专利名称：一种他立韦林的制备方法
技术领域：
本发明涉 及医药技术领域，特别是他立韦林的一种新的制备方法。
背景技术：
他立韦林(Taribavirin,商品名viramidine)的化学名称是I-P-D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三氮唑-3-甲脒盐酸盐，为核苷类似物，是一种能通过腺苷脱氨酶作用转化为利巴韦林的前药，用于治疗丙肝。与利巴韦林相比，他立韦林可降低慢性丙肝患者的贫血发生率，同时可使持续病毒学应答增加。他立韦林具有更小的副作用以及更好的疗效，有可能取代利巴韦林成为安全有效的慢性丙肝治疗药物。目前，他立韦林的合成主要为化学法。化学法参见文献(Journal of MedicinalChemistry, 16(8), 935 937(1973) ； Journal of Medicinal Chemistry, 32(7), 1447 1449(1989) ;W02001/060379)。这类方法采用利巴韦林或者四乙酰核糖为起始原料，价格昂贵；缩合反应温度高达150°C或以上，并且成熔融状态，工业生产难以操作；反应及纯化步骤繁琐，副产物多，产率低，综合成本高；大量使用有机溶剂，安全环保要求高。上述表明，采用现有技术，需要利用核苷制备四乙酰核糖或者制备利巴韦林作为起始原料，增加成本，并且安全环保要求高，其工业化受到了成本和安全环保的限制。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种他立韦林的制备方法，工艺简便，生产成本低廉，产物得率高。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种他立韦林的制备方法，采用乙酸短杆菌Brevibacterium acetylicum ATCC39311菌株作为菌种,包括如下步骤A、将菌种先进行发酵得菌种发酵液，再将菌种发酵液进行催化底物反应，所述的催化底物反应是指在菌种发酵液中加入底物，在55°C 65°C进行酶催化反应20小时 25小时得催化反应液；B、催化反应液的后处理步骤A催化反应结束后，加入与催化反应液相比，其重量百分含量为0. I 2. 5%活性炭，助滤除菌，滤液真空减压浓缩到有固体析出，冷却到10土1°C，过滤除去固体杂质，滤液加入0. 3 I. 0倍体积乙醇，冷却结晶，5±1°C过滤收集滤饼，60±5°C下真空干燥，得到I- ^ -D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三氮唑-3-氰基；C、氨解反应与纯化在耐压反应釜中加步骤B的1-0 -D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三氮唑-3-氰基、氯化铵和氨甲醇溶液，且氨甲醇溶液的浓度是10%，30°C 50°C反应15小时 36小时；真空减压浓缩至干，加入自身浓度为90%乙醇溶液结晶，抽滤，滤饼烘干，得到他立韦林。进一步在上述他立韦林的制备方法中，所述步骤A的酶反应底物是核苷和3-氰基-1，2，4-三氮唑；核苷浓度为10mmol/L 600mmol/L ;所述核苷与3-氰基-1，2，4-三氮唑的摩尔比是I: I I: I. 5 ;所述的核苷是肌苷、鸟苷或腺苷中的一种或者两种。所述步骤C各物质的摩尔比为I- ^ -D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三氮唑-3-氰基氯化铵等于I: I. 0 I I. 5，所述氯化铵与氨甲醇溶液的摩尔比为1:3. 8 1:4. 2。所述步骤A菌种发酵是指将菌种放入菌种培养基进行发酵处理，所述菌种培养基的重量百分比配制为葡萄糖0. 1%
