专利名称：一种利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法
技术领域：
本发明涉及一种重组质粒，具体地，涉及一种利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法。
背景技术：
VEGFA 的全称为 vascular endothelial growth factor A,其中文名为血管内皮生长因子A。血管生成刺激因素包括有一类称为“血管生成因子(antigenic growthfactors) ”的细胞因子，起着刺激新血管形成的作用。目前已经发现了一些血管生成刺激因子，如血小板源性生长因子(TOGF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)、转换生长因子(TGF)、血管内皮细胞生长因子A(VEGFA)等，其中在肿瘤血管生成中起关键作用的是VEGFA。·
VEGFA蛋白由肿瘤细胞、巨噬细胞及纤维母细胞等分泌，广泛分布于人体许多组织，如腺体、肺、肝、肾、心肌等，但表达水平极低，其作用仅维持正常血管密度和基本渗透功能，维持营养物质。当出现肿瘤细胞之后，其表达水平一般会大大上升。有研究表明，VEGFA与肿瘤侵染性相关，与肿瘤易感性亦相关。VEGFA的主要功能包括(I)选择性增强血管内皮细胞有丝分裂，刺激内皮细胞增殖并促进血管形成。(2 )升高血管尤其是微小血管的渗透性，使血浆大分子外渗沉积在血管外基质中，为肿瘤细胞的生长和新生毛细血管网的建立提供营养。随着人类基因组计划的完成和模式生物基因组计划的进行，人们对于占人类基因组95%以上的非编码序列的研究日益加强，研究发现它们中很多是具有生物学功能和意义的片段，在这些研究之中，对于大小约21-23个碱基的单链小分子RNA的microRNA的研究则是最为热点之一。在近几年中的肿瘤的研究中，有关于microRNA对于肿瘤的功能与调控的研究一直是肿瘤治疗领域的热点之一，同时也取得了很大的突破与进展。目前研究表明，microRNA主要是通过结合到靶标基因的3 ' UTR区域，进而抑制靶标基因的转录，因此基因的3' UTR的抑制程度能够指示该基因受到miCToRNA抑制的水平。然而，现阶段对于血管生成与microRNA的相关研究报道并不多见,而对于VEGFA蛋白与microRNA的研究就更为少见了，同时目前也没有一种简便，快捷的方法来筛选能够抑制多药耐药蛋白的microRNAο
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选血管生成相关microRNA的方法，利用含有血管内皮成长因子A (VEGFA)基因3' UTR序列和报告基因的重组质粒，进行血管生成相关的microRNA的筛选。为了达到上述目的，本发明提供了一种利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其中，所述的方法包含
步骤I，进行目标细胞的培养和铺板。优选人结肠癌细胞HCTl 16细胞培养于含有胎牛血清、青霉素、链霉素的RPMI 1640完全培养基(37°C 5% CO2、饱和湿度)中，并使之维持单层贴壁生长。然后在空板中接种指数生长期的细胞，在37°C 5% CO2培养箱中过夜培养，直到细胞到80%汇片。步骤2，配置microRNA/DNA/脂质体的混合物，对步骤I所述的细胞进行共转染。具体过程如下稀释质粒DNA及microRNA至RPMI 1640-SF培养液中，另外稀释脂质体至同样的RPMI 1640-SF培养液中，分别室温放置5 min。然后将所有上述稀释液混合，在室温放置20 min，使microRNA/DNA与脂质体结合。铺板细胞用RPMI 1640-SF培养液洗一次，在每个孔中加入microRNA/DNA/脂质体混合物。在37°C 5% CO2培养箱中培养3_5 h，吸去microRNA/DNA/脂质体/RPMI 1640-SF培养液混合物，每孔加入3ml新鲜培养液，在37°C5% CO2培养箱中培养24-48 ho步骤3，进行荧光素酶活性检测。该步骤三包含将步骤二所得的共转染后的细胞，用一种含有VEGFA基因3' UTR与报告基因的重组质粒，以及一种海肾荧光素酶载体PRL-SV40分别进行转染；然后将得到的细胞经过培养后，进行收集；将所收集的细胞进行裂解，即取出培养基，用PBS洗一次，在每孔中加入裂解液，室温摇动15 min;取15-20 μ I·细胞裂解液于离心管中，加入工作液，然后用发光仪进行测读。上述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其中，所述的工作液通过Kenreal试剂盒配置；所述的工作液包含用于测定萤火虫荧光素酶活性的工作液I和用于测定海肾荧光素酶活性的工作液2。该工作液I为A液(2 ml)+B液(40μ I) + C液(10 μ I)混合均匀而得。该工作液2为D液(2 ml) +E液(10 μ I)混合均匀而得。