专利名称：双峰驼内收蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼内收蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法。
背景技术：
内收蛋白(Adducin)是一个红细胞膜骨架蛋白质。由α和β或α和Y两个亚基组成的二聚体，它的形态似不规则的盘状物，高5. 4nm,直径12. 4nm。每个红细胞约有30000个分子。内收蛋白可与肌动蛋白及血影蛋白复合体结合，并且通过Ca2+和钙调蛋白的作用影响骨架蛋白的稳定性，从而影响红细胞的形态。研究发现，内收蛋白是一种具有多种生物学功能的蛋白质，是一种无处不在的细·胞膜骨架蛋白。目前认为它参与了细胞连接、膜离子转运和信号传递的过程。内收蛋白集中在膜收缩蛋白结点以结合钙调蛋白并且在体内是蛋白激酶(PCK)和Rho-联合激酶的作用物。内收蛋白亚基和序列有关而且都包含在氨基末端球形区、颈区和羧基端敏感蛋白酶尾部区。所有内收蛋白亚基的尾部区以高度保守的富含丙氨酸的豆蘧酰化的激酶C底物(MARCKS)的22-残基领域结束。内收蛋白覆盖了肌动蛋白丝的快速生长端，也优先补充了膜收缩蛋白尾丝。内收蛋白与钙调蛋白结合，并可以与血影蛋白-肌动白复合体结合，促使血影蛋白组装于该复合体。对装配和维持血影蛋白-肌动蛋白网络起重要作用。内收蛋白的研究，人类α-内收蛋白cDNA存在Gly460Trp多态性，表现为第640位碱基由G替换为T,从而导致编码该蛋白第460位的甘氨酸(Gly)替换为色氨酸(Trp)。在高加索人种无亲缘关系的群体研究中发现，原发性高血压(EH)患者中，Gly460Trp杂合子的的频率明显高于正常对照者。在家系内进行连锁分析，也发现该基因附近位点与EH连锁。在1997年，Barlassina等人对a -Adducin的遗传性和原发性高血压病人对盐的感受性进行了研究。在双峰驼中，细胞需要内收蛋白进行细胞连接、膜离子转运和信号传递的过程。是维持细胞膜骨架蛋白稳定性不可缺少的一种蛋白质。对红细胞形态有十分重要的影响。
发明内容
本发明通过克服现有技术之不足，提供了一种双峰驼内收蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法，该内收蛋白是维持细胞膜骨架蛋白稳定性不可缺少的一种蛋白质，对红细胞形态有十分重要的影响。本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的一种双峰驼内收蛋白基因，该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO. I所示的序列。下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进
上述基因的核苷酸序列可具有SEQ ID NO. I中108-1412位的序列。本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的一种含有双峰驼内收蛋白基因的重组蛋白。
下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进
上述重组蛋白的氣基酸序列具有SEQ ID NO. 2所不的序列。上述重组蛋白可具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。上述重组蛋白可通过设计一对引物从双峰驼内收蛋白中得到双峰驼内收蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下
正引物，SEQ ID NO. 3 (正向)5’ - ATGAATGGTGATACTCGGGCG -3’，
反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的一种双峰驼内收蛋白基因的克 隆方法，按下述步骤进行
第一步，总RNA提取，采取双峰驼组织样品后，对组织样品进行组织总RNA提取；
第二步，引物设计及合成，引物对的核苷酸序列信息如下
正引物，SEQ ID NO. 3 (正向):5’ - ATGAATGGTGATACTCGGGCG -3，，
反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT ；
第三步，RT-PCR扩增，利用反转录试剂盒对组织样品中的蛋白基因进行反转录，并对待扩增的DNA片段进行RT-PCR扩增；
第四步，蛋白基因的克隆，首先对PCR扩增的DNA片段进行回收，然后将回收的DNA片段同T载体连接形成感受态细胞，将感受态细胞进行转化培养成单菌落，取少量该单菌落进行PCR扩增，对扩增后的单菌落鉴别T载体上是否含有目的DNA片段，若有目的DNA片段，将单菌落放入培养基中进行过夜培养，最后对质粒进行回收。本发明双峰驼内收蛋白是一种具有多种生物学功能的蛋白质，是维持细胞膜骨架蛋白稳定性不可缺少的一种蛋白质，对红细胞形态有十分重要的影响，因此本发明具有很大的应用价值。
