专利名称：油菜BnRabGDI3启动子的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程和生物技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜BnRab⑶13基因启动子(命名SPBnKabeDI3，以下相同)，同时还涉及一种甘蓝型油菜BnRab⑶13启动子的制备方法。本发明还涉及含有该启动子或其实质同源核苷酸序列的载体和涉及利用该启动子在油菜及其它植物基因工程中的应用。
背景技术：
植物基因启动子在基因的表达调控中起着关键作用。基因表达的调控是多种因素综合作用的结果。一般按照一个事件的先后顺序，基因的调控分为转录水平的调控、翻译水平的调控以及蛋白质加工水平的调控等。基因编码的蛋白质和RNA及其次级代谢产物对于维持生物体的整个生命活动极其重要。任何基因表达调控的错误都会对生命造成严重后 果。因此，对于基因表达调控的机理研究一直是分子生物学研究的热点。转录水平的调控最为重要。启动子是转录水平调控的重要元件，也是基因工程表达载体的一个重要组成部分。植物基因启动子是位于结构基因5’端上游区、含有顺式作用元件的一段DNA序列，决定着下游基因转录的特异性、方向和效率，是基因转录调控机制和表达模式中最关键的因子。此外，启动子在构建能够高水平表达异源表达载体的过程中起到关键作用，它决定了外源基因的基因表达的时空顺序、表达强度、转录效率和基因的表达水平。所以，研究启动子的功能序列对于基因表达调控机制以及日渐成熟的植物基因工程具有非常重要的科学意义。通过对多种植物基因启动子区的分析发现，绝大多数功能蛋白基因的启动子都具有共同的结构模式，一般由启动子核心元件和上游元件组成。位于转录起始位点上游-20—30bp处的TATA box为启动子核心元件，是富含有AT的保守序列区，与DNA双链的解链有关，并决定转录起始点的选择，是绝大多数植物启动子正确表达所必需的。TATAbox上游的保守序列称为启动子上游元件，包括上游_75bp处的CAAT box和-80—110bp附近的GC box等一般上游启动子元件及其他特殊的上游元件，如茉莉酸类物质应答元件(JRE)、乙烯响应元件(ERE)等元件(张春晓等，植物基因启动子研究进展。遗传学报，2004，31 (12) :1455-1464 ;路静等，高等植物启动子及其应用研究进展。自然科学进展，2004，14
(8):856862)。CAAT box是比较保守的序列，与RNA聚合酶的识别和结合有关，对基因转录有较强的激活作用。然而有些基因无此框，如禾谷类作物的贮藏蛋白基因中无CAAT框而被CATC框代替。GC box的保守序列是5‘GGGCGG3’，可有多个拷贝，并能以任何方向存在而不影响其功能(路静，赵华燕，何奕昆，宋艳茹，高等植物启动子及其应用研究进展。自然科学进展，2004，14 (8):856862 ;夏江东，陈在全，吴渝生，季鹏章，高等植物启动子功能和结构研究进展。云南农业大学学报，2006，21 (1):714)。只要具有了这些保守的结构框，那么就可以具有相应的启动下游基因表达的功能。根据植物启动子的转录模式可将其分为组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。组成型启动子驱动的外源基因在转基因植株的所有发育时期和组织中稳定表达。对许多双子叶植物的转化，通常都使用来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子或来自细菌的胭脂氨酸合成酶nos启动子的质粒载体，而在单子叶植物转化中最常用的是含有水稻肌动蛋白Act启动子，玉米泛素Ubi启动子及35S启动子的质粒载体(关丽英等，转基因植物中外源基因的有效表达及其安全评价。首都师范大学学报，2002，23 (2):52-56)。但是很多时候外源基因在受体植物中的持续高效表达不仅造成生物体内能源的浪费，而且在所有组织中的表达有可能对植株本身具有毒害作用，甚至引起转基因安全问题(JiaS-R. Environment and food biosafty assessment of transgenic plants. Advanced ofBioengineer· 1997，17:37-42 ;Moris S H，Adley C. C. Irish public perceptions andattitudes to modern biotechnology:an overview with a focus on GM foods. Trendsin Biotechnology. 