一种用于删除转基因水稻中选择标记的热激方法
【专利摘要】生物【技术领域】的一种用于删除转基因水稻中选择标记的热激方法。本发明涉及一种用于删除热激蛋白启动子驱动Cre基因表达的转基因水稻中选择标记的热激方法，包括：将转基因水稻后代幼苗置于光照培养箱中，44℃热激处理6h；然后转移到28℃、光照强度为1200lx、湿度为75％的培养室中，使其恢复生长；经过20h的恢复生长后，开始下一次热激处理；并重复上述处理操作6次。该方法在不伤害植株的前提下能有效删除转基因水稻中的选择标记，删除效率可达到80％以上，同时避免标记基因对植物生长发育带来负面影响，亦为目的基因在转基因水稻中的应用奠定基础。
【专利说明】一种用于删除转基因水稻中选择标记的热激方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于删除转基因水稻中选择标记的热激方法，该方法在不伤害植株的前提下能有效删除转基因植株中的选择标记，从而避免标记基因对植物生长发育带来负面影响，亦为目的基因在转基因植物中的应用奠定基础。
[0002]发明背景
[0003]随着植物基因工程技术的发展，许多种类的植物可以通过遗传转化方法使其性状得以改良或作为生物反应器生产有用的蛋白。为了便于区分将转化植株与非转化植株，选择标记基因成为转化载体的必要组成部分。目前使用较多的选择标记基因有抗生素抗性基因和除草剂抗性基因，如卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、草甘膦除草剂抗性基因等。
[0004]然而，一旦获得稳定的转基因植物，选择标记基因便失去了在转化植株中继续存在的必要性，并且还可能产生以下不利因素:1.选择性标记基因的存在可能一起转基因植物中目的基因发生基因沉默。2.环境安全问题。主要是选择标记基因在不同生物间的水平转移，可能引起对生态平衡的破坏。3.转基因食品的安全性问题。近年来，随着转基因植物的商业化推广，由此衍生而来的转基因食品数量在不断增加。虽然目前尚无确切的证据表明转基因食品会对人体产生不利的影响，但是目的基因以外的其他基因的存在尤其是抗性基因的存在会引起公众对健康的担心。
[0005]目前，利用共转化系统、转座子系统、位点特异性重组系统等均可实现取出转基因植物中的选择标记基因的目的。位点特异性系统主要由2个组分组成:位点特异性重组酶和重组位点。主要有Cre/loxP或者Ftp/FRT两个重组系统，并且已发展成为在体内、外进行遗传操作的有力工具。
[0006]Cre/loxP系统来源于Fl噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。该系统含有两种成分:①一段长34bp的DNA序列，含有两个13bp的反向重复序列和一个8bp的核心序列。这段34bp序列是重组酶识别的位点,被称为1xP位点(locus of X-over in P1)。②Cre重组酶(cyclization-recombination),它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发1xP位点的DNA重组。利用该重组系统可以通过Cre重组酶识别特定DNA位点，将特定的一段DNA顺序(处于同向1x位点之间的DNA片段)删除掉。如果将一个阻断序列置于启动子与读码框之间，这一基因就不会表达。一旦删除了阻断序列，这个基因就会在启动子的调控下表达。这里Cre基因的启动就通过对阻断序列的删除起到一个开关的作用。利用这一技术北京大学林忠平教授的实验室利用诱导性表达的启动子驱动Cre重组酶的表达，例如利用热激(heat shock)诱导表达启动子使得转基因植物中重组酶基因在热激反应之下将事先设计好的标记基因从转基因植物中删除。