进行测读时，加入工作液1，设定延迟2 sec，发光仪测读10 sec ;加入工作液2，则设定延迟2 sec,发光仪测读10 sec。上述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其中，步骤3所述的报告基因为萤火虫荧光素酶基因。上述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其中，步骤3所述的含有VEGFA基因3 ^ UTR与报告基因的重组质粒，其制备方法包含步骤3. 1，对载体质粒进行扩增和抽提；步骤3. 2，对VEGFA基因的3' UTR序列进行克隆、酶切及纯化；步骤3. 3，进行所述的VEGFA基因的3' UTR序列与所述的载体质粒的连接；步骤3. 4，筛选重组子。上述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其中，所述的步骤3. I包含用所述的载体质粒转化大肠杆菌感受态细胞，进行扩增；然后采用碱裂解法抽提制备所述的载体质粒，电泳检测所述载体质粒的纯度和含量；再用NcoI和HindIII对所述载体质粒进行酶切，试剂盒凝胶回收大片段的酶切产物。碱裂解法是提取质粒的最常用也最有效的方法，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异达到分离目的。其原理是高PH使质粒DNA和染色体DNA变性，同时沉淀蛋白质。再将pH值调至中性，质粒DNA较小，很容易复性成双链。而染色体DNA较大，不会复性，缠结成网状不溶物质，从而可以通过离心除去。具体方法为依次加入下面三种溶液，然后进行离心:溶液 I :葡萄糖 50 mmol/T,,EDTA 100 mmol/L,Tris-Cl 25 mmol/L,溶菌酶5mg/ml，调整 pH 为 8· O ;溶液 2 Na0H 0. 2 mol/L, SDS 1% ;溶液 3 :5 mol/L KAc 60 ml，冰乙酸11.5 ml，重蒸水28.5 ml。其中溶液I作用主要是悬浮菌体，溶液2作用是裂解菌体，释放胞内物质，溶液3是沉淀染色体DNA。上述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其中，所述的步骤3. 2包含步骤3. 2. 1，根据人的VEGFA基因的3' UTR区序列设计两端引物引物I为上游Y端引物，其中包含19个VEGFA基因的Y UTR互补碱基，一个HindIII识别位点，3个保护碱基；引物2为下游3'端引物，其中包含19个VEGFA基因3' UTR互补碱基，一个NcoI识别位点，4个保护碱基；步骤3. 2. 2，以基因组DNA为模板，利用PCR反应进行扩增；步骤3. 2. 3，反应结束后，取5 μ I反应产物用琼脂糖凝胶电泳检测；步骤3. 2. 4，取反应产物，琼脂糖凝胶电泳后，切胶，用凝胶回收试剂盒回收；步骤3. 2. 5，将回收的PCR产物用NcoI和HindIII双酶切，再次回收以备连接使用。上述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其中，所述的引物 I 为5’ - CCCAAGCTTCTCACCAGGAAAGACTGAT-3’，其中 AAGCTT 为 HindIII 识别位点。上述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其中，所述 的引物 2 为5’ - CATGCCATGGAACTCAAGTCCACAGCAGT -3’，其中 CCATGG 为 NcoI 识别位点。上述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其中，所述的PCR反应，采用ExTaq DNA聚合酶，反应条件为在95°C变性3min，再在95°C循环30s，然后在55°C退火45s，再在72°C延伸lmin，进行40个循环，最后在72°C最终延伸8min。上述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其中，所述的步骤3. 3的连接是所述的步骤三的连接采用DNA连接试剂盒，进行连接反应，16°C过夜。上述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其中，所述的步骤3. 4包含取连接产物直接转化感受态大肠杆菌；经过含有氨苄青霉素的LB培养基中选择培养；从培养平板上随机挑取菌落，扩增培养后用碱裂解法提取质粒备用；最后经过酶切、PCR、测序鉴定。本发明提供的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法具有以下优点
(I)本发明提供的方法具有灵敏度高、检测速度快、费用低、不需使用放射性同位素等有点。(2)本发明提供的方法同时具有靶向性的特点，能够用来特异性检测microRNA抑制基因3' UTR的活性。(3)本发明提供的方法还能够克服转染效率对结果的影响。