2001，19:43-48)。因此，诱导型启动子和组织特异性启动子的研究和应用日益受到育种工作者的重视。在转基因植物中鉴定的诱导型启动子主要包括非生物胁迫诱导型启动子，生物胁迫诱导型启动子和激素诱导型启动子等(聂丽娜等，植物基因启动子的克隆及其功能研究进展。植物遗传资源学报，2008,9 (3) : 385-391 )。但是诱导型启动子的应用也具有一定限制，对受体植物进行的外在条件处理，如热激，激素处理等可能引起生物 体内一系列的生理生化反应而不利于植株的正常生长。此外，化学调控系统中用作诱导物的甲基脱氢!皮质醇(dex, dexamethasone)、雌二醇(estradiol)和四环素(tetracycline)都对生态环境有害，不宜用于生产实践。使用植物体内本身的组织特异性启动子就可以避免这种问题，显然，外源基因的组织特异性表达必将有效提高转基因作物的生物安全性。(宋扬等，植物组织特异性启动子研究。生物技术通报，2007，(4) :21-24).近些年来，关于组织特异性启动子研究取得了很大的进步，这些组织特异性启动子主要包括叶片、韧皮部、维管束和根等器官特异表达启动子和花粉、花器官、果实、种子等生殖器官特异表达启动子(宋扬等，植物组织特异性启动子研究。生物技术通报，2007，(4) :21-24)。如Ariizumi等分离了 LTP12, XTH3和PGA4的启动子并转化拟南芥，GUS染色表明这3个启动子为花药特异表达启动子，且在不同的时期表达存在差异(Ariizumi et al, Comparative study of promoter activity of three anther-specificgenes encoding lipidtransfer protein, xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase and polygalacturonase in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant CellReport. 2002, 21:90 - 96) 0在芝麻中克隆得到微粒体油酸脱氢酶基因(FAD2)的启动子，预测分析显示此启动子中的E-box和G-box元件与三酰甘油的生物合成有关。通过转化拟南芥后检测⑶S基因表达，结果显示该启动子在种子中特异表达(Mi Jung Kimetal. Seed-specific expression of sesame microsomal oleic acid desaturase iscontrolled by combinatorial properties between negative cis-regulatory elementsin the SeFAD2promoter and enhancers in the5’-UTR intron. Molecular Genetics andGenomics. 2006,276:351-368)。耿安奇等从白菜型油菜、甘蓝型油菜、菜苔、甘蓝中分离了 4个启动子并转化烟草，GUS染色分析表明其为花器官特异表达的启动子(Geng etal.Expression analysis of four flower-specific promoters of Brassica spp.in theheterogeneous host tobacco. African Journal of Biotechnology. 2009, 8(20):51935200)。此外，Mariani等将烟草花药绒毡层特异表达基因启动子TA29与核酸酶基因Barnase、RnaseTl融合后转化植物，核酸酶基因在花药中特异表达，并破坏绒毡层，获得雄性不育烟草和油菜(Mariani C. etal. Induction of male sterility in plants by a chimaericribonuclease gene. Nature, 1990，347:737741 )。目前 TA29 启动子已在烟草、玉米、油菜、拟南芥、水稻等植物上应用并获得成功(宋扬等，植物组织特异性启动子研究。生物技术通报，2007，(4):2124)。由此可见，即使不同的植物之间的体内环境不同以及基因间存在互作差异，即使是与拟南芥性质差异较大的植物，只要具有保守的核心启动区域和相应保守的调控元件，就可以在其他不同植物中发挥启动下游基因表达的生物学功能。