图I为双峰驼内收蛋白基因RT-PCR产物电泳图。图2为构建系统发生树所用内收蛋白氨基酸同源性比较。图3为不同物种内收蛋白氨基酸序列系统进化树。
具体实施例方式本发明不受下述实施例的限制，可根据上述本发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。下面结合实施例对本发明作进一步论述
实施例I，一种双峰马它内收蛋白基因，该基因的核昔酸序列具有SEQ ID NO. I所不的序列。双峰驼内收蛋白基因的核苷酸序列是通过以双峰驼组织中总RNA为模板，参考人、鼠、牛等物种的内收蛋白基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR而获得双峰驼内收蛋白基因核苷酸序列SEQ ID NO. I。可根据实际需要，对双峰驼内收蛋白基因作进一步优化或/和改进
双峰驼内收蛋白基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO. I中108-1412位的序列。在SEQ IDNO. I中，RT-PCR产物长度为1488bp，电泳结果见附图1，其中108-110位为起始密码子ATG，1410-1412位为终止密码子TGA，108-1412位为编码蛋白质区域(CDS);在SEQ ID NO. I,M峰驼内收蛋白基因编码413个氨基酸。实施例2，一种双峰驼内收蛋白基因的重组蛋白。可根据实际需要，对双峰驼内收蛋白基因的重组蛋白作进一步优化或/和改进 重组蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO. 2所示的序列。将双峰驼内收蛋白基因cDNA
序列中的编码序列(⑶S)按通用密码子翻译成的蛋白质编码序列见SEQ ID NO. 2。重组蛋白可具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。将双峰驼内收蛋白基因核苷酸序列中的编码序列按通用密码子翻译成氨基酸序列SEQ ID NO. 2。
通过设计一对弓I物从双峰驼内收蛋白中得到双峰驼内收蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下
正引物，SEQ ID NO. 3 (正向)5’ - ATGAATGGTGATACTCGGGCG -3’，
反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。实施例3，一种双峰驼内收蛋白基因的克隆方法，按下述步骤进行
第一步，总RNA提取
I、组织分离(Isolation)
从内蒙古阿拉善盟双峰驼，快速采得样品，将组织样迅速放入液氮中冷冻后于一 70°C保存，拿回实验室准备提取组织总RNA。2、总 RNA 的分离(Total RNA isolation)
(I)提取RNA的准备工作
玻璃制品用0. IM的NaOH浸泡过夜，用自来水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗2遍，180°C烘烤4小时；
匀浆器、电泳槽用3%的双氧水浸泡20分钟至30分钟，再用0. 1%的DEPC水冲洗.由于未灭活的DEPC对PCR反应有影响，可用0. 5%的SDS处理；
Tip头、EP管用0. 1%的DEPC水浸泡过夜，高压灭菌使DEPC失活；
双蒸水和溶液用DEPC处理，即每IOOml水或溶液加0. ImlDEPC液，室温放置过夜，高压灭菌30分钟DEPC失活。(2 )组织总RNA提取
取IOOmg在液氮中冻存的组织样品放入有Iml TrizolCtrizal reagent, invitrogenBRL, USA)的匀浆器管中匀浆；4°C 12000g离心10分钟；吸取离心后匀浆器管内的上清液移入EP管中，15°C至30°C温育5分钟；往EP管中加0.2ml氯仿，盖紧盖子，用手剧烈震荡15秒，15-30°C温育2分钟至3分钟，4°C、12000g、离心15分钟；吸取上一 EP管中上清液于新的EP管内，加0. 8ml异丙醇，混合均匀，15°C至30°C温育10分钟，4°C、12000g、离心10分钟，EP管底部白色沉淀即为RNA ;倒掉上一 EP管中上清液，加Iml 75%乙醇洗涤RNA，4°C、7500g离心、10分钟；自然干燥或真空干燥RNA，溶于水(RNase free)中分装，_70°C保存。(3)组织总RNA的鉴定
通过分光光度计测定上步得到的RNA溶液中RNA含量，并且用琼脂糖电泳分析RNA的质量，具体方法如下电泳槽用RNA清洗液(IOOmM NaOH, ImM EDTA)浸泡小时4小时至5小时，再用DEPC处理过的水反复冲洗数次后倒入IXTBE待用；琼脂糖凝胶用IXTBE配制，在IOul上样缓冲液(2XTBE，13%菲可，O. 1%溴酚兰，7M尿素)中加入Iul以上组织总RNA，65°C变性10分钟后立即放入冰水中2分钟至3分钟，点样于琼脂糖凝胶中电泳。第二步，引物设计及合成