图I为本发明的VEGFA基因3丨UTR序列克隆产物的电泳示意图。图2为本发明中的含有VEGFA基因3' UTR和报告基因的重组质粒NcoI和Hindi 11双酶切检测的电泳示意图。图3为本发明中的含有VEGFA基因3' UTR和报告基因的重组质粒在细胞中检测microRNA对于VEGFA基因3' UTR活性的影响示意图。图4为本发明中的含有VEGFA基因3' UTR和报告基因的重组质粒筛选出的对于VEGFA基因有抑制作用的microRNA的示意图。
具体实施例方式以下结合 附图对本发明的具体实施方式
作进一步地说明。实施例一
一.菌株、质粒以及试剂的准备。菌株大肠杆菌(E. coli)感受态细胞DH5a、大肠癌细胞株HCT116由实验室冻存。质粒pGL3_promoter和 pRL_SV40 为实验室保存。试剂来源
ExTaq DNA聚合酶，限制性内切酶Hindlll、NcoI和DNA连接试剂盒(DNA LigationKit)购自TaKaRa公司。DL2000 分子标记(DL2000 marker )和 λ DNA/Hind III 分子标记(λ DNA/Hind IIImarker)购自上海MajorBio公司。RPMI 1640-SF 培养液购自 Hyclone 公司。Lipofectamine 转染试剂(Lipofect Transfection Reagent)购自北京 TIANGEN公司。双突光素酶报告基因检测试剂盒购自KenReal公司。质粒回收试剂盒和DNA片段回收试剂盒购自北京TIANGEN公司。胎牛血清购自gibco公司。BSA, NaCl, NaF, Tris, EDTA, Trytone，酵母提取物(Yeast Extract), PMSF, PAGE,SDS,吐温20 (Tween-20), G250，硼酸，甘氨酸，亮肽，蛋白显影液等试剂购自上海MajorBio公司。VEGFA, β-actin 抗体购买于 cell signal 公司。试剂配制
100mg/mL 牛血清白蛋白(BSA):称取 BSA O. Ig 溶于 ImL O. 15 M NaCl, - 20° C 保存。制作蛋白标准曲线时，用O. 15M NaCl进行100倍稀释成lmg/mL，一 20° C保存。蛋白电泳缓冲液(5X):称取Tris 15. lg，甘氨酸94g，SDS 5g溶于IL超纯水，室
温保存。蛋白转移缓冲液(5X ):称取Tris 29g，甘氨酸14. 5g,SDS I. 85g溶于IL超纯水，室温保存。临用前稀释为IX，每升加入甲醇200 mL。I. 5 M Tris · HCl (pH 8.8):称取 Tris 45. 43g 溶于 200mL，浓盐酸调 pH 至 8. 8，超纯水定容至250 mL，4° C保存。O. 5 M Tris · HCl (pH 6. 8):称取 Tris 15. 14g 溶于 200mL，浓盐酸调 pH 至 6. 8，超纯水定容至250 mL，4° C保存。30%丙烯酰胺称取丙烯酰胺29g，甲叉双丙烯酰胺Ig溶于100 mL，滤纸过滤于棕色瓶中4° C保存。TBS缓冲液(5X ):称取Tris 24. 2g，NaCl 80g溶于IL超纯水，室温保存。TBST 缓冲液(含 O. 1% Tween-20 的 TBS 缓冲液):量取 Tween-20 ImL 溶于 IL TBS,即可使用，最好现用现配。封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液)称取脱脂奶粉5g溶于IOOmL TBST，溶
解后4° C保存。
G250考马斯亮蓝溶液(测蛋白含量专用)称取G250 lOOmg，溶于50mL 95%乙醇，量取IOOmL磷酸，超纯水定容至1L，滤纸过滤，4° C保存。I M Tris · HCl (pH 7. 5):称取 Tris 30. 29g 溶于 200mL 超纯水，浓盐酸调 pH 至
8.8，超纯水定容至250 mL，4° C保存。I M DTT :称取 DTT 3. 085g 溶于 20mL O. OlM 乙酸钠溶液，-20° C 保存。20mg/mL PMSF :称取 PMSF O. 2g 溶于 IOmL 异丙醇，-20° C 保存。细胞总蛋白提取液称取NaCl O. 73g，NaF O. 524g，EDTA O. 931g，SDS O. 25g，去氧胆酸钠 2. 5g，量取 Triton-100 2. 5mL, I M Tris · HCl (pH 7.5) 2. 5mL，超纯水定容至250mL，4。C 保存。用时每毫升提取液中加 I μ L DTT (IM)、5 μ L PMSF(20mg/mL)、10 μ L 亮妝(2. 5mg/mL)即可。SDS-聚丙烯酰胺分离胶(5mL)
权利要求
