虾蟹螺原体病原的原位杂交检测探针及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种虾蟹病原螺原体的原位杂交检测探针及试剂盒。所述探针的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。所述两条寡核苷酸探针用地高辛标记，与虾蟹组织切片中螺原体16SrDNA杂交结合后通过免疫学的抗原抗体反应扩大信号，然后经酶反应显色；能直观地将病原检测与其病理变化结合起来；在高效、准确检测螺原体的同时，可由样本切片上分析感染率和感染强度；由于探针与16SrDNA的杂交是特异的，且信号经过了逐级放大，所以较常规的染色观察检测灵敏、精确；而且检测结果杂交显色后的切片可长期保存。
【专利说明】虾蟹螺原体病原的原位杂交检测探针及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种虾蟹螺原体病原的原位杂交检测探针及检测用试剂盒。
【背景技术】
[0002]中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)俗称河蟹,是我国特有的水产养殖珍品，但随着养殖集约化和规模化发展，各种病害已经成为危害养蟹业的重要难题。在河蟹众多疾病中，“颤抖病”最为常见、危害也最严重，该病自1994年首次在江苏被发现后，相继在上海、浙江、安徽、江西等地暴发，并呈逐年加剧趋势，后来几乎蔓延到全国各河蟹养殖地区。2008年农业部已将该病列为新修订的“一二三类动物疫病病种名录”中。克氏原螯虫下(Procambarus clarkii),俗称小龙奸,是另一种非常有潜力的淡水养殖品种，江苏、湖北、安徽等地均将其列为重点推荐养殖品种，发展非常迅速，而虾蟹混养则为当前的主要养殖模式之一。研究发现，在暴发“颤抖病”的虾蟹混养的池塘中，伴随着中华绒螯蟹的大量死亡，克氏原螯奸也连续出现大规模死亡，经查明螺原体(spiroplasma)是引起它发病的病原[1]，此外，其他水产养殖甲壳动物如南美白对虾[I]、罗氏沼虾也相继发现了螺原体病原[2]，由此可见，螺原体病原已经成为当前虾蟹重要的新型病原。目前超薄切片电子显微镜观察是使用较多的检测方法，但该方法对操作技术与仪器设备要求较高，且实验周期长，较难普及；PCR也是另一种常用的检测方法[3]，该方法虽然检测较为简单，灵敏度高，但不能直观的观察和证明螺原体的包涵体，而且易于因操作中的模版污染而出现假阳性。原位杂交假阳性率低，从直观性、准确性和灵敏度综合考虑是一种其它任何方法都无法替代的检测方法，但至今未见有关水产螺原体病原的原位杂交检测方法。(参考文献:[l]Wang, W, Gu, W, Ding, Z, et al.A novel Spiroplasma pathogen causingsystemic infection in the crayfish Procambarus clarkii (Crustacea:Decapod), inChina[J].FEMS microbiology letters,2005, 249, 131-137;[2]Liang T, Li X,Du Jie, etal.1dentification and isolation of a spiroplasma pathogen from diseasedfreshwater prawns,Macrobrachium rosenbergii, in China:A new freshwatercrustacean host.Aquaculture 2011, 318:1-6, 2011.[3]Ding, Z, Bi, K, ffu, T, et al.Asimple PCR method for the detection of pathogenic spiroplasmas in crustaceansand environmental samples[J].Aquaculture, 2007，265，49-54.X
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种用于高灵敏度、高可信度同时又非常直观的虾蟹螺原体病原的早期检测的探针，并提供检测试剂盒。