近年来，对启动子的功能研究，大量文献报道采用的方法通常是先用生物信息学初步预测和分析启动子序列后，再将启动子片段与报告基因融合构建表达载体，转化模式植物拟南芥、烟草、水稻等的离体培养细胞或植物体，再通过检测报告基因在转基因个体中的表达情况分析启动子的功能并加以利用。大量的文献报道显示其他植物的启动子转化到上述植物中均可正常的行使其生物功能，如在芝麻中克隆的微粒体油酸脱氢酶基因(FAD2)的启动子，此启动子中的E-box和G-box元件与三酰甘油的生物合成有关。在转基因拟南芥和其他转基因植物中也显示出了种子特异性的表达(Mi Jung Kim, Heeja Kim, Mi Chung Suh. Seed-specific expression of sesame microsomal oleicacid desaturase is controlledby combinatorial properties between negativecis-regulatory elements in the SeFAD2promoter and enhancers in the5 ' -UTRintron. Molecular Genetics and Genomics. 2006，276 (4) : 351-368)。从玉米中克隆的ZmGLUl基因启动子，连接⑶S报告基因后转化至烟草中，检测分析结果玉米的ZmGLUl启动子驱动了 GUS基因在烟草根部高效表达(Riliang Gu, Li Zhao, Guoying Wang. Isolationof a maize beta—glucosidase gene promoter and characterization of its activityin transgenic tobacco. Plant Cell Reports. 2006，25 (11) : 1157-1165)。从马铃薯中分离的一个与乙醇脱氢酶非常相似的TDF511 (tran-script derived fragment)基因Stgan的启动子。构建Stgan启动子-GUS融合表达载体转化烟草，GUS组织化学染色显示该启动子驱动基因在烟草茎结节处特异表达，可能参与块茎形成过程(Trindade L M, etal. Isolation and functional characterization of a stolon specific promoter frompotato (Solanum tuberosum L.). Gene, 2003, 303:77-84.)。以上这些报道都是利用转基因技术在不同的植物间进行启动子功能分析的例子，这些实例表明利用模式植物拟南芥、烟草等作为载体，通过转基因植株的表达分析证实来自于其他植物的启动子的功能是被广泛认可和接受的。油菜作为中国主要的油料作物，在长江流域广泛种植，对国计民生具有重要影响。随着转基因技术的成熟，转基因油菜必然会面临转基因安全风险的舆论。用在油菜种子中完全不表达的启动子来启动目的基因的表达是解决这个问题的一个可行方法，既达到既提高油菜各方面品质，又不引起食用油安全风险的目的。因此，本发明开发了一个甘蓝型油菜内源启动子。通过检测报告基因⑶S的表达特征证明启动子驱动的基因在根、茎、叶片、角果、种子中不表达，在花药和花粉粒中高量表达。我们的结果预示着该基因的启动子在转基因植物中具有良好的应用前景
发明内容
本发明的第一个目的是在于提供了一种甘蓝型油菜PBnKabeDI3启动子，其优点在于二个方面首先，来源于油菜内源的组织特异性启动子能够精确定位所调控的基因，驱动目的基因在转基因油菜的特定组织或时期表达，避免造成植物自身能源和物质的浪费。其次，提高外源基因在转基因植物中的表达效率，限制其表达部位。因此，该启动子可应用于植物的基因工程研究和籽用油菜安全转基因研究。本发明的第二个目的是在于提供了一种甘蓝型油菜PBnKabeDI3启动子的制备方法。该方法以甘蓝型油菜基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得甘蓝型油菜PBnEabeDI3序列。其优点在于操作简单，结果稳定可靠。本发明的第三个目的是在于提供了一种含有植物高效表达启动子的重组载体，其含有所述的启动子核苷酸序列。该载体大小适合，在植物中易与转化，所带有的标记基因GUS表达强度高，容易检测。通过这个载体转化拟南芥可以获得GUS基因在植物中高效表达的拟南芥转基因植株。本发明第四个目的是在于提供了一种甘蓝型油菜PBnKabeDI3启动子在花药、花粉粒 中的应用。在该启动子的驱动下，目的基因主要在植株的花药中精细表达，在其它部位不表达。