根据 GenBanK 发表的人(AAB05645. I)、鼠(AAF29504. I)、牛(NP001192928. I)等物种的内收蛋白基因mRNA序列ORF侧翼同源序列，设计如下引物用于以双峰驼内收蛋白核苷酸为模版的PCR扩增，以获得双峰驼内收蛋白基因cDNA序列，引物用Primer Premier 5.0自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成，该引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:3 (正向)和SEQ ID N0:4 (反向)，序列信息如下 SEQ ID NO:3 (正向)5，- ATGAATGGTGATACTCGGGCG -3，，
SEQ ID NO:4 (反向)01igo dT。第三步，RT-PCR扩增
按大连宝生物反转录试剂盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver. I. I)要求进行反转录反转录反应液组成IOul 2XBca 1st Buffer, 4ul 25Mm MgS04, Iul dNTP Mixture, 0. 5ulRnase Inhibitor (40U/ul),Iul BcaBEST Polymerase(22U/ul),Iul Oligo dT Primer,Iul RNA Sample, I. 5ul Rnase Free dH20,总体系为 20 ul ;反转录反应条件65°C I 分钟，30°C 5分钟(15分钟-30分钟内匀速升温)，65°C 25分钟，98°C 5分钟，5°C 5分钟；PCR扩增条件97°C变性5分钟；95°C 30秒一55°C 30秒一72°C I分钟，如此进行30次循环(此处的循环是否应该为变性与退火做为整体循环？即97°C变性5分钟、95°C 30秒、55°C 30秒、720C I分钟为一个轮回)，使引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；72°C延伸10分钟，4°C保存。第四步，蛋白基因的克隆
I、PCR扩增片段的回收片段回收按上海华舜小量胶回收试剂盒说明进行，操作过程如下尽可能小的割下含DNA的琼脂糖块，放入I. 5mlEP管中，按每IOOmg琼脂糖加入300ulSl液的比例加SI液，50°C水浴10分钟，将溶化的琼脂糖液移入吸附柱，IOOOOg离心I分钟，倒掉管中液体，在吸附柱中加入500ul Wl液，IOOOOg离心15秒，倒掉管中液体，在吸附柱中加入500ul Wl液，静置I分钟后，IOOOOg离心15秒，倒掉管中液体，离心I分钟，将吸附柱放入一个干净的I. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulTl液，静置I分钟后，IOOOOg离心I分钟，EP管中液体即为回收的DNA片段。2、回收DNA片段同T载体的连接连接用TaKaRa pMD18_T Vector试剂盒，操作过程如下在EP管中制备下列连接反应液pMD 18-T Vector (50ng/ul) O. 5ul, DNA20-40ng, Solution I 5ul，加dH20至IOul，将上述反应液在16°C反应30分钟(过夜也可以)，产物为转化的感受态细胞。3、质粒的转化 从_70°C冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶，IOOul感受态细胞加入IOul连接产物，冰浴30分钟，42°C水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟，加400ul液体LB培养基，370C复活50分钟，取IOOul铺于LB平板上，平板含O. 1%(V/V)的氨节青霉Amp (100mg/ml)，37°C恒温培养10小时至15小时。4、转化菌落的PCR鉴定与培养用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸取单菌落，将牙签头放入在加有PCR反应液(不含模板)的EP管中晃动，使单菌落充当模板。用获得该片段的PCR条件进行扩增，PCR产物同Marker —起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段，若得到目的片段，可用灭菌枪头挑取在平板上的与之对应的单菌落，放入40 ml LB液体培养基中，先在液体中加入O. 1%(V/V)的青霉素钠(100mg/ml)，37 °C过夜摇菌培养，用于质粒回收。5、质粒的回收质粒回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒，操作步骤如下将转化培养的菌液加入I. 5mlEP管中，4000转/分钟离心，倒掉液体获细菌沉淀，细菌沉淀不够时可再加一次菌液离心，在细菌沉淀中加入250ulPl液，振荡悬浮，加入250ulP2液，温和摇匀，室温静置4分钟，加入350ulP3液，温和摇匀。