专利名称：一种pcr检测鉴定森林葱蜗牛的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学检测鉴定领域，具体涉及一种PCR检测鉴定森林葱蜗牛的方法。
背景技术：
森林葱蜗牛nemoralis (Linnaeus)是国际植物检疫中倍受关注的危险性有害生物，其贝壳与同属的花园葱蜗牛CfeAaea hortensis Miiller等近似种极为相似，往往难以区分，且只有资深的陆生贝类学分类专家才能鉴别，卵粒和幼螺的鉴定则更为困难。由于历史的原因，目前国境口岸的植物检疫员多为植物保护专业，对陆生软体动物的分类知之甚少，这种局面给我国的实际检疫工作造成了被动，也是世界各国检验检疫部门共同面临的技术难题。最近二十多年来，分子系统学飞速发展，即由基因序列的比较可以厘清 物种的分类学与系统学地位。因此可以将形态和分子特征结合起来，对森林葱蜗牛及其近似种的分类学进行更为深入而详尽的研究，为森林葱蜗牛的快速准确鉴定提供新的技术手段。而PCR技术在国境口岸检疫部门已经相当普及，如果能设计出特异性引物用PCR扩增方法进行初筛或鉴定，这个难题就迎刃而解。本发明建立了一种PCR方法检测鉴定森林葱蜗牛的技术，以适应当前国境口岸检疫工作的需要。
发明内容
本发明针对传统形态学鉴定技术所存在的不足开展研究，旨在提供一种准确性好、灵敏度高、成本低廉的检测方法，应用于森林葱蜗牛的快速检测鉴定。本发明提供了一种PCR检测鉴定森林葱蜗牛的方法，所述方法是应用特异性引物对森林葱蜗牛的分子特征进行识别，所述引物为
上游引物为 CN-(Pl) :5，- ACCTCCTTCCTTTCTACT -3，，
下游引物为 CN-(P2) :5’ - GTCAACATCTATCCCAAC -3’。本发明的PCR反应体系总体积为25 μ L，其中2 X Taq PCR MasterMix混合液12. 5 μ L，上、下游引物各O. 5 μ L，DNA模板2 μ L，余下用灭菌ddH20补足。所述PCR 反应的程序为95°C预变性 5min ;95°C 50s，52°C 30s, 72°C 50s，35 个循环；72°C延伸lOmin，结束反应。本发明的显著优点本发明方法能够快速、准确地检测鉴定森林葱蜗牛。本发明为植物检疫中对危险性有害生物森林葱蜗牛的检测鉴定提供了新的技术手段，对于防止森林葱蜗牛的传播和扩散具有重要意义。本发明所提供的一种PCR检测鉴定森林葱蜗牛的方法具有以下有益效果
I、结果可靠本发明所设计出的一种鉴定森林葱蜗牛的特异性检测引物，仅针对森林葱蜗牛进行检测，已经对花园葱蜗牛hortensis ;散大蜗牛aspersa ;盖罩大蜗牛故;斯文豪大蜗牛AfesioAe/ijr swinhoei ;灰尖巴蜗牛{Acusta) ravida rarit/a ;地中海白蜗rirgaia进行了测试验证，因此结果可靠性具有充分的保证。2、特异性强所采用的引物是针对森林葱蜗牛的CO I基因序列设计出的特异性引物，特异性高。3、灵敏度高对森林葱蜗牛的检测灵敏度在DNA水平上可达到IOfg/ μ L。4、实用性好当传统分类学方法难以鉴定森林葱蜗牛时，本发明方法用分子生物学技术进行弥补，从而得到快速、准确、灵敏度高的检测鉴定森林葱蜗牛的PCR方法。因此本方法的实用性强，可满足对森林葱蜗牛进行快速可靠的检测和鉴定的需要。
图I为森林葱蜗牛PCR引物特异性试验结果。其中M为IOObp DNA ladderMarker ;泳道1为森林葱蜗牛Cepaea nemoralis ;泳道2为花园葱蜗牛Cepaea hortensis ； 泳道3为散大蜗牛aspersa ;泳道4为盖罩大蜗牛pomatia ;泳道5为斯文豪大蜗牛Afe1SioAeJijr swinhoei ;泳道6 为灰尖巴蜗牛{Acusta) ravida ravida ；泳道7为地中海白蜗牛virgata。图2为森林葱蜗牛PCR检测灵敏度试验结果。其中M为IOObp DNA ladderMarker ;泳道 I 为 IOng/ μ L ;泳道 2 为 Ing/ μ L ;泳道 3 为 IOOpg/ μ L ;泳道 4 为 IOpg/ μ L ；泳道5为Ipg/ μ L ;泳道6为IOOfg/ μ L ;泳道7为IOfg/ μ L。
