选工作增加难度。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种有效表达菌种诱变的效果，使具有各类特性的菌株性能一一得到体现，从而很容易获得目的菌株，降低筛选难度的维生素C 二步发酵法中小菌的选育方法。为实现上述发明目的所采取的技术方案为一种维生素C 二步发酵法中小菌的选育方法，其特征是将诱变后的小菌单菌落，采用增殖培养的方法进行逐一筛选。上述小菌的选育过程为将处于对数生长期的大小菌混合种子液分离至平板培养，收集一定数量的小菌进行诱变，后涂布至平板，搭接大菌进行平板培养，培养结束后选取经诱变得到的小菌单菌落逐一分别涂布至平板，搭接大菌进行增殖培养，再逐一接斜面，搭接大菌进行斜面培养，最后摇瓶筛选目的菌株。所述大小菌混合种子液是指将包含有大小菌混合菌的出发菌株储存液接种至种子培养基中，在25-32°C下200r/min振荡培养至对数生长期，其所用的种子培养基为L_山梨糖I. 5，玉米浆O. 3，蛋白胨O. 5，尿素O. 5，碳酸钙O. 3，pH值为7. 0，121°C，30min灭菌，单位 g/I00ml。
所述小菌诱变采用紫外灯照射诱变。上述搭接大菌是指在已经涂布小菌的培养基上接种大菌。上述摇瓶筛选是指将斜面培养的菌种接种至发酵培养基中，在25-32°C下200r/min振荡培养3-4天，检测发酵液中古龙酸含量及残余L-山梨糖浓度，留种。本发明将经诱变后的小菌单菌落，采用增殖培养的方法进行筛选，使具有各类特性的菌株性能一一得到体现，成功地淘汰了非目的菌株而得到目的菌株，使获得优良性能目的菌株的几率得到提高，与现有技术相比，VC 二步菌小菌单菌落选育的方法，诱变效果得到充分表达，目前已成功地得到一株周期短，产酸高、糖酸转化率高的菌株。其在摇瓶混菌发酵中古龙酸的质量浓度比现有选育方法获得的菌株提高5%以上，糖酸转化率提高3-5%以上。
具体实施方式
下面所例举的具体实施例仅仅是对本发明的解释说明，不构成对本发明的任何限制。I选育的步骤将处于对数生长期的种子液分离至平板培养，收集一定数量的小菌进行诱变后涂布至平板，搭接大菌进行平板培养，培养结束后选取经诱变得到的小菌单菌落逐一分别涂布至平板，搭接大菌进行增殖培养，再逐一接斜面，搭接大菌进行培养斜面，摇瓶筛选目的菌株。实验数据统计分析，初筛留种。2选育筛选过程2. I大小菌的分离取出发菌株储存液(大小菌的混菌)接种至种子培养基中(使用种子培养基为(g/100ml) :L-山梨糖I. 5，玉米浆O. 3，蛋白胨O. 5，尿素O. 5，碳酸钙O. 3，pH值为7.0，121°C，30min灭菌)。25_32°C下200r/min振荡培养16hr左右，生长至对数生长期，即细胞大量繁殖，代谢活动旺盛的时期。取上述种子液稀释至10-4-10-5浓度涂布到分离平板(所用培养基为(g/100ml)L-山梨糖 I. 5，玉米浆 O. 3，蛋白胨 O. 5，尿素 0.4, KH2PO4O. 1，MgSO4 · 7H20 O. 02，琼脂 2. 0，pH 值为 7. 0,121°C灭菌 30min)。25-32。。培养 2-3 天。2. 2小菌菌悬液的制备及处理将2. I平板中小菌，用接种环刮下，收集制成小菌混悬液并稀释，镜检可见单个菌体。用15w紫外灯(有效波长2537埃)距离30cm照射I分钟左右，死亡率90-95%，进行处理后涂布至平板(所用培养基为(g/100ml) :L-山梨糖I. 5，玉米浆0.3，蛋白胨0.5，尿素 0. 4，KH2PO4O. 1，MgSO4 · 7H20 0. 02，琼脂 2. O, pH 值为 7. 0,121。。灭菌 30min)。用接种针挑取大菌均匀接至已涂布小菌的平板中，25-32°C培养2-3天。2. 3小菌增殖培养将2.2中培养的小菌单菌落，用接种环逐一分别挑至平板(所用培养基为(g/100ml) L-山梨糖 1.5，玉米浆 0.3，蛋白胨 0.5，尿素 0·4，ΚΗ2Ρ040· LMgSO4 ·7Η20 0. 02,琼脂2. 0，pH值为7. 0，121°C灭菌30min)，用接种针挑取大菌均匀接至已涂布小菌的平板中，25-32 °C增殖培养2-3天。2. 4小菌斜面培养
