专利名称：一种荔枝果实衰老起始标志基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种荔枝果实衰老起始标志基因及其应用。
背景技术：
蒸枝(Litchi chinensis Sonn.)是原产于我国且极具内销和出口竞争优势的热带名优水果，2010年全国荔枝面积863. 53万亩，产量175. 83万吨，面积和产量均超过世界荔枝总面积和总产量的70%。不过，荔枝果实采后极易褐变、腐烂，导致巨大的经济损失。研究表明外源ATP处理可以抑制采后果蔬过氧化产物的积累，维持膜脂不饱和程度和膜的完整性，延缓其衰老和品质劣变(Qu等，2006 ；Yi等，2008 ；2009 ;2010)，然而荔枝果实衰老褐变的分子机制仍不明确。果实采后衰老是由内在和外部环境因素所诱导和引发的一种主动过程，其中能量水平的改变可能是启动果实采后衰老劣变的关键因素。研究表明，园艺作物采后衰老和褐变的发展可能与能量供应不足和生成效率下降有关。采后苹果、梨，荔枝、龙眼、香石竹切花等的衰老程度，以及向日葵种子的萌发活力与ATP含量和能荷值(EC)成负相关性(Saquet等，2000 Jiang 等，2007)。能量由呼吸作用产生，线粒体膜上ATP合酶(FlFo-ATP synthase)利用跨膜的电化学质子势，通过氧化磷酸化将ADP和Pi合成ATP。ATP合酶是由α β Υ δ ε亚基组成的多聚体，其中ATP合酶β亚基是一种新型的细胞死亡调节器(Chivasa等，2011)。β亚基缺失则呼吸复合物V不能被正常组装，呼吸速率降低(Martinez-Cruz等，2011)继而ATP合成受阻。但是AtpB基因在果实成熟中的作用目前尚不清楚。可见，从能量角度探讨荔枝果实采后衰老劣变机制，进而从能量角度提出果蔬采后保鲜新策略，不仅具有重要理论价值而且对荔枝贮藏保鲜技术发展具有重要推动作用。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种克隆自荔枝的，编码ATP合成酶β小亚基的，能作为荔枝果实衰老起始标志性基因的LcAtpB基因。本发明的LcAtpB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I的第7位 1386位所示。序列SEQID No. I由1925个核苷酸组成，自5’端第I至6位核苷酸为5’端非编码区(5’ -UTR),第7位至1383位核苷酸为编码序列，第1384至1386位核苷酸为终止密码子，第1387至1925位核苷酸为3，端非编码区(3，-UTR)ο上述LcAtpB基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，C端包含一个DELSEED结构域(自SEQ ID NO. 2所示序列的氨基末端第372至378氨基酸残基)。预测编码的蛋白质的分子量为49. 9kDa，等电点(pi)为5. 12。本发明通过实验发现，LcAtpB基因表达水平能被外源ATP、高氧、高氮和低温在内的保鲜处理措施所抑制和下调。外源ATP、高氧、高氮和低温在内的处理措施通过下调LcAtpB基因的表达水平从而显著延缓荔枝果皮褐变和延长贮藏时间。由此可见LcAtpB基因能作为荔枝果实衰老起始的标志性基因，因此本发明的第二个目的是提供LcAtpB基因作为荔枝果实衰老起始的标志性基因的应用。本发明的第三个目的是提供LcAtpB基因在调控荔枝果实成熟衰老和采后保鲜中的应用。本发明的LcAtpB基因具有指示荔枝果实衰老的作用，可以作为荔枝果实衰老起始的标志性基因，可以通过调控LcAtpB基因来调控荔枝果实成熟衰老，因此本发明在荔枝果实新品种培育中具有重要作用。
图I是洛枝LcAtpB基因编码的蛋白序列的进化分析，涉及的氣基酸有KpAtpB(CAB89921. I), CtAtpB(ACZ73599. I), CsAtpB(YP_740482. I), MaAtpB(ABU75138.·I)，PeAtpB (ABU75177. I)，SiAtpB (CAB65433. I)，StAtpB (ΑΒΒ90048. I)，AtAtpB (ΒΑΑ8-4392.I), OsAtpB(ΝΡ_039390. I)和 ZmAtpB(CAA60293. I)；图2是荔枝果实成熟过程中LcAtpB基因表达和外源ATP处理对荔枝果实LcAtpB基因表达的影响；图3是外源ATP处理对荔枝褐变指数和商品率的影响；图4是厌氧、高氧处理和冷藏荔枝常温货架期间果实褐变指数；图5是厌氧、高氧处理和冷藏荔枝常温货架期间LcAtpB基因表达。