专利名称：蓝藻整合表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蓝藻整合表达载体及其应用。
背景技术：
蓝藻(blue-green algae),又称蓝细菌(cyanobacteria),是可以进行放氧光合作用的原核生物。蓝藻广泛分布在淡水、海水甚至是污水中，能够利用CO2和太阳能快速繁殖， 是利用CO2生物合成化学品的理想宿主。作为原核生物，蓝藻细胞结构简单、遗传背景与大肠杆菌相似，与植物细胞相比更易于基因操作。除培养成本低廉、可以光合自养外，有些蓝藻本身营养价值丰富、不含内毒素，具有大肠杆菌作为外源基因表达宿主无法比拟的优点。 因此，从上个世纪九十年代开始，科研人员开始了在蓝藻中表达外源基因的种种尝试。已有在蓝藻中合成人过氧化物岐化酶、肿瘤坏死因子、乙醇及丁醇等化学品的成功案例。太阳能是地球上取之不尽的能源，而CO2是导致全球变暖的温室气体，全球每年投入数以亿计资金用于CO2减排。因此，通过对蓝藻进行遗传改造，使蓝藻利用太阳能把CO2直接转化为化学品，将是解决全球原料短缺问题和C02过渡排放环境问题的理想途径之一。
虽然蓝藻作为外源基因表达宿主及通过创建生物合成途径利用CO2产大宗化学品的研究已引起国内外科研人员的极大热情，但由于蓝藻遗传操作工具匮乏限制了这一领域的发展，使本领域的研究尚处探索阶段。目前外源基因在蓝藻中表达最好的是人过氧化物岐化酶，表达量为总可溶蛋白的3%。该表达量虽然目前是蓝藻中最高的，但和商业用的大肠杆菌表达系统表达量(10-20%)相比还相差甚远。此外，该表达系统在蓝藻中是以质粒形式存在的，使菌株不稳定容易丢失。而在蓝藻中创建合成途径产大宗化学品的产量都很低， 多为mg/L。提高CO2生物合成化学品的转化效率、提高目标化学品产量是目前蓝藻利用CO2 生物合成化学品领域首要解决的问题。
不管是在蓝藻中简单表达一个外源基因产高附加值蛋白，还是创建新的合成途径产大宗化学品，都离不开对蓝藻遗传系统的改造。此外，对于创建合成途径产化学品，不仅需要高效表达系统还需要对蓝藻内源碳流进行有效控制，通过对内源碳流进行重新分配， 使更多碳流向目标化学品合成，进而提高目标化学品产量。总之，目前蓝藻利用CO2生物合成化学品领域遇到的瓶颈问题之一是缺乏强大的蓝藻遗传改造系统。发明内容
本发明的目的是提供一种蓝藻整合表达载体及其应用。
本发明所提供的载体，包含启动子Pcpc，以及位于所述启动子Pcpc下游的终止子 TrbcL ；
所述启动子Pcpc和所述终止子TrbcL均来源于蓝藻；
所述启动子Pcpc的核苷酸序列如序列表中序列I所示；所述终止子TrbcL的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
其中，序列I由560个核苷酸组成；序列2由179个核苷酸组成。
在本发明的一个实施例中，所述环状载体除包含所述启动子Pcpc，以及位于所述启动子Pcpc下游的终止子TrbcL外，还包含DNA片段I和DNA片段2 ;所述DNA片段I位于所述启动子Pcpc的上游，所述DNA片段2位于所述终止子TrbcL的下游；
所述DNA片段I和所述DNA片段2分别为来源于蓝藻基因组中聚羟基丁酸(PHB) 合酶编码基因phaC&E的上下游600bp的片段,合称为同源臂I,命名为pha同源臂；
所述DNA片段I的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述DNA片段2的核苷酸序列如序列表中序列4所示。
其中，序列3由600个核苷酸组成；序列4由595个核苷酸组成。
在本发明的另一个实施例中，所述环状载体除包含所述启动子Pcpc，以及位于所述启动子Pcpc下游的终止子TrbcL外，还包含DNA片段3和DNA片段4 ;所述DNA片段3位于所述启动子Pcpc的上游，所述DNA片段4位于所述终止子TrbcL的下游；
所述DNA片段3和所述DNA片段4分别为来源于蓝藻基因组中磷酸转乙酰酶编码基因Pta的上下游约600bp的片段，合称为同源臂2，命名为pta同源臂。
所述DNA片段3的核苷酸序列如序列表中序列5所示；所述DNA片段4的核苷酸序列如序列表中序列6所示。
其中，序列5由601个核苷酸组成；序列6由587个核苷酸组成。