具体实施例方式实施例I:森林葱蜗牛PCR弓I物特异性试验
1、材料的准备
供试蜗牛如下森林葱蜗牛CfeAaea;花园葱蜗牛Cepaea hortonsis
蜗牛aspersa ;盖罩大蜗牛pomatia ;斯文豪大蜗牛AfesioAe/ijr swinhoei ;灰尖巴蜗牛 JSraafJrAaezja {Acusta) raFit/a raFit/a ;地中海白蜗牛Virgata0以上供试蜗牛系全国口岸检疫中截获,经质检总局国家软体动物检疫鉴定重点实验室确认后，置于_20°C保存备用。2、PCR方法的建立
2.I、引物的设计合成基于森林葱蜗牛CO I (线粒体细胞色素C氧化酶亚基I)基因序列，用引物设计软件Primer 5和Oligo 6设计和分析引物,经NCBIBlast检验其特异性后，交由上海生工生物技术服务有限公司合成。引物如下
上游引物为 CN-(Pl) :5，- ACCTCCTTCCTTTCTACT -3，，
下游引物为 CN-(P2) :5’ - GTCAACATCTATCCCAAC -3’。扩增片段大小为580bp。2. 2、DNA 提取
2.2. I、异硫酸氰胍法将准备好的阳性样品(森林葱蜗牛Cepaea nemoralis)和阴性对照样品(花园葱蜗牛Cepaea hortensis ;散大蜗牛aspersa ;盖罩大蜗牛pomatia ;斯文豪大蜗牛Afe1SioAeJix swinhoei ;灰尖巴蜗牛(Acusta) ravidaravida ;地中海白蜗牛剪碎后分置于研钵内，加液氮研磨成粉末取5011^，再加入20(^1^ TE，混匀；加入400 μ L裂解液，涡旋混匀，放置IOmin ;然后加入300 μ LTris-饱和酹和300 μ L氯仿:异戍醇(24:1),剧烈震荡15s, 13 000r/min离心IOmin ;取上清，加等体积的氯仿异戍醇(24:1),剧烈震荡15s, 13 000r/min离心IOmin ;取上清,加等体积的氯仿，剧烈震荡15s, 13 000r/min, IOmin ;取上清,力口 O. 8倍体积的异丙醇，12 OOOr/min, IOmin,弃上清；取沉淀,加入70%的的无水乙醇ImL,离心13 000r/min,弃上清,后于真空干燥仪中干燥2min，再加入100 μ L灭菌ddH20溶解。用核酸蛋白分析仪测定DNA的浓度，最后用TE溶液将DNA稀释至IOOng/ μ L，置于_20°C保存备用。2. 2. 2、试剂盒提取法TIANGEN组织基因组DNA提取试剂盒提取，按使用说明书操作提取DNA。用核酸蛋白分析仪测定DNA的浓度，最后用TE溶液将DNA稀释至IOOng/μ L,置于-20°C保存备用。2.3、PCR扩增反应体系总体积为25yL，其中2XTaq PCR MasterMix混合液12. 5 μ L，上、下游引物各O. 5 μ L，DNA模板2 μ L，余下用灭菌ddH20补足。混匀后放入PCR扩增仪中进行扩增。
2. 4、PCR扩增反应程序为95°C预变性 5min ;95°C 50s, 52°C 30s, 72°C 50s，35 个循环；72°C延伸lOmin，结束反应。2. 5,PCR产物检测与鉴定取PCR产物10 μ L在I. 5%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上以98V电泳40min，用凝胶成像仪观察。如果观察到在580bp的位置出现条带，则说明所检测的蜗牛样品为森林葱蜗牛。检测结果表明只有森林葱蜗牛样品在580bp的位置扩增出条带，其他样品都没有出现扩增条带(见图1)，说明此引物具有很强的特异性。