这一具有组织特异性表达的启动子在创建不育系、人工创建种质资源等基因工程和转基因安全(食用、花粉漂流)中具有良好的应用价值。为了完成上述目的，本发明采用如下技术方案为了获得本发明，发明人对油菜发育过程中的相关基因进行了深入和全面的研究，结果发现一种新的启动子。该启动子驱动的内源基因在拟南芥的花药和花粉粒中高效表达。根据本发明的一个方面，上述目的可以通过提供一种启动子来实现，所述启动子能够特异性驱动下游基因在拟南芥中高效表达，所述启动子含有SEQ ID No. I核苷酸序列或与SEQ ID No. I实质上同源的核苷酸序列。根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供含有所述启动子的核苷酸序列的重组载体来实现。根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供用所述重组载体转化的微生物来实现。根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供用所述微生物转化的转基因拟南芥来实现。I 一种甘蓝型油菜启动子PBnEabeDI3的制备方法，其步骤是I. I同源序列法克隆
PBnEabGDI3 序列I. I. I油菜启动子
PBnEabGDI3 的引物序列根据油菜全基因组测序获得的BnRab⑶13基因序列信息，在其ATG起始密码子处上游2kb位置序列设计一对引物进行PCR扩增，此序列包括甘蓝型油菜BnRab⑶13基因的起始密码子和该基因的启动子序列。采用的引物为PBnRab⑶I3S :5' -(Kpn I)CAGaagcttGAGTAAATACAGAACAGTGTTAC-3'和 PBnRab⑶I3A :5' -(Xba I)GACAtctagaTGTTGCAACCAATCTCTATTATC-3/。所用正向引物PBnRab⑶I3S含有Kpn I酶切位点，反向引物PBnRab⑶I3A含有Xba I酶切位点。I. 2. 2油菜启动子
PBnEabGDI3 的制备
本发明所用油菜为甘蓝型油菜(Brassica napus L.)中双九号(油料作物研究所王新发副研究员提供，以下相同)。中双九号播种于大田，正常田间管理。利用SDS裂解法(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社，以下相同)提取中双九号油菜叶片基因组DNA，以此为模板进行PCR扩增，步骤是提取基因组DNA25y 1，以此为模板进行扩增，反应体系为50 μ 1，分别添加IOXEx Taq buffer5y I,dNTP4 μ 1，5，引物 I μ 1，3，引物 I μ I,ExTaqO. 5 μ 1，DNA 模版 I μ I 约 50ng, ddH2037. 5 μ I。引物为根据油菜全基因组测序获得的BnRab⑶13基因上游2kb序列设计的PBnRab⑶I3S和PBnRab⑶13A (前面已述)。扩增产物大小为2064bp，PCR反应程序为94°C 5分钟，94°C I分钟，60。。I分钟，720C 2分钟，33个循环，72°C 10分钟，16°C 3小时，PCR产物经I. 0% (琼脂糖凝胶/TE溶液质量体积比，以下相同)琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技北京有限公司，以下相同)纯化回收后，连接到PMD18-T载体(购自大连宝生物工程有限公司，以下相同)，热激法(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社，以下相同)转化gold菌株的感受态细胞(购自大连宝生物工程有限公司，以下相同)，涂布于含有氨苄青霉素50μ g/mL (质量体积比，以下相同)的LB固体培养基(配方如下分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，8克琼脂依次溶解 于蒸馏水中，定容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中，121 °C，6. 859 X 104Pa下高压消毒20分钟。分装到培养皿中，4°C冷藏备用，以下相同)平板上，37°C培养过夜，挑选白斑6个。采用 M13 引物5' -TGTAAAACGACGGCCAGT-3'和 5' -CAGGAAACAGCTATGACC-3'，做菌落PCR检测。菌落PCR具体方法(以下相同)是用灭菌的牙签挑取少量菌斑做模版，反应体系为 10 μ L 内含:10XTaq buffer (含 MgCl2)ly I, I. 5mmol/L dNTP (10mmol/L) I μ 1，5’引物(10ymol/L)0. 