在本发明中，在所述环状载体的所述启动子Pcpc和所述终止子TrbcL之间存在用于插入待表达基因的酶切位点，如酶切位点Kpn I和BamH I。
为了能够有效的筛选到阳性克隆，所述表达载体中还包含抗性基因。
在本发明中，所述抗性基因具体为卡那霉素抗性基因或氯霉素抗性基因。
所述卡那霉素抗性基因的序列具体如序列表中序列7所示；所述氯霉素抗性基因的序列具体如序列表中序列8所示。
其中，序列7由932个核苷酸组成；序列8由1050个核苷酸组成。
更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述环状载体为将序列表中序列9所示的 DNA 片段(结构组成如下:UP_1 (XhoI)Pcpc (KpnI)- (BamHI)TrbcL (XhoI)Km Down-I)与 T-载体连接后得到的重组载体(pMD-APta::X);在本发明的另一个实施例中，所述环状载体为将序列表中序列10所示的DNA片段(结构组成如下UP-2(BamHI)Pcpc(KpnI)-(PstI) TrbcL (BamHI) Cm Down-2)与T-载体连接后得到的重组载体(pMD-Apha: :X)。
其中，序列9由2889个核苷酸组成；序列10由3014个核苷酸组成。所述T-载体具体可为pMD-18T_simple载体。
本发明还提供了所述环状载体的一个用途。
所述环状载体的用途具体为所述环状载体在蓝藻中表达目的蛋白的应用。
所述应用中，将所述目的蛋白的编码基因插入到所述环状载体pMD-Apta: :X或 pMD- Δ pha: :X的所述启动子Pcpc和所述终止子TrbcL之间,得到整合表达载体,再将整合表达载体导入目的蓝藻中，所述整合载体与所述目的蓝藻通过所述Pta同源臂或所述pha 同源臂发生重组，获得重组蓝藻，培养所述重组蓝藻，获得所述目的蛋白。
在本发明中，所述目的蛋白具体为D-乳酸脱氢酶(Dldh)或反式烯酰辅酶A还原酶(Ter)。
更加具体的所述应用为
其一，将D-乳酸脱氢酶的编码序列(如序列11)插入到载体pMD-Apta: :X的所述启动子Pcpc和所述终止子TrbcL之间,得到整合表达载体(pMD- Δ pta: : Dldh),将所述整合表达载体pMD-Apta: :Dldh导入蓝藻中，所述整合表达载体pMD-Apta: :Dldh与所述蓝藻通过所述Pta同源臂发生同源重组，得到重组蓝藻(S. Apta: :Dldh)，通过培养重组蓝藻获得大量D-乳酸脱氢酶；从所述重组蓝藻S. Apta: :Dldh的代谢产物中还可获得D-乳酸。
其二，将反式烯酰辅酶A还原酶的编码序列(如序列12)插入到载体pMD-Λ pha: :X 的所述启动子Pcpc和所述终止子TrbcL之间,得到整合表达载体(pMD-Δ pha: : Ter),将所述整合表达载体pMD-Apha: :Ter导入蓝藻中，所述整合表达载体pMD-Δ pha: :Ter与所述蓝藻通过所述Pha同源臂发生同源重组，得到重组蓝藻(S. Apha::Ter)，通过培养重组蓝藻获得大量反式烯酰辅酶A还原酶；从所述重组蓝藻S. Apha: : Ter的代谢产物中还可获得丁醇。
其中，序列11由1002个核苷酸组成；序列12由1194个核苷酸组成。
本发明的另一个目的是提供另一种整合表达载体。
所述整合表达载体具体为将待表达蛋白的编码基因插入到所述载体的所述启动子Pcpc和所述终止子TrbcL之间得到的重组载体。
在本发明中，所述整合表达载体具体为如下(al)或(a2):
(al)在所述表达载体的所述启动子Pcpc和所述终止子TrbcL之间插入序列表中序列11所示DNA片段所形成的重组载体，即所述pMD-Apta: :Dldh ；
(a2)在所述环状载体的所述启动子Pcpc和所述终止子TrbcL之间插入序列表中序列12所示DNA片段所形成的重组载体，即所述pMD-Apha: :Ter。
本发明还有一个目的是提供如下(I)或(2 )的DNA片段
(I)核苷酸序列为序列表中序列9所示的DNA片段；
(2)核苷酸序列为序列表中序列10所示的DNA片段。
本发明的再一个目的是提供一种重组蓝藻。