实施例2 :森林葱蜗牛PCR检测灵敏度试验
采用10倍浓度系列稀释法将实施例I中提取的森林葱蜗牛DNA原液(IOOng/μ L)稀释成 IOng/ μ L, lng/ μ L, 100 pg/ μ L, 10 pg/ μ L, I pg/ μ L, 100 fg/ μ L和 10 fg/ μ L共7个不同浓度梯度。PCR扩增反应体系总体积为25 μ L，其中2 X Taq PCR MasterMix混合液12. 5 μ L，上、下游引物各O. 5 μ L，DNA模板2 μ L，余下用灭菌ddH20补足。混匀后放入PCR扩增仪中进行扩增。PCR 扩增反应程序为95°C预变性 5min ;95°C 50s，52°C 30s, 72°C 50s，35 个循环；72°C延伸lOmin，结束反应。PCR产物检测与鉴定取PCR产物10 μ L在I. 5%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上以98V电泳40min,用凝胶成像仪观察。如果观察到在580bp的位置出现条带,则说明该浓度可以被检出。结果(图2)显示，在DNA浓度为IOfg/μ L时仍有微弱的条带，表明此方法具有较高的灵敏度，可达到IOfg/μ L。
权利要求
1.一种PCR检测鉴定森林葱蜗牛的方法，其特征在于所述方法是应用特异性引物对森林葱蜗牛的分子特征进行识别；所述引物为 上游引物为 CN-(Pl) :5，- ACCTCCTTCCTTTCTACT -3，， 下游引物为 CN-(P2) :5’ - GTCAACATCTATCCCAAC -3’。
2.根据权利要求I所述的一种PCR检测鉴定森林葱蜗牛的方法，其特征在于利用权利要求I所述的引物进行PCR反应，PCR反应体系总体积为25yL，其中2XTaq PCRMasterMix混合液12. 5 μ L,上、下游引物各O. 5 μ L,DNA模板2μ L,余下用灭菌ddH20补足。
3.根据权利要求2所述的一种PCR检测鉴定森林葱蜗牛的方法，其特征在于所述PCR反应的程序为95°C预变性5min ;95°C 50s, 52°C 30s, 72°C 50s，35个循环；72°C延伸IOmin,结束反应。
全文摘要
本发明公开了一种PCR检测鉴定森林葱蜗牛的方法，所述方法是应用特异性引物对森林葱蜗牛的分子特征进行识别；其PCR反应的上游引物为CN-(P1)5’-ACCTCCTTCCTTTCTACT-3’，下游引物为CN-(P2)5’-GTCAACATCTATCCCAAC-3’。PCR反应体系总体积为25μL，其中2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上、下游引物各0.5μL，DNA模板2μL，余下用灭菌ddH2O补足；PCR反应程序为5℃预变性5min；95℃50s，52℃30s，72℃50s，35个循环；72℃延伸10min，结束反应。本发明方法能够快速、准确地检测鉴定森林葱蜗牛。本发明为植物检疫中对危险性有害生物森林葱蜗牛的检测鉴定提供了新的技术手段，对于防止森林葱蜗牛的传播和扩散具有重要意义。
文档编号C12Q1/68GK102952885SQ201210481179
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月23日 优先权日2012年11月23日
发明者周卫川, 肖琼, 邵碧英, 林阳武 申请人:福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心