[0007]本研究所涉及的Cre/loxP系统就是利用热激(heat shock)诱导表达启动子使得转基因植物中重组酶Cre基因表达，在导入反义的脂肪氧化酶基因及标记基因之后，在热激处理之下将1x位点之间的标记基因，连同Cre基因(启动子、Cre编码序列及终止子)一起删除。余下的是水稻胚乳专一性启动子驱动下的反义的水稻脂肪氧化酶基因。即我们获得的转基因水稻，选出所需株系后，做种子的热激处理，可删除转基因植株中两个1x之间的DNA片段。由于热激处理对植物材料伤害较大，且每次热激周期较长，因此要在保证热激效果的前提下摸索合适的热激次数和温度，确保在对转基因植株的伤害降到最低的前提下提高转基因植株中的选择标记删除效率。李岩(2011)在《ipt基因促进矮牵牛遗传转化效率及热激启动子驱动基因删除》(基因组学与应用生物学)中研究了热诱导外源基因删除表达载体在矮牵牛中的基因删除效果，报道了目前最高的热激删除效率约为43.8 %，删除效率仍需进一步提闻。
【发明内容】
[0008]本发明针对现有技术中存在的不足，目的在于探索一种能有效删除转基因水稻中的选择标记的方法并确保对转基因植株的伤害降到最低，为培育具有生物安全的转基因水稻新品种提供一个新途径，为安全、高效的转基因育种奠定基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1激启动子驱动Cre基因载体工作过程原理图。
[0010]图2农杆菌介导转化籼稻及抗性植株再生流程。A、愈伤组织诱导，B、愈伤组织继代，C、愈伤组织筛选，D、抗性愈伤组织，E、预分化，F、分化成苗，G、生根培养，H、炼苗，1、移栽田间
[0011]图3抗性植株中Bar基因的PCR检测。M:2000bp DNAmarker ； 1-12:抗性植株；13:野生型植株；14:阳性对照
[0012]图4转基因植株的Southern杂交检测。1:阳性对照；2:非转基因植株；3_7:转基因植株
[0013]图5转基因植株中Bar基因的RT-PCR检测。1:非转基因植株；2_8:转基因植株
`[0014]图6两种不同的的热激敲除方法。A:转基因种子经过催芽；B:四叶期的转基因植株
[0015]图7转基因植株标记基因Bar的热激敲除。
[0016]图8经热激实验后的转基因植株中Bar基因的PCR检测。M:2000bp DNAmarker ；1:阳性对照；2-14:转基因植株
[0017]图9经热激实验后的转基因植株中Cre基因的PCR检测。M:2000bp DNAmarker ；1:阳性对照；2-14:转基因植株
[0018]图10标记基因Bar的Southern杂交检测。1-5:经热激处理后的转基因植株；6:未经热激处理的转基因植株；7:非转基因植株；8:质粒
[0019]图11转基因植株中标记基因Cre的RT-PCR检测。1:未经热激处理的转基因植株；2-8:经热激处理后的转基因植株
[0020]图12.转基因植株中标记基因Bar的RT-PCR检测。1:未经热激处理的转基因植株；2-8:经热激处理的转基因植株
【具体实施方式】
[0021]下文通过具体实施案例对本发明做进一步说明
[0022]实施案例I[0023]农杆菌介导水稻反义脂肪氧化酶转化籼稻
[0024]利用定位重组系统(site specific recombination system)可以通过一种特定的重组酶识别特定DNA排序的位点，将特定的一段DNA顺序(处于同向1x位点之间的DNA片段)删除掉。目前应用最多的是Cre重组酶识别的1x位点的Cre/lox系统。如果将一个阻断序列置于启动子与读码框之间，这一基因就不会表达。一旦删除了阻断序列，这个基因就会在启动子的调控下表达。这里Cre基因的启动就通过对阻断序列的删除起到一个开关的作用。利用这一技术北京大学林忠平教授的实验室利用诱导性表达的启动子热激(heatshock)诱导表达启动子驱动Cre重组酶的表达，使得转基因植物中重组酶基因在热激反应之下将事先设计好的标记基因从转基因植物中删除。
[0025]研究利用类似的设计，在导入反义的脂肪氧化酶1οχ3基因及标记基因之后，在热激处理之下将1x位点之间的标记基因，连同Cre基因(启动子、Cre编码序列及终止子)一起删除。余下的是水稻谷蛋白启动子驱动下的反义的水稻脂肪氧化酶基因。即我们获得的转基因水稻，选出所需株系做种子的热激处理，可删除转基因植株中两个1x之间的DNA片段，包含35S启动子驱动下的bar基因，以及Cre基因(受热激启动子驱动)的表达框架。我们用下图(图1)显示删除标记基因和Cre基因的过程。图中绿黄紫的框架是谷蛋白启动子驱动下的1οχ3基因。1xP之间的部分在热激处理之下被删除。