I.0%,酵母粉I. 0% 5. 0%,磷酸氢二钾0. 35% I. 50%,磷酸二氢钾0. 15% I. 50%,氯化钠0. 15% I. 00%,自来水90. 00% 98. 25%,发酵液pH值控制在6. 0 6. 9。所述步骤A菌种发酵的发酵控制是采用发酵罐通风发酵；罐压为0. 010 0. 015MPa，发酵温度为35°C 40°C，发酵时间为25小时 35小时。本发明所涉及的乙酸短杆菌Brevibacterium acetylicum ATCC39311菌株(公知菌株)，购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,简称ATCC,网tit http://www. atcc. org/)。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果I)菌种发酵液催化反应相比化学法条件温和。其特征为采用酶液催化缩合反应，
生成I- ^ -D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三氮唑-3-氰基。2)原料成本低。其特征为采用大规模发酵生产的核苷为起始原材料，比现有技术中的四乙酰核糖或者制备利巴韦林容易获取，价格低廉。3)步骤简便。其特征为采用菌种发酵液直接进行下一步催化反应，不需要分离收集菌体，简单方便，并且可以继续利用其中的磷酸盐作为缓冲液。4)他立韦林总收率高，达到87. 5% 91. 5%。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明的内容作进一步详述,实施例中所提及的内容并非对本发明的限定，制备过程中各个原材料的选择可因地制宜而对结果并无实质性影响。实施例II.菌种发酵液培养基的配制葡萄糖0. 5%，酵母粉4. 5%，磷酸氢二钾0. 8%，磷酸二氢钾0. 3%，氯化钠0. 2%，用自来水配制，发酵液pH值控制在6. 8 ；2.菌种发酵液的发酵控制采用30L发酵罐，将菌种接入发酵培养基，通风发酵；罐压为0. 012MPa，发酵温度为36°C，发酵时间为26小时；3.菌种发酵液催化底物反应在3L三口瓶中加入IL上述菌种发酵液、21. 46g (80mmol)肌苷和7. 53g (80mmol)3-氰基-1，2，4-三氮唑，搅拌加热，在60°C温度下进行酶催化反应24小时；催化反应过程中采用TLC (展开剂，乙酸乙酯异丙醇氨水=2:4:1)监控反应情况。4.催化反应液的后处理酶催化反应结束后，在反应液中加入2. Og活性炭，搅拌，抽滤，滤饼弃去，滤液真空减压浓缩到约200ml，有少量固体析出；取出搅拌降温，冷却到10°C，抽滤，除去固体杂质；滤液加入0. 5倍体积乙醇，搅拌冷却结晶，5 °C过滤收集滤饼，60 °C真空干燥，得到I-^-D-呋喃核糖基-1H-1, 2，4-三氮唑-3-氰基 17. 19g (95%)。5.氨解反应与纯化在耐压反应釜中加入11. 31g (50mmol) 1-3-0-呋喃核糖基-111-1，2，4-三氮唑-3-氰基、2. 67g (50mmol)氯化铵和200ml氨甲醇溶液，35°C反应24小时；真空减压浓缩至干，加入IOOml90%乙醇溶液结晶，抽滤，滤饼烘干，得到他立韦林13. 42g (96%)，熔点177-179°C;按照高效液相色谱法检测纯度为99. 5% ;检测方法和条件如下(下面的实施例使用相同的方法和条件)仪器高效液相色谱仪(Agilent 1200)色谱柱BDSC18 4. 6mmx250mm 5 u m流动相5%甲醇 +95%50mmol/L(NH4)H2P04流速lml/min波长216nm实施例2I.菌种发酵液培养基的配制葡萄糖0. 5%，酵母粉4. 0%，磷酸氢二钾0. 8%，磷酸二氢钾0. 3%，氯化钠0. 2%，用自来水配制，发酵液pH值控制在6. 8 ；2.菌种发酵液的发酵控制采用30L发酵罐，将菌种接入发酵培养基，通风发酵；罐压为0. 012MPa,发酵温度为36°C，发酵时间为30小时；3.菌种发酵液催化底物反应 在3L三口瓶中加入IL上述菌种发酵液、22. 66g (80mmol)鸟苷和7. 53g (80mmol)3-氰基-1，2，4-三氮唑，搅拌加热，在60°C温度下进行酶催化反应24小时；催化反应过程中采用TLC (展开剂，乙酸乙酯异丙醇氨水=2:4:1)监控反应情况。4.