离心10分钟，将上清液小心移入吸附柱，离心15秒，倒掉液体，在吸附柱中加入500ulWl，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中加入500ulWl,静置I分钟，离心15秒，倒掉液体。离心I分钟,将吸附柱放入一个干净的I. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulTl液，静置I分钟后，离心I分钟.EP管中液体即为回收的质粒。 6、质粒的酶切鉴定为了证明回收质粒确为插入目的片段的重组质粒，采用双酶切法鉴定.本研究具体操作如下根据TaKaRa pMD18_T Vector图，选择内切酶Bam H I和Hin d III.保证目的片段中无这两种酶的切点。组成如下酶切反应体系Bam H I lul,Hin d III Iul，IOXK Buffer 2ul，DNA ( lul，加 dH20 至 20ul，30°C反应 3 小时。琼脂糖凝胶电泳检测。实施例4，对实施例3中重组质粒的测序取20ul重组质粒于EP管中，封口膜密封，交生物技术公司测序，测序得到SEQ ID NO. I核苷酸序列和SEQ ID NO. 2氨基酸序列。实施例5 :双峰驼内收蛋白基因编码序列同源性比较和系统发生树构建
I、双峰驼内收蛋白基因编码序列同源性比较
在GenBank上搜索并获得人、鼠、牛等八种动物的内收蛋白基因编码蛋白序列，将其同克隆测序获得的本发明获得的SEQ ID NO. I序列一起，在分子生物学软件MEGA4上进行序列同源性比较(见附图2)。比较结果显示SEQ ID NO. 2序列与猪和马的内收蛋白氨基酸序列同源性为94. 00%ο2、内收蛋白基因编码序列系统发生树构建
在GenBank上搜索并获得人、鼠、牛等八种物种的八条内收蛋白基因的编码蛋白序列，加上本发明获得的SEQ ID NO. 2序列，利用分子生物学软件MEGA4构建了系统发生树(见附图3)，结果显示双峰驼内收蛋白基因同猪和马的亲缘关系最近；间接证明了所得到的序列确为双峰驼内收蛋白基因。以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。序列表
<110>新疆旺源驼奶实业有限公司 〈120〉双峰驼内收蛋白的蛋白编码序列 〈160〉 4 〈210〉 I 〈211〉 1488〈212〉 DNA
〈213〉阿拉善盟双峰驼〈400〉 I
gagccggagc cggagtcgcc ggagcggacg ggcggctgtc gcactgggac ctaggagctt60
tcgcgctgcc cgccattcgc ctctgaggaa cctagaagga ctgtgcgatg atgaatggtg120
atactcgggc ggcagtggtg acctcaccac ccccgaccac agtccctcac aaggagaggt180
atttcgacag agtggatgag aacaatccag aatacttgcg agagaggaac atggccccag240
accttcgcca ggacttcaac atgatggagc agaagaagag ggtgtccatg attctgcaga300
gccccgcttt ctgtgaagag ctggagtcaa tgatacagga acaatttaag aaggggaaga360·
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ttttaattca gaaaaatttg gggcctaaaa gcaaggtcct cattctccgg aaccacgggc1080
tggtgtccgc tggcgagagt gtggaggagg ccttctatta catccataac ctcgtggttg1140
cgtgtgagat ccaggttcgc actctggcca gtgcaggagg gccagacaac ttagtcctcc1200
tggatcccga gaagtacaaa gccaagtccc gccccgctgg gtctccggcc gcggagggca1260
gcgggtcaac tccccagtgg cagattggtg agcaggagtt tgaagccctc atgcggatgc1320
tcgataatct gggactttgc tgccgctttc tgccggaggc cctctcctgc ttacgggagg1380
ccgtggagcc cagtggggtg caggagccgt gaggccccac gctaacactg tcctgtccgg1440
agcgaccctg gcccgccaga gtccccgact gcgggctgtg gctctggc1488〈210〉 2〈211〉 413〈212〉 PRT
〈213〉阿拉善盟双峰驼〈400〉 2
MNGDTRMVV TSPPPTTVPH KERYFDRVDE NNPEYLRERN MAPDLRQDFN MMEQKKRVSM60