[0004]本发明根据螺原体在细菌分类学上具有保守功能的16S rDNA序列中的两段特有的DNA序列设计合成了两条寡核苷酸探针，建立了螺原体病原的原位杂交检测方法，该探针与健康克氏原螯虾及患白斑综合征病毒病(WSSV)的克氏原螯虾样品均无特异性信号，而与螺原体感染阳性样品有明显的深棕色信号，具有很好的特异性，且能直观地将检测到的病原螺原体与其引起的病理变化结合起来，从而确定该病原的感染部位、感染程度，了解其致病力。该方法具有优异的直观性、准确度和灵敏度，实现了本发明的目的。
[0005]本发明所述的两条螺原体病原的原位杂交检测探针，其序列如下
[0006](I) 5’-GTTCTTCCCTTACAACAGACCTTTACAATCCGA-3’ (SEQ ID N0.1)
[0007](2) 5’-GTACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACTAGGGT-3’(SEQ ID N0.2)。
[0008]本发明提供了一种虾蟹病原螺原体的原位杂交检测方法，其技术方案包括如下步骤:
[0009](I)用地高辛标记的特异的探针与组织切片中螺原体16S rDNA杂交结合；
[0010](2)进行原位杂交检测:
[0011]a.所述的地高辛标记的探针结合生物素化鼠抗地高辛，再结合链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，最后再结合生物素化过氧化物酶；
[0012]b.经酶反应显色；
[0013]所述的特异的探针是根据螺原体在细菌分类学上具有保守功能的16S rDNA序列中的两段特有的DNA序列设计合成的两条寡核苷酸探针，合成后于每一探针的3’末端标记地高辛；所述的两条 寡核苷酸探针的序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。
[0014]虾蟹组织样品和通常的原位杂交检测一样需要固定、切片、灭活样品内源性的过氧化物酶和消化蛋白以暴露DNA等处理，可以采用通常的方法；用地高辛标记的探针可以采用免疫学的抗原抗体反应扩大反应信号、二甲基联苯胺(DAB)酶反应显色，本发明在这方面有一定改进。
[0015]本发明提供一种用于虾蟹病原螺原体的原位杂交检测方法的试剂盒，该试剂盒包括上述特异探针和原位杂交试剂。
[0016]所述的原位杂交试剂包括:DAB显色试剂盒，博士德公司，武汉；多聚赖氨酸，Sigma,美国；焦碳酸二乙酯(DEPC), Sigma,美国；多聚甲醒干粉，Sigma,美国；梓檬酸三钠，Sigma,美国；氯化钠，Sigma,美国。
[0017]有益效果:
[0018](I)能直观地将螺原体病原与其引起的病理变化结合起来；
[0019](2)在高效、准确检测螺原体的同时可根据样本切片分析感染率和感染强度，这是其它分子生物学检测方法所不具有的特点；
[0020](3)由于探针与16S rDNA的杂交是特异的，且信号经过了逐级放大，所以较常规的染色检测灵敏、精确；
[0021](4)本发明中，显色后的切片可以长期保存。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1，健康克氏原螯虾阴性对照；
[0023]图2，患白斑综合征病毒病(WSSV)克氏原螯虾阴性对照；
[0024]图3，感染螺原体克氏原螯虾原位杂交检测结果，箭头示深棕色包涵体(X 1000)。
【具体实施方式】
[0025]下列实验及操作实例是进一步对本发明的说明，不应该当作对本发明的限制。[0026]实施例1:
[0027]克氏原螯虾样品
[0028]发病克氏原螯虾于2011年7-9月取自江苏省内发生严重死亡的养殖场，平均重量21.7g，头胸甲长42.5mm (样本量n=30)。健康克氏原螯虾于2011年7月，取自南京克氏原螯虾养殖场，平均重量20.lg，头胸甲长41.0mm (样本量n=24)。
[0029]健康克氏原螯虾通过常规光镜、电镜观察和PCR检测，确定是无螺原体感染，作为阴性对照；感染白斑综合征病毒病(WSSV)的克氏原螯虾同时作为阴性对照；发病克氏原螯虾经光镜、电镜观察和PCR检测确定是有螺原体感染后，作为阳性对照。使用的原位杂交主要试剂、材料:
[0030](1) DAB显色试剂盒,博士德公司，武汉
[0031](2)多聚赖氨酸，Sigma,美国
[0032](3)焦碳酸二乙酯(DEPC)，Sigma，美国
[0033](4)原位杂交专用盖玻片，Sigma，美国
[0034](5)含DEPC的多聚甲醛固定液:1000mL蒸馏水中加Na2HPO4.12H20 36g，多聚甲醛干粉40g，加热搅拌溶解后加NaH2PO4.2H20 3g，pH 7.0 ;趁热加DEPC至终浓度0.1% ；