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例I :I、材料蒸枝(Litchi chinenis, Sonn.)采自广州从化地区，品种为“淮枝”。2、LcAtpB基因全长cDNA的分离采用热硼酸法提取荔枝果皮总RNA。以总RNA为模版，反转录合成第一链cDNA，作为模板用于PCR扩增。按照GenBank中登录的已知基因功能保守区域，设计简并引物LcAtpB Forward GGGCCGTGGCCatgwsngcnac ；LcAtpB Reverse TCGGGCAGGCCGtcnarytcncc ；以反转录生成的cDNA为模板与基因的简并引物进行PCR扩增。PCR扩增条件为94°C预变性4min ;94°C变性30s，复性30s，72°C延伸30s，30个循环；然后72°C延伸IOmin0用I. 0%琼脂糖凝胶电泳初步检测PCR产物，回收目的条带，连接在pMD20-T载体上，转化，测序。根据得到的cDNA片段序列(1188bp)，分别设计3'端和5'端特异引物，并以cDNA片段为模版，进行 RACE(RapidAmplification ofcDNA Ends)扩增。3'端和 5'端 RACE 扩增引物如下LcATP(B)3' RACE Forwardl:GTCAACTATGCTCCAACCTCLcATP(B)3，RACE Forward2:CGTTACAAAGAACTTCAGGA
5’RACE reverse I:CCTCAATGACTTGCAATGTAGAAG5’ RACE reverse2:CAGCCTCTTCCAATAGTGCTTTA反应体系包括反转录反应液I μ 1，10 XcDNA Dilution Bufferl μ 1,2. 5mM dNTP
4μ I, forward primer 3 μ I, reverse primer 3 μ I, rTaq 0.3 μ I, ddH20 33.7 μ I,共50 μ I。PCR 程序94。C3min 后 94° C lmin，60。C lmin，72。C Imin 30sec，35 个循环，72° C IOmin0对:V端和Y端RACE扩增反应的扩增产物进行测序，然后与已有的1188bp保守区域序列进行拼接，得到cDNA核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO. I所示，由1925个核苷酸组成，其编码区如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列的第7位 第1386位所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，具有459个氨基酸，C端包含一个DELSEED结构域(自SEQ IDNO. 2所示氨基酸序列的氨基末端第372至378氨基酸残基)。预测编码的蛋白质的分子量 为49. 9kDa，等电点(pi)为5. 12。将SEQ ID NO. I所示核苷酸序列的第7位 第1386位所示的编码区命名为LcAtpB基因。利用ExPASy 在线分析工具 p I/Mw (http: //wwwlexpasylch/tools/pi_tool.html)对LcAtpB基因编码的蛋白质进行氨基酸基本性质分析。利用DNAMAN 510和ClustalX 1183软件进行不同物种间同源基因的氨基酸序列比对，并结合MEGA 410软件构建系统进化树，结果如图I所示。从图中可以看出，荔枝AtpB与其它植物物种AtpB氨基酸序列具有同源性，其中与同属无患子科的栾树(Koelreuteria paniculata)的AtpB氨基酸序列相似性较高(92%)。3、荧光定量研究LcAtpB的表达模式对不同处理不同贮藏时间的荔枝提取RNA，反转录成cDNA用作荧光定量PCR的模版。在 ABI 7500Real_Time PCR System (Applied Biosystems, USA)上用 LightCycler480SYBR Green IMaster Mix(Roche Applied Sience,www. roche-applied-science. com)进行 Quantitative RT-PCR(qPCR)反应。以荔枝 actin 基因为内标(DQ471426)。