5μ 1，3，引物(10 μ mol/L) O. 5 μ l,Taq(5U/y 1)0. 5 μ l，ddH206. 5 μ I。反应条件为94°C 5分钟，94°C I分钟，550C I分钟，72°C 2分钟30秒，33个循环，72°C 10分钟，扩增大小为2064bp，I. 0%(前面已述)琼脂糖凝胶电泳检测大小正确后。将PCR检测大小正确的菌斑接种到含氨苄青霉素50 μ g/mL的液体LB培养基(配方如下分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升，121°C，6. 859X104Pa下高压消毒20分钟，以下相同)，37°C下200r/min振荡培养过夜，小量碱法(J.萨姆布鲁克.D. W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社，以下相同)提取质粒，I. 0% (前面已述)琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA大小正确后(为2064bp)，采用Kpn I /Xba I酶(2种酶购自TaKaRa公司，以下相同)切对质粒进行双酶切(以下相同),酶切体系(以下相同)为 10 μ 1，包含质粒 DNA5y I, Kpn I O. 5 μ I, Xba 10. 5 μ l,ddH204y 1，37°C 过夜，
I.0% (前面已述)琼脂糖凝胶电泳检测。将检测正确的阳性重组克隆命名为pMD18-PBnEabeDI3(将目的片段PBnKabeDI3连入PMD18-T载体构建而成，以下相同)，为了确保载体中启动子的序列信息，将pMD18-PBnKabeDI3送上海英骏公司进行测序，分析结果显示，获得了一种分离的油菜BnRab⑶13基因全长启动子，其序列为SEQ ID NO: I所示核苷酸序列。命名为PBnKaM)I3。将所克隆并测序得到的BnRab⑶13上游序列PBnKab_用启动子核心元件和上游顺式作用兀件用预测软件 PLACE 中的 Signal Scan Search (Higo et al. , Plant cis-actingregulatoryDNA elements(PLACE) database. Nucleic Acids Research. 1999,27:297 300. http ://www. dna. affrc. go. jp/PLACE/signalscan. html)、PlantCARE (MagaliLescot, Patrice DAehais,Gert Thijs,et al. PlantCARE,a database of plantcis-acting regulatory elements and a portal to tools for in siIico analysis ofpromoter sequences. Nucleic Acids Res, 2002, 30(I):325-327. http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) 和 Softberry 的 PlantPromDB (IIhamA. Shahmuradov, Alex J. Gammerman, John M. Hancock, et al. PlantProm:a database ofplant promoter sequences. Nucleic Acids Res.,2003,31 (I):114-117. http://linuxl.softberry.com/berry, phtml topic=pIantprom&group=data&subgroup=pIantprom)这些在线软件进行BnRabGDI3启动子核心元件和上游顺式作用元件的在线预测分析。结果表明，BnRab⑶13启动子序列PBnKab_含有真核生物启动子必须的核心元件TATA-box 和 CAAT-box，与 TATA-box 相距 30bp。与 CAAT-box 相距 60bp 处的 A 为转录起始位点，这与真核生物的转录起始位点多为A这一规律一致。