专利名称：一种四环素高产菌的选育方法
技术领域：
本发明属于生物与医药技术领域，特别是涉及一种四环素高产菌的选育方法。
背景技术：
四环素是从放线菌金色链霉菌(Streptomyces aureofa-ciens)的培养液分离出来的抗菌物质，对革兰氏阳性菌、阴性菌、立克次体、滤过性病毒、螺旋体属乃至原虫类都有很好的抑制作用，是一种广谱抗菌素，对结核菌、变形菌等则无效。其作用机制是与核蛋白体的30S亚单位结合，从而阻止氨酰基-RNA同核糖核蛋白体结合。现有技术中，四环素自然选育流程为确定试验方案一选择出发株一制备平板分离培养基一分离平板的孵制一用具准备和灭菌一制备单孢子悬浮液一分离培养一挑单菌落接斜面一摇瓶初筛一初筛留种一接复筛斜面一摇瓶复筛一复筛留种一性状考察一闻广 菌种复筛留种。上述方法存在着流程繁琐、选育周期长、工作量大、需要专用设备(恒温振荡器)、能耗大、成本高、筛选效率低等缺陷。
发明内容
本发明的目的就在于提供一种有效缩短菌种选育周期，提高筛选效率，降低筛选成本的四环素高产菌的选育方法。在菌种诱变筛选过程中，常常由于细胞壁的存在而影响其对外界理化因子的敏感性，从而大大减弱了诱变剂对遗传物质的诱变效应，导致突变率低，无法满足生产需求。基于此，本发明采用溶菌酶对细胞脱壁后再进行EDTA处理的方法，从而选育出四环素高产优质菌株，具体方案为将培养好的出发菌株加水制成孢子悬浮液，摇瓶振荡培养，过滤稀释后，将悬浮液分装于四个试管中，加入等量的EDTA分别作用3、4、5和7min，加入溶菌酶作用3分钟后，统计正变率和死亡率，选出正变率高的作用时间，然后做进一步的摇瓶筛选，选出提高率高的菌株。所述摇瓶振荡培养时间15 25分钟。所述溶菌酶加入量O. 2 O. 8ml。所述EDTA的加入浓度为O. 225 O. 295mol/L，加入浓度如果低于所给范围，不足以消除金属离子和有机杂质对比色反应的干扰，如果高于所给范围，则会影响菌种的突变。所述摇瓶筛选为挑选单菌落进行斜面培养，后挖块接种子瓶和发酵瓶，摇床振荡培养6 7天后放瓶测定化学效价，选取高效价菌株进行摇瓶复筛和特性考察。本发明与紫外线、离子注入等方法处理菌种相比较，具有操作简单、费用低、安全性高、对环境污染小、菌种突变率高，所产菌株摇瓶效价高等特点。本发明诱变菌种作用时间分别为3、4、5和7min，统计正变率和死亡率。结果显示，作用处理时间5min时菌种正变率最高，为较好的选择，这时的死亡率一般在15%左右。在平板分离培养基上分离的单菌落，菌落形态变化较小，但菌种的正变率较高。经EDTA(乙二胺四乙酸二钠盐)+溶菌酶处理后将选出的菌株进行摇瓶复筛，摇瓶效价较对照提高了20%。
具体实施例方式(I)孢子悬浮液的制备向生长好的金色链霉菌茄瓶斜面中加15m无菌水，制成孢子悬浮液，移入一含有玻璃珠的三角瓶中，摇床振荡培养20min，过滤、稀释。⑵诱变处理把稀释液分装于四支已灭过菌的试管中各Iml，然后同时加入EDTA溶液O. 6ml，分别作用3分钟，4分钟，5分钟和7分钟，再加溶菌酶O. 8ml作用3分钟后。将处理过的孢子液梯度稀释至10_5，取每个稀释度的O. 1,0. 3和O. 5ml孢子液涂平板(琼脂培养基)，在最 适温度33 35°C条件下培养90 IOOhr。(3)分别统计正变率和死亡率，选出正变率高的作用时间为5min的平板，挑选单菌落接于斜面培养基(琼脂2.5%，麸皮4 %，MgSO4O. 015%，(NH) 2ΗΡ040 . 02 %,K2HPO4O. 02% )上，在最适温度33 35°C培养90 IOOhr后，挖块接种子瓶和发酵瓶，摇床振荡培养7天后放瓶测定化学效价。挑选高效价菌株制备成冷冻液，进行摇瓶复筛、特性考察。挑选出了高单位菌株，摇瓶效价较对照提高了 20%。本次试验突变率、死亡率结果统计如下
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-^ψι本次试验摇瓶效价及提高率突变率结果统计如下
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结论H 3# I 丨·株留种进if传代考察e
权利要求
1.一种四环素高产菌的选育方法，其特征是将培养好的金色链霉菌菌株加水制成孢子悬浮液，摇瓶振荡培养，过滤稀释后，将悬浮液分装于四个试管中，加入等量的EDTA溶液分别作用3、4、5和7min，加入溶菌酶作用3分钟后，梯度稀释至10_5，取每个稀释度的O. I、O.3和O. 5ml孢子液涂平板培养，统计正变率和死亡率，选出正变率高的作用时间，然后做进ー步的摇瓶筛选，选出提高率高的菌株。
2.按照权利要求I所述的四环素高产菌的选育方法，其特征是所述摇瓶振荡培养时间15 25分钟。
3.按照权利要求I所述的四环素高产菌的选育方法，其特征是所述溶菌酶加入量O.2 O. 8ml ο
4.按照权利要求I所述的四环素高产菌的选育方法，其特征是所述EDTA溶液浓度为O.225 O. 295mol/L。
5.按照权利要求I所述的四环素高产菌的选育方法，其特征在于所述摇瓶筛选为挑选单菌落进行斜面培养，后挖块接种子瓶和发酵瓶，摇床振荡培养6 7天后放瓶測定化学效价，选取高效价菌株进行摇瓶复筛和特性考察。
全文摘要
本发明涉及一种四环素高产菌的选育方法，其特征是将培养好的金色链霉菌菌株加水制成孢子悬浮液，摇瓶振荡培养，过滤稀释后，将悬浮液分装于四个试管中，加入等量的EDTA溶液分别作用3、4、5和7min，加入溶菌酶作用3分钟后，后梯度稀释至10-5，取每个稀释度的0.1、0.3和0.5ml孢子液涂平板培养，统计正变率和死亡率，选出正变率高的作用时间，然后做进一步的摇瓶筛选，选出提高率高的菌株。本发明采用溶菌酶对细胞脱壁后再进行EDTA处理的方法，从而选育出四环素高产优质菌株，与紫外线、离子注入等方法处理菌种相比较，具有操作简单、费用低、安全性高、对环境污染小、菌种突变率高，所产菌株摇瓶效价高等特点。
文档编号C12N15/01GK102851274SQ20121030841
公开日2013年1月2日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月28日
发明者李学兵, 陈卓 申请人:宁夏启元药业有限公司