1.一种利用双突光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法,其特征在于,所述的方法包含 步骤I，进行目标细胞的培养和铺板； 步骤2，配置microRNA/DNA/脂质体的混合物，对步骤I所述的细胞进行共转染； 步骤3，进行荧光素酶活性检测；该步骤三包含 将步骤2所得的共转染后的细胞，用一种含有VEGFA基因3，UTR与报告基因的重组质粒，以及一种海肾荧光素酶载体分别进行转染；然后将得到的细胞经过培养后，进行收集；将所收集的细胞进行裂解；取15-20 μ I细胞裂解液于离心管中，加入工作液，然后用发光仪进行测读。
2.如权利要求I所述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其特征在于，所述的工作液通过Kenreal试剂盒配置； 所述的工作液包含用于测定萤火虫荧光素酶活性的工作液I和用于测定海肾荧光素酶活性的工作液2。
3.如权利要求I所述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其特征在于，步骤3所述的报告基因为萤火虫荧光素酶基因。
4.如权利要求I所述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其特征在于，步骤3所述的含有VEGFA基因3 ^ UTR与报告基因的重组质粒，其制备方法包含 步骤3. I，对载体质粒进行扩增和抽提； 步骤3. 2，对VEGFA基因的3' UTR序列进行克隆、酶切及纯化； 步骤3. 3，进行所述的VEGFA基因的3' UTR序列与所述的载体质粒的连接； 步骤3. 4，筛选重组子。
5.如权利要求4所述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其特征在于，所述的步骤3. I包含 用所述的载体质粒转化大肠杆菌感受态细胞，进行扩增；然后采用碱裂解法抽提制备所述的载体质粒，电泳检测所述载体质粒的纯度和含量；再用NcoI和HindIII对所述载体质粒进行酶切，试剂盒凝胶回收大片段的酶切产物。
6.如权利要求4所述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其特征在于，所述的步骤3. 2包含 步骤3. 2. 1，根据人的VEGFA基因的3' UTR区序列设计两端引物 引物I为上游Y端引物，其中包含19个VEGFA基因的Y UTR互补碱基，一个HindIII识别位点，3个保护碱基； 引物2为下游3'端引物，其中包含19个VEGFA基因3' UTR互补碱基，一个NcoI识别位点，4个保护碱基； 步骤3. 2. 2，以基因组DNA为模板，利用PCR反应进行扩增； 步骤3. 2. 3，反应结束后，取5 μ I反应产物用琼脂糖凝胶电泳检测； 步骤3. 2. 4，取反应产物，琼脂糖凝胶电泳后，切胶，用凝胶回收试剂盒回收； 步骤3. 2. 5，将回收的PCR产物用NcoI和HindIII双酶切，再次回收以备连接使用。
7.如权利要求6所述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其特征在于，所述的PCR反应的反应条件为在95°C变性3min，再在95°C循环30s，然后在55°C退火45s，再在72°C延伸lmin，进行40个循环，最后在72°C最终延伸8min。
8.如权利要求4所述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其特征在于，所述的步骤3. 3的连接采用DNA连接试剂盒，进行连接反应。
9.如权利要求4所述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其特征在于，所述的步骤3. 4包含 取连接产物直接转化感受态大肠杆菌；经过含有氨苄青霉素的LB培养基中选择培养；从培养平板上随机挑取菌落，扩增培养后用碱裂解法提取质粒备用；最后经过酶切、PCR、测序鉴定。
全文摘要
本发明公开了一种利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其中，该方法包含步骤1，进行目标细胞的培养和铺板；步骤2，配置microRNA/DNA/脂质体的混合物，对步骤1所述的细胞进行共转染；步骤3，进行荧光素酶活性检测；该步骤3包含将步骤2所得的共转染后的细胞，用一种含有VEGFA基因3′UTR与报告基因的重组质粒，以及一种海肾荧光素酶载体分别进行转染；然后将得到的细胞经过培养后，进行收集；将所收集的细胞进行裂解；取15-20μl细胞裂解液于离心管中，加入工作液，然后用发光仪进行测读。该报告基因为萤火虫荧光素酶基因。本发明提供的方法，可用来筛选血管生成相关的microRNA、研究血管生成与microRNA之间的作用机理以及研究肿瘤细胞血管生成的机制等。
文档编号C12Q1/68GK102899421SQ20121046111
公开日2013年1月30日 申请日期2012年11月16日 优先权日2012年11月16日
发明者殷佩浩, 李琦, 邱艳艳, 周利红, 刘宣, 王炎, 秦建民, 侯黎莉, 梁波, 胡送娇, 包益洁, 陈星竹, 靳宝辉, 宋大迁, 叶乃菁, 王一斐 申请人:上海中医药大学附属普陀医院