进一步分析该启动子序列发现，除了必须的核心元件之外，BnRabGDI3启动子序列中还存在多种已知的启动子功能元件(I) P0LLENILELAT52 (AGAAA)、LAT enhancer element (TGTGA)、GTGA-motif (GTGA) 和TTTCT元件，这些是花粉特异启动子的功能元件；(2 ) CCGTCC-box (CCGTCC )，为分裂组织特异表达元件；(3) Skn-Ijnotif (GTCAT),为胚乳高水平表达的顺式调控元件；(4)MBS (TAACTG)，为响应干旱胁迫的MYB蛋白结合位点；(5) TCA_element (GAGAAGAATT)，为水杨酸顺式调控元件；(6)CGTCA-motif (CGTCA)，为茉莉酸甲酯响应元件；(7) 02-site(GATGATGTAG)，为代谢调控位点；(8)D0FC0REZM (AAAG)，是Dof转录因子的作用位点(BateN,Twell D. Functional architecture of a late pollen promoter:pollen-specifictranscription is developmentalIy regulated by multiple stage-specific andcodependent activator elements.Plant Molecular Biology. 1998, 37, 859 - 869 ；Park, J. I. , Hakozaki, H. , Endo, M. , et al. Molecular characterization of maturepollen-specific genes encoding novelsmalI cysteine-rich proteins inrice (Oryza sativa L·)· Plant Cell Reports,2006, 25 (5):466-474 ；Rogers, H.J. , Bate, N. , Combe, J. , et al.Functional analysis of cis-regulatory elementswithin the promoter of the tobacco late pollen gene glO[J]. PlantMolecularBiology, 2001, 45(5) :577 - 585.)(图 2)。由此申请人预测 BnRab⑶ 13 的启动子可能是一个花药特异启动子，而且由于多个成熟花粉特异元件和增强子的存在，它可能在花药的成熟花粉细胞中表达量最高。本发明通过将转PBnKabeDI3连接报告基因⑶S构建的植物表达载体pBI-PBnKabeDI3转化拟南芥，对获得的转基因植株进行活性检测的结果表明该启动子驱动的⑶S基因仅在拟南芥的花药中高效表达，在种子、叶片、根及茎中均不表达。因此，PBnEabGDI 3具有驱动下游基因在拟南芥花药中闻效表达，而在种子和其他部位不表达的功能。这一具有组织特异性表达的启动子在植物基因工程和转基因安全(食用)中具有良好的应用价值。2、一种甘蓝型油菜启动子PBnKabeDI3在转基因植株的花药中的应用，其步骤是2. lPBnEabGDI3植物表达载体的构建和根癌农杆菌菌株EHA105 (购于上海沪尚生物科技有限公司，以下相同)的转化构建的重组载体是将质粒pBI121(购自TaKaRa公司，以下相同)上的35S启动子用技术方案I中克隆得到PBnEabeDI3片段替换而来。为完成此目的，首先用Xba Ι/Κρη I(Chen, P. Y. , Wang, C. K. , Soong, S. C. To, Κ. Y. Complete sequence of the binary vectorpBI121and itsapplication in cloning T-DNA insertion from transgenic plants. Mol.Breed. 11，287-293)双酶切克隆载体pMD18-PBnEaM)I3的启动子片段，同时用Xba I/Kpn I(前面已述)酶切PBI121质粒。酶切体系(前面已述)为10 μ 1，酶切反应在37度培养箱中进行，约4-6个小时之后，用I. 0% (前面已述)琼脂糖胶电泳检测。将克隆载体pMD18-PBnEabeDI3酶切下的大片段(大小为2064bp，和pBI121 (前面已述)酶切下的小片段(约1400bp)用DNA凝胶回收试剂盒(前面已述)回收。按pMD18-PBnEabeDI3酶切下的大片段和pBI121 (前面已述)酶切下的小片段(150ng大片段50ng小片段)=3:1的比例(摩尔浓度比)混合样品，力口入T4DNA连接酶I μ 1，IOX反应缓冲液I μ 1，无菌的ddH20补充体积至10 μ L，16°C连接过夜。