将增殖后的小菌逐一接斜面(所用培养基为(g/100ml) :L_山梨糖I. 5，玉米浆O. 3，蛋白胨 O. 5，尿素 O. 4，KH2PO4O. 1，MgSO4 · 7H20 O. 02，琼脂 2. 0，pH 值为 7. 0，121°C灭菌30min)，用接种针挑取大菌均匀接至已涂布小菌的斜面中，25-32°C培养2_3天。2. 5摇瓶筛选将2. 4中的斜面取2环接种至发酵培养基(所用培养基为(g/100ml) :L_山梨糖8.0，玉米浆 L 5，尿素 1.2，pH 值为 7. 0，121°C灭菌 30min)，25-32。。下 200r/min 振荡培养3-4天。检测发酵液古龙酸含量及残余L-山梨糖浓度，留种。本次试验获得2株菌株提高率在5%以上。摇瓶结果如下
权利要求
1.一种维生素C ニ步发酵法中小菌的选育方法，其特征是将诱变后的小菌单菌落，采用増殖培养的方法进行逐一筛选。
2.按照权利要求I所述的维生素Cニ步发酵法中小菌的选育方法，其特征在于上述小菌的选育过程为将处于对数生长期的大小菌混合种子液分离至平板培养，收集一定数量的小菌进行诱变，后涂布至平板，搭接大菌进行平板培养，培养结束后选取经诱变得到的小菌单菌落逐一分别涂布至平板，搭接大菌进行増殖培养，再逐一接斜面，搭接大菌进行斜面培养，最后摇瓶筛选目的菌株。
3.按照权利要求2所述的维生素Cニ步发酵法中小菌的选育方法，其特征在于所述大小菌混合种子液是指将包含有大小菌混合菌的出发菌株储存液接种至种子培养基中，在25-32°C下200r/min振荡培养至对数生长期，其所用的种子培养基为L-山梨糖I. 5，玉米浆O. 3，蛋白胨O. 5，尿素O. 5，碳酸钙O. 3，pH值为7. O，121°C，30min灭菌，单位g/100ml。
4.按照权利要求2所述的维生素Cニ步发酵法中小菌的选育方法，其特征在于所述小菌诱变采用紫外灯照射诱变。
5.按照权利要求2所述的维生素Cニ步发酵法中小菌的选育方法，其特征在于上述搭接大菌是指在已经涂布小菌的培养基上接种大菌。
6.按照权利要求2所述的维生素Cニ步发酵法中小菌的选育方法，其特征在于上述摇瓶筛选是指将斜面培养的菌种接种至发酵培养基中，在25-32°C下200r/min振荡培养3 —4天，检测发酵液中古龙酸含量及残余L-山梨糖浓度，留种。
全文摘要
本发明涉及一种维生素C二步发酵法中小菌的选育方法，该方法是将处于对数生长期的种子液平板培养，选择其中的小菌进行诱变后涂布至平板，搭接大菌进行平板培养，然后涂布至平板，搭接大菌进行增殖培养，再逐一接斜面，搭接大菌进行斜面培养，摇瓶筛选目的菌株。本发明将经诱变后的小菌单菌落，采用增殖培养的方法进行筛选，使具有各类特性的菌株性能一一得到体现，成功地淘汰了非目的菌株而得到目的菌株，使获得优良性能目的菌株的几率得到提高。
文档编号C12N15/01GK102851275SQ201210308418
公开日2013年1月2日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月28日
发明者李学兵, 郭惠芬, 陈荔, 杨玉芳, 蒋鸿 申请人:宁夏启元药业有限公司