[0026]随后利用农杆菌介导转化的方法将携带有反义脂肪氧化酶基因的Cre/lox系统转化籼稻，经过愈伤组织诱导、愈伤组织侵染、抗性愈伤组织筛选、预分化、分化、生根等再生过程获得相应的抗性植株(图2)。
[0027]实施案例2
[0028]转水稻反义脂肪氧化酶基因植株的获得
[0029]对上述抗性植株进行PCR、Southern blot以及RT-PCR等分子检测，获得转基因植株。
[0030]目前通过农杆菌介导方法对获得的124株抗性植株进行Bar基因的PCR检测，其中96株检测到436bp目的条带(图3)。上游引物Barl:GCCGCAGGAACCGCAGGAGTGGAC ;下游引物Bar2:TCAGATCTCGGTGACGGGCAGGACC，扩增条件:以水稻基因组DNA为模板进行，PCR扩增反应体系为 10 μ L: 10Xbuffer I μ L、Mg2+I μ L、dNTP(10mmol.I/1)。.8μ L、primer:Barl (10 μ mo I.L-1) 0.4 μ L、primer:Bar2 (10 μ mo I.L-1) 0.4 μ L、DNA I μ L、r TaqDNA 聚合酶(5u.μ I/1) 0.2 μ UddH2O ;反应条件为:94°C预变性 5min, I 个循环；94°C变性 30s,65°C退火30s、72°C延伸lmin，35个循环，72°C延伸lOmin，I个循环；4°C保存。
[0031]在PCR阳性的植株中，米用罗氏的DIGHigh Prime DNA Labeling and DetectionStarter KitII进行Southern blot检测PCR阳性植株中外源基因在受体基因组中的插入情况(图4)。利用内切酶XhoI对20yg的水稻总DNA进行酶切，待酶切完全后，在0.8%的琼脂糖凝胶中进行电泳分离，然后转移到尼龙膜上。设计Bar基因片段上的引物，BarF:5，-GCCGCAGGAACCGCAGGAGTGGAC-3，；BarR:5，-TCAGATCTCGGTGACGGGCAGGACC-3，，并以 Bar基因的质粒PCR产物为探针进行杂交实验。结果表明外源基因已经以不同的拷贝数插入到受体的基因组中。
[0032]在PCR阳性的植株中，进一步进行Bar基因的RT-PCR分子检测(图5)。在Microtube 管中配置下列混合液:dNTP Mixture (IOmM) I μ L、01igo DT Primer (2.5Mm) I μ、Or Random 6mers(20 μ M)I μ L> Or Specific Primer(2 μ M)> Template RNA 1-8 μ L> RNaseFree dH20 up tolO μ L ;反应体系:在PCR仪上进行变性、退火反应:65°C 5min、4°C保存；离心数秒钟使模板RNA、引物等的混合液聚集于Microtube管底部；在上述Microtube管中配制下列反转录反应液:上述变性、退火后反应液10 μ L>5 XPrimeScriptTM Buffer4 μ L、RNase Inhibitor (40U/ μ L) 0.5 μ L> PrimeScriptTM RTase (for 2 step) 0.5 μ L、RNase Free dH20 5 μ L、Total Volume 20 μ L ;在PCR仪上按下列条件进行反转录反应:30 °C IOmin,42 °C (~50 °C ) 15 ~30min、95 °C 5min、4 °C 保存；PCR 反应:10 XbufferI μ L> Mg2+ I μ L> dNTP (1 Ommol.Ι71) 0.8 μ L> primer:Barl (10 μ mo I.I71) 0.4 μ L> primer:Bar2 (10 μ mo I.L-1) 0.4 μ L、cDNAl μ L、rTaqDNA 聚合酶(5u.μ L-1) 0.2 μ L、ddH20 5.2 μ L、Total 10 μ L ;反应条件为:94°C预变性5min，I个循环；94°C变性30s、65°C退火30s、72°C延伸lmin，35个循环，72°C延伸lOmin，I个循环；4°C保存。结果表明转基因植株中外源基因能够进行正常转录。