本发明所提供的重组蓝藻可为将所述整合表达载体导入到目的蓝藻中，所述整合表达载体与所述目的蓝藻通过同源臂发生同源重组后得到的重组蓝藻(如重组蓝藻 S. Δ pta: :Dldh,或重组蓝藻 S. Apha: :Ter)0
所述重组蓝藻S. Apta: :Dldh在制备D-乳酸中的应用也属于本发明的保护范围。
在所述应用中，发酵培养所述重组蓝藻S. Apta::Dldh,收集发酵液获得D-乳酸。
所述发酵培养的方式为先光照振荡培养，再黑暗静止培养；所述发酵培养的温度为30°C ;所述发酵所述重组蓝藻S. Apta: :Dldh培养的培养基为BG-Il培养基；
所述光照振荡培养的光强为100 μ m/m2 · s,振荡频率为130r/min，培养时间为培养至所述重组蓝藻S. Apta: :Dldh细胞密度达到OD73tl=L 5 ；
所述黑暗静止培养的培养时间为72小时。
所述重组蓝藻S. Apha: :Ter在制备丁醇中的应用也属于本发明的保护范围。
在所述应用中，发酵培养所述重组蓝藻S. Apha: :Ter，收集发酵液获得丁醇。
所述发酵培养的方式为先光照振荡培养，再黑暗静止培养；所述发酵培养的温度为30°C ;所述发酵所述重组蓝藻S. Apha: :Ter培养的培养基为BG-Il培养基；
所述光照振荡培养的光强为100 μ m/m2 · s，振荡频率为130r/min，培养时间为培养至所述重组蓝藻S. Apha: :Ter细胞密度达到OD73tl=L 5 ；
所述黑暗静止培养的培养时间为72小时。
在本发明中，所述蓝藻具体为淡水蓝藻集胞藻6803。
本发明所提供的蓝藻高效表达系统，使蓝藻可以利用太阳能将CO2高效合成化学品(包括在蓝藻中表达单个基因直接生产蛋白质和创建合成途径生产大宗化学品)；把内源基因敲除和外源基因的稳定、高效表达与改变蓝藻内源碳流相偶联；使外源基因在蓝藻中的表达量可以达到总可溶蛋白的15%，可与大肠杆菌高效表达系统的表达量相比；使依赖乙酰辅酶A的大宗化学品产量显著提高，为提高蓝藻利用CO2生物合成化学品产量、推动蓝藻产化学品工业化提供有力工具。
图I为整合表达载体pMD-Apta: :X和pMD-Apha: :X的构建流程图。其中，A为 pMD-Δpta: :X ;B为pMD-Δpha: :X。A中,pta up即表示UP-1片段(pta同源臂中的上游同源臂)，pta down即表示DOWN-1片段(pta同源臂中的下游同源臂)。B中，phaE up即表示 UP-2片段(pha同源臂中的上游同源臂)，phaC down即表示D0WN-2片段(pha同源臂中的下游同源臂)。
图2为重组蓝藻S. Apta: :Dldh基因水平鉴定图。
图3为重组蓝藻S. Apta: :Dldh蛋白水平鉴定图。
图4为HPLC检测重组蓝藻S. Apta: :Dldh发酵液中产物D-乳酸及乙酸含量。
图5为重组蓝藻S. Apha: :Ter基因水平鉴定图。
图6为重组蓝藻S. Apha: :Ter蛋白水平鉴定图。
图7为GC-MS检测重组蓝藻S. Λ pha: : Ter发酵液中产物丁醇及聚羟基丁酸 (PHB)0 A为丁醇检测结果；B为聚羟基丁酸(PHB)检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
大肠杆菌(E. coli) DH5 α购自北京全式金生物技术有限公司。
载体pMD-18T-simple :购自北京全式金生物技术有限公司。
淡水蓝藻集胞藻6803 (Synechocystis sp. PCC 6803)属于色球藻科、集胞藻属；参考文献Zhang S，Spann K ff, et al. Identification of two genes, sll0804 and slrl306，as putative componentsof the C02_concentrating mechanism in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. JBacteriol. 2008，190:8234-8237， 公众可从中国科学院微生物研究所获得。
质粒pRL271 :参考文献Wei TFj Ramasubramanian TSj et al. Anabaena sp. strain PCC 7120ntcA gene required for growth on nitrate and heterocyst development. J Bacteriol.1994，176:4473-4482。