用于 qPCR的引物序列如下针对actin基因LcACTIN Forward ACCGTATGAGCAAGGAAATCACTGLcACTIN Reverse TCGTCGTACTCACCCTTTGAAATC针对LcAtpB 基因LcAtpB Forward GAGAGTTGGTTTGACTGCCCTAALcAtpB Reverse GAAGGCATTCTACCCAATAAGGC反应条件如下95°C 30s后95°C 5s，58°C 34s, 40个循环；用2_ ΔΔ CT法进行数据处理。4、LcAtpB基因对在体成熟荔枝果实衰老的调控作用选取6株长势中等、树型基本一致的果树作为供试植株，从花后50天开始取样，每10天采样一次，花后90天取样结束。共5个成熟度果实取样，用步骤3的荧光定量Q RT-PCR研究LcAtpB基因的表达。结果表明，在荔枝果实发育和成熟过程中，ATP合成酶β小亚基LcAtpB基因表达持续升高，在花后80天-90天急剧升高(图2Α)。5、LcAtpB基因对在离体成熟荔枝果实衰老的调控作用
共进行3个试验(I)ATP处理组荔枝采收后先用O. 5%次氯酸钠表面消毒5s，再用无菌水清洗2次。稍晾干后分别用无菌水和ImM ATP进行真空渗透处理，减压至红线(>75kPa)后，维持该压力3min，每处理200个果，O. 015mm厚聚乙烯塑料袋包装，15个果/袋，25°C贮藏，从处理的当天开始，每隔I天取样一次，共取样4次用于各生理指标测定和LcAtpB基因的表达量分析。(2)氧气、氮气处理组荔枝果实用O. 05%施保功浸泡3min，晾干备用。取810个荔枝，分成相等的3份，第一份不做处理，作为对照(control);第二份放入玻璃罐中，通入高纯氮气O. 5小时，密闭5. 5小时，作为短期厌氧处理；第三份放入玻璃罐中密闭，每隔7. 5小时通纯氧O. 5小时，共密闭24小时，作为高氧处理。对照和处理果实分别用聚乙烯塑料袋包装，每袋30个，在25°C贮藏6天，每隔一天取样用于各生理指标测定和LcAtpB基因的表达量分析，该试验重复进行3次，实验结果基本一致。
(3)货架期试验组荔枝果实用O. 05%施保功浸泡3min，晾干备用。取810个荔枝，分成相等的3份，用聚乙烯塑料袋包装，每袋30个(每份9袋)，在1°C贮藏。于1、2和3周后各取一份置于25°C贮藏2天，分别于0、24小时和48小时取样用于各生理指标测定和LcAtpB基因的表达量分析。结果显示(I)外源ATP处理降低LcAtpB基因表达从而延缓荔枝果实衰老劣变，并提高商品率(图2B、图3) ; (2)高氧、高氮和低温均可延缓荔枝果实果皮褐变和延长贮藏寿命(图4) ；(3) LcAtpB基因急剧上调表达是荔枝果实衰老起始的标志性事件(图2)，上述保鲜处理措施通过下调LcAtpB基因的表达水平从而调控荔枝果实的成熟和衰老进程(图2B、图 5A 和 5B)。
权利要求
1.一种荔枝果实衰老起始的标志性基因LcAtpB基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO. I的第7位 1386位所示。
2.权利要求I所述的LcAtpB基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
3.权利要求I所述的LcAtpB基因作为荔枝果实衰老起始的标志性基因的应用。
4.权利要求I所述的LcAtpB基因在调控荔枝果实成熟衰老和采后保鲜中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种荔枝果实衰老起始标志基因及其应用。荔枝果实衰老起始的标志性基因LcAtpB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第7位~1386位所示。LcAtpB基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。本发明的LcAtpB基因具有指示荔枝果实衰老的作用，可以作为荔枝果实衰老起始的标志性基因，可以通过调控LcAtpB基因来调控荔枝果实成熟衰老，因此本发明在荔枝果实新品种培育中具有重要作用。
文档编号C12N15/55GK102943082SQ201210461058
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月14日 优先权日2012年11月14日
发明者屈红霞, 蒋跃明, 王慧, 钱政江, 邝健飞, 段学武 申请人:中国科学院华南植物园