催化反应液的后处理酶催化反应结束后，在反应液中加入2. Og活性炭，搅拌，抽滤，滤饼弃去，滤液真空减压浓缩到约200ml，有少量固体析出；取出搅拌降温，冷却到10°C，抽滤，除去固体杂质；滤液加入0. 5倍体积乙醇，搅拌冷却结晶，5°C过滤收集滤饼，60°C真空干燥，得到I-^-D-呋喃核糖基-1H-1, 2，4-三氮唑-3-氰基 17. 37g (96%)。5.氨解反应与纯化在耐压反应釜中加入11. 31g (50mmol) 1-3-0-呋喃核糖基-111-1，2，4-三氮唑-3-氰基、2. 67g (50mmol)氯化铵和200ml氨甲醇溶液，35°C反应24小时；真空减压浓缩至干，加入IOOml90%乙醇溶液结晶，抽滤，滤饼烘干，得到他立韦林13. 28g (95%)，熔点177-179°C ;按照高效液相色谱法检测纯度为99. 6%。
权利要求
1.一种他立韦林的制备方法，采用乙酰短杆菌Brevibacterium acetylicumATCC39311菌株作为菌种，其特征在于包括如下步骤 A、将菌种先进行发酵得菌种发酵液，再将菌种发酵液进行催化底物反应，所述的催化底物反应是指在菌种发酵液中加入底物，在55°C 65°C进行酶催化反应20小时 25小时得催化反应液； B、催化反应液的后处理步骤A催化反应结束后，加入与催化反应液相比，其重量百分含量为O. I 2. 5%活性炭，助滤除菌，滤液真空减压浓缩到有固体析出，冷却到10土1°C，过滤除去固体杂质，滤液加入O. 3 I. O倍体积乙醇，冷却结晶，5± I °C过滤收集滤饼，60±5°C下真空干燥，得到l-β -D-呋喃核糖基-1Η-1，2，4-三氮唑-3-氰基； C、氨解反应与纯化在耐压反应釜中加步骤B的1-0-0-呋喃核糖基-1!1-1，2，4-三氮唑-3-氰基、氯化铵和氨甲醇溶液，30°C 50°C反应15小时 36小时；真空减压浓缩至干，加入浓度为90%乙醇溶液结晶，抽滤，滤饼烘干，得到他立韦林。
2.根据权利要求I所述的他立韦林的制备方法，其特征在于所述步骤A的酶反应底物是核苷和3-氰基-1，2，4-三氮唑；核苷浓度为lOmmol/L 600mmol/L ;所述核苷与3-氰基-1，2，4-三氮唑的摩尔比是I: I I: I. 5 ;所述的核苷是肌苷、鸟苷或腺苷中的一种或者两种。
3.根据权利要求2所述的他立韦林的制备方法，其特征在于所述步骤C中I-β-D-呋喃核糖基-1Η-1，2，4-三氮唑-3-氰基与氯化铵的摩尔比为I: I. O I: I. 5。
4.根据权利要求I所述的他立韦林的制备方法，其特征在于所述步骤A菌种发酵是指将菌种放入菌种培养基进行发酵处理，所述菌种培养基的重量百分比配制为葡萄糖O.1% I. 0%,酵母粉I. 0% 5. 0%,磷酸氢二钾O. 35% I. 50%,磷酸二氢钾O. 15% I. 50%,氯化钠O. 15% I. 00%，自来水90. 00% 98. 25%，发酵液pH值控制在6. O 6. 9。
5.根据权利要求4所述的他立韦林的制备方法，其特征在于所述步骤A菌种发酵的发酵控制是采用发酵罐通风发酵；罐压为O. 010 O. 015MPa，发酵温度为35°C 40°C，发酵时间为25小时 35小时。
全文摘要
本发明公开了一种他立韦林的制备方法，采用乙酰短杆菌Brevibacterium acetylicum ATCC39311菌株作为菌种，包括如下步骤A、将菌种先进行发酵得菌种发酵液，再将菌种发酵液进行催化底物反应；B、催化反应液的后处理； C、氨解反应与纯化。与现有技术本相比，本发明具的优点和效果是1)菌种发酵液催化反应相比化学法条件温和。2)原料成本低。3)步骤简便。4)他立韦林总收率高，达到87.5%～91.5%。
文档编号C12R1/13GK102978264SQ20121045840
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月14日 优先权日2012年11月14日
发明者任洪发, 鲁立, 郑明英, 欧仁树, 林晓, 黄桂基, 宁异真 申请人:广东肇庆星湖生物科技股份有限公司