蓝藻表达载体pAM2770 :参考文献Wu X，Li DW, et al. The Anabaena sp. strainPCC 7120asrl734 gene encodes a negative regulator of heterocystis Development. MoleculMicrobiol. 2007，64:782-794，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
BG-II培养基组成见表I。
Trace metal mix A5 组成见表 2。
表1BG-11培养基组成
权利要求
1.环状载体，包含启动子Pcpc,以及位于所述启动子Pcpc下游的终止子TrbcL； 所述启动子Pcpc的核苷酸序列如序列表中序列I所示；所述终止子TrbcL的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
2.根据权利要求I所述的环状载体，其特征在于所述环状载体还包含DNA片段I和DNA片段2 ;所述DNA片段I位于所述启动子Pcpc的上游，所述DNA片段2位于所述终止子TrbcL的下游； 所述DNA片段I的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述DNA片段2的核苷酸序列如序列表中序列4所示。
3.根据权利要求I所述的环状载体，其特征在于所述环状载体还包含DNA片段3和DNA片段4 ;所述DNA片段3位于所述启动子Pcpc的上游，所述DNA片段4位于所述终止子TrbcL的下游； 所述DNA片段3的核苷酸序列如序列表中序列5所示；所述DNA片段4的核苷酸序列如序列表中序列6所示。
4.根据权利要求1-3中任一所述的环状载体，其特征在于在所述启动子Pcpc和所述终止子TrbcL之间存在用于插入待表达基因的酶切位点。
5.根据权利要求1-4中任一所述的环状载体，其特征在于所述环状载体中还包含抗性基因； 所述抗性基因具体为卡那霉素抗性基因或氯霉素抗性基因； 所述卡那霉素抗性基因的序列具体如序列表中序列7所示；所述氯霉素抗性基因的序列具体如序列表中序列8所示。
6.根据权利要求5所述的环状载体，其特征在于所述环状载体为如下(a)或(b) Ca)将序列表中序列9所示的DNA片段与T-载体连接后得到的重组载体； (b)将序列表中序列10所示的DNA片段与T-载体连接后得到的重组载体。
7.权利要求1-6中任一所述的环状载体在蓝藻中表达目的蛋白的应用。
8.环状载体，为将待表达蛋白的编码基因插入到权利要求2-6中任一所述的环状载体的所述启动子Pcpc和所述终止子TrbcL之间得到的重组载体。
9.重组蓝藻，为将权利要求8所述环状载体导入到目的蓝藻中后得到的重组蓝藻。
10.DNA片段，为如下(I)或(2) (O核苷酸序列为序列表中序列9所示的DNA片段； (2)核苷酸序列为序列表中序列10所示的DNA片段。
全文摘要
本发明公开了一种蓝藻整合表达载体及其应用。本发明所提供的载体为环状载体，包含如序列1所示的启动子Pcpc，以及位于所述启动子Pcpc下游如序列2所示的终止子TrbcL；所述环状载体还包含如下1)或2)1)位于所述启动子Pcpc上游如序列3所示的DNA片段1，以及位于所述终止子TrbcL下游如序列4所示的DNA片段2；2)位于所述启动子Pcpc上游如序列5所示的DNA片段3，以及位于所述终止子TrbcL下游如序列6所示的DNA片段4。本发明所提供的载体可在蓝藻体内利用太阳能将CO2高效合成化学品，把内源基因敲除和外源基因稳定、高效表达与改变蓝藻内源碳流相偶联，使外源基因在蓝藻中的表达量可达总可溶蛋白的15%，本发明为推动蓝藻产化学品工业化提供有力工具。
文档编号C12N1/13GK102978229SQ201210480928
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月23日 优先权日2012年11月23日
发明者周杰, 张海峰, 张延平, 李寅 申请人:中国科学院微生物研究所