[0035](6)含DEPC的1%多聚赖氨酸:取多聚赖氨酸稀释成1%，加DEPC至终浓度0.1% ；
[0036](7)载玻片用前需泡于1%多聚赖氨酸中5分钟后晾干，4°C保存备用；
[0037](8)2X柠檬酸三钠-NaCl缓冲液(SSC):1OOOmL蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠8.8g ；
[0038](9)0.5XSSC:300mL 蒸馏水加 IOOmL 2X SSC ；
[0039](10)0.2XSSC:270mL 蒸馏水加 30mL 2 X SSC
[0040]样品固定及切片制备:
[0041](1)取克氏原螯虾易感染组织鳃于含0.P/oDEPC的4%多聚甲醛固定2小时后，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次30分钟，然后脱水、透明、石蜡包埋、切片；
[0042](2)切片(需同时做阳性和阴性对照)，经常规石蜡脱水后，加3%的H2O2室温处理10分钟，然后用蒸馏水洗涤2次。
[0043]合成特异探针:
[0044]根据螺原体在细菌分类学上具有保守功能的16S rDNA序列(AY920929.1)中的两段特有的DNA序列(对应的碱基区域分别为228 - 260,600-632)设计合成的两条寡核苷酸探针，合成后于每一探针的3’末端标记地高辛，探针序列为:
[0045](1) 5’-GTTCTTCCCTTACAACAGACCTTTACAATCCGA-3’ (SEQ ID N0.1)
[0046](2) 5’-GTACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACTAGGGT-3’ (SEQ ID N0.2)
[0047]原位杂交:
[0048](1) 1mL 3%的柠檬酸加2滴浓缩的胃蛋白酶，混匀，滴加于切片，37°C消化蛋白10分钟，然后用0.5mol/L磷酸盐缓冲液洗3次，每次5分钟，再用蒸馏水洗I次；
[0049](2)预杂交:在干的杂交盒底部加20%甘油20mL以保持湿度，按每张20 μ L加杂交液，恒温箱38°C预杂交lh，吸取多余液体，不洗；
[0050](3)杂交:用杂交液稀释地高辛标记的探针，浓度为每条探针0.5μ g/mL，每张切片加20 μ L杂交液，盖上盖玻片，恒温箱42°C，杂交过夜。[0051](4)杂交后洗涤:揭去盖玻片，37°C 2X柠檬酸三钠-NaCl缓冲液洗涤2次，每次5分钟；0.5 X柠檬酸三钠-NaCl缓冲液洗涤15分钟；0.2 X柠檬酸三钠-NaCl缓冲液洗涤15分钟；
[0052](5)滴加封闭液，37°C 30分钟，甩去多余液体，不洗；
[0053](6)滴加生物素化鼠抗地高辛，370C 60分钟，0.5mol/L磷酸缓冲液洗4次，每次5分钟；
[0054](7)滴加链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，37°C 20分钟，0.5mol/L磷酸缓冲液洗3次，每次5分钟；
[0055](8)滴加生物素化过氧化物酶，370C 60分钟，0.5mol/L磷酸缓冲液洗4次，每次5分钟；
[0056](9)显色:使用二甲基联苯胺(DAB)显色试剂盒，即ImL蒸馏水加显色剂A、B、C各一滴，混匀，加至标本片上，镜下控制显色，一般30分钟内显色完毕，充分水洗；
[0057](10)苏木精染色30秒后充分水洗，酒精脱水、二甲苯透明，封片。
[0058]结果观察:
[0059]地高辛标记的寡核苷酸探针与细胞内寄生的螺原体特异性地结合，经DAB染色后呈深棕色，宿主细胞核由苏木精染成蓝色。所检测的健康克氏原螯虾与感染白斑综合征病毒病的克氏原螯虾 无特异性信号(图1，2)，而感染螺原体的克氏原螯虾样品则出现明显的深棕色信号(图3)。
【权利要求】
1.螺原体病原的原位杂交检测探针，其特征在于，其序列如SEQID N0.1和SEQ IDN0.2所示。
2.螺原体病原的原位杂交检测试剂盒，包括原位杂交试剂和特异性探针，其特征在于所述特异性探针 的序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。
【文档编号】C12R1/01GK103805680SQ201210443870
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月8日 优先权日:2012年11月8日
【发明者】王文, 丁正峰, 孟庆国, 顾伟, 任乾 申请人:南京师范大学