[0033]实施案例3
[0034]热激删除标记基因及删除效率统计
[0035]3.1转基因植株热激处理
[0036]本发明比较了 两种方案的热激方法(图6)。
[0037]方案一:将上述转基因水稻后代种子30°C催芽后，直接进行系列的热激处理操作。取50粒刚催芽萌发的转基因水稻苗置于光照培养箱中，40°C热激处理6h ;然后转移到28°C、光照强度为12001x、湿度为75%的培养室中中，使其恢复生长；经过20h的恢复生长后，开始下一次热激处理；并重复上述处理操作6次。方案一重复三次试验。
[0038]方案二:将上述转基因水稻后代种子催芽后，待其生长到四叶期。随后进行系列的热激处理操作。将生长到四叶期的水稻苗置于光照培养箱中，44°C热激处理6h ;然后转移到28°C、光照强度为12001x、湿度为75%的培养室中，使其恢复生长；经过20h的恢复生长后，开始下一次热激处理；并重复上述处理操作6次(图7)。方案二重复三次试验。
[0039]3.2标记基因的PCR检测
[0040]转基因植株热激结束后，取适量叶片，提取基因组DNA，分别进行标记基因Bar和Cre的PCR检测(图8、图9)。Bar基因的检测方法如实施案例2。Cre基因的检测条件如下，Cre-F:GGAAAATGCTTCTGTCCGTTTG ;Cre-R:GGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTG。扩增条件:以水稻基因组DNA为模板进行，PCR扩增反应体系为10yL:10Xbuffer I μ L、Mg2+I μ L> dNTP (1 Ommol.I/1) 0.8 μ L> primer:BarI (10 μ mol.I/1) 0.4 μ L> primer:Bar2 (10 μ mol.L-1) 0.4 μ L、DNA I μ L、rTaqDNA 聚合酶(5u2.μ L-1) 0.2 μ L、ddH20 ;扩增反应条件为 94°C 5min,94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin，共 35 个循环，最后 72°C延伸 lOmin。PCR扩增产物在0.8%的TAE琼脂糖中进行电泳分析。
[0041]采用方案一的热激方法进行处理的150株转基因植株中，有113株检测到标记基因Bar和Cre的条带；采用方案一的热激方法进行处理的150株转基因植株中，只有25株检测到标记基因Bar和Cre的条带，初步说明部分转基因植株中的标记基因Bar和Cre已被敲除。基因热激删除率=热激后基因删除株数/热激株数，经统计方案一的敲除率为24.67%，方案二的敲除率为83.30%。
[0042]表1转基因植株标记热激删除效率对比
【权利要求】
1.一种用于删除转基因水稻中选择标记的热激方法，该方法步骤包括:(1)、转基因水稻种子催芽后，使其生长到四叶期；(2)、将四叶期的转基因水稻幼苗置于光照培养箱中，44°C热激处理6h；(3)、将上述热激处理后的转基因水稻转移到28°C培养室中，使其恢复生长20h；(4)、20h后，按照(2)-(4)步骤重复操作6次。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述温度大约为44°C。
3.如权利要求1所述的方法，其中热激处理后应使植株恢复生长约20h。
4.如权利要求1所述的方法，其中重复操作次数约6次。
【文档编号】C12N15/82GK103798124SQ201210444388
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月7日 优先权日:2012年11月7日
【发明者】张建福, 谢华安, 许惠滨 申请人:张建福, 谢华安, 许惠滨