ILQSPAFCEE LESMIQEQFK KGKNPTGLLA LQQIADFMTA NVPNVYPMP QGGMAALNMS120
LGMVTPVNDL RGSDSIAYDK GEKLLRCKLA ALYRLADLFG WSQLIYNHIT TRVSSEQEHF180
LIVPFGLLYS EVTASSLVKI NLQGDVVDRG STNLGVNQAG FTLHSAIYAA RPDVKCVVHI240
HTPAGMVSA MKCGLLPISP EALSLGEVAY HDYHGILVDE EEKVLIQKNL GPKSKVLILR300
NHGLVSAGES VEEAFYYIHN LVVACEIQVR TLASAGGPDN LVLLDPEKYK AKSRPAGSPA360
AEGSGSTPQff QIGEQEFEAL MRMLDNLGLC CRFLPEALSC LREAVEPSGV QEP413〈210〉 3〈211〉 21〈212〉 DNA〈213〉人工〈400〉 3
ATGAATGGTGATACTCGGGCG21
〈210〉 4
〈211〉 〈212〉 DNA〈213〉人工〈400〉 4Oligo dT 。
权利要求
1.一种双峰驼内收蛋白基因，其特征在于该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO. I所示的序列。
2.根据权利要求I所述的双峰驼内收蛋白基因，其特征在于该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO. I 中 108-1412 位的序列。
3.一种含有权利要求I或2所述的双峰驼内收蛋白基因的重组蛋白。
4.根据权利要求3所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的氨基酸序列具有SEQIDNO. 2所示的序列。
5.根据权利要求3所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白为具有SEQID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
6.根据权利要求3或4所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼内收蛋白中得到双峰驼内收蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下 正引物，SEQ ID NO. 3 (正向)5’ - ATGAATGGTGATACTCGGGCG -3’， 反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
7.根据权利要求5所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼内收蛋白中得到双峰驼内收蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下 正引物，SEQ ID NO. 3 (正向):5’ - ATGAATGGTGATACTCGGGCG -3，， 反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
8.一种根据权利要求I或2所述的双峰驼内收蛋白基因的克隆方法，其特征在于按下述步骤进行 第一步，总RNA提取，采取双峰驼组织样品后，对组织样品进行组织总RNA提取； 第二步，引物设计及合成，引物对的核苷酸序列信息如下 正引物，SEQ ID NO. 3 (正向)5’ - ATGAATGGTGATACTCGGGCG -3’， 反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT ； 第三步，RT-PCR扩增，利用反转录试剂盒对组织样品中的蛋白基因进行反转录，并对待扩增的DNA片段进行RT-PCR扩增； 第四步，蛋白基因的克隆，首先对PCR扩增的DNA片段进行回收，然后将回收的DNA片段同T载体连接形成感受态细胞，将感受态细胞进行转化培养成单菌落，取少量该单菌落进行PCR扩增，对扩增后的单菌落鉴别T载体上是否含有目的DNA片段，若有目的DNA片段，将单菌落放入培养基中进行过夜培养，最后对质粒进行回收。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼内收蛋白基因及其克隆方法，该蛋白基因的核苷酸序列具有SEQIDNO.1所示的序列，本发明双峰驼内收蛋白是一种具有多种生物学功能的蛋白质，是维持细胞膜骨架蛋白稳定性不可缺少的一种蛋白质,对红细胞形态有十分重要的影响,因此本发明具有很大的应用价值。
文档编号C12N15/12GK102952808SQ20121048057
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者陈钢粮 申请人:新疆旺源驼奶实业有限公司