热激法(前面已述)转化gold菌株的感受态细胞(前面述)后,在含有卡那霉素(50μ g/mL)的固体LB培养基(前面述)平板上筛选，挑取白色菌斑做菌落PCR (前面述)，提取质粒(前面已述)，经酶切验证大小正确(酶切片段为2064bp)的重组质粒命名为pBI-PBnKabeDI3 (图3)。利用冻融法(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社，以下相同)转化农杆菌EHA105 (前面已述)步骤如下I :取0. 2ml农杆菌感受态，于冰中缓慢融化。 2 :加入约2 μ g重组质粒DNA，轻轻混匀，冰浴30min后，投入液氮速冻lmin，然后37°C水浴5min，融化细胞。3 :加入800 μ I不含抗生素LB液体培养基(前面已述)，28°C轻摇培养4_5h。4:12000rpm，30s，去上清，细胞重悬于0. 2ml LB液体培养基(前面已述)培养基。5 :将培养物均匀涂布在含Rif (50mg/L),Str (50mgL)和Kan (50mgL)的LB固体培养基(前面已述)双抗琼脂板上，280C培养2天，待平板上出现转化子后挑取单菌落进行菌落PCR检测验证(前面已述)。2. 2PBnEabGDI3 的功能分析2. 2. lPBnEabGDI3植物表达载体pBI-PBnEabeDI3在拟南芥中的遗传转化及转基因植株筛选米用花序侵染法(ZhangX. R. et al. Agrobacterium-mediated transformationof Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature, 2006,1:1-6,以下相同)进行拟南芥转化。制备含有重组载体pBI-PBnEabeDI3的根癌农杆菌EHA105 (前面已述)菌液，在转化前一天转入含有卡那霉素50 μ g/ml、利福平50 μ g/ml的LB液体培养基(前面已述)中，28°C过夜培养。第二天，用紫外分光光度计(SPEK0L1300)于276nm纳米波长下检测菌液的吸光值，当菌液的吸光值达到在I. 6-2. O之间时取出。室温(20-25°C，以下相同)下以4000g离心lOmin，弃上清，沉淀悬浮于等体积的5%蔗糖溶液(蔗糖与蒸馏水的质量体积t匕，以下相同)中。将浑浊的蔗糖溶液倒入一大培养皿中，转化前加入终浓度为0. 02% (体积比)的Silwet 1-77 (购自北京五洲元业科贸中心，以下相同)。混匀后把待转化的拟南芥整个花序轻轻的浸没在蔗糖中，默数15秒，取出植株。转化后的植株用一个黑色塑料袋包好，放在生长箱培养。第二天将塑料袋揭开，放在光强的地方培养。隔一周再做一次转化。培养一个月左右收获种子，种子在培养箱或者日光下干燥3-5天。将转化收获的TO代种子用70% (体积比)酒精和0. 1% (质量比)的升汞分别表面消毒3分钟和10分钟，然后用蒸馏水洗涤数次(5 7次)，然后均匀地吹打到含有浓度为50mg/L卡那霉素的MS固体筛选培养基(MS大量元素母液100ml ；MS微量元素母液10ml ；MS有机母液10ml ；MS铁盐IOml ；肌醇IOml ;蔗糖30g ;用IM NaOH调PH至5. 8，12g琼脂粉，定容至1L，高压121度灭菌后备用。加入Sg琼脂粉可配置成固体培养基。各种母液配方见表I)表面。4°C春化4-6天，放入恒温培养箱(光周期16 (白天)/8 (黑暗)小时，温度白天22°C，暗周期20°C)培养，筛选得到的转化植株，称Tl代转化植株(以下相同)。根据表达载体上特有的卡那霉素抗性筛选阳性植株。叶片长到足够大小时(3-4叶期)，取少许绿苗叶片，提取DNA，进行转化材料的 PCR 阳性检测(以下相同)。引物为 NPT II F :5' -GATGGATTGCACGCAGGT-3'和 NPT II R 5 ' -TCAGAAGAACTCGTCAAG-3 '，反应体系为 10 μ I 内含模板 DNA 模板 I μ L (约 50ng)，IOXTaq buffer (含 MgCl2) I μ 1，I. 5mmol/L dNTP (10mmol/L) I μ 1，5’ 弓丨物(lOymol/L)0. 5μ 1，3，引物(10 μ mol/L) O. 5 μ 1，Taq (5U/ μ 1)0. 5 μ 1，ddH205. 5 μ I。反应条件为94°C 5分钟，94°C 30秒，55°C 30秒，72°C I分钟，32个循环，72°C 10分钟，扩增大小为800bp(图4)。结果表明获得了转基因阳性植株(含有检测目的片段的植株称阳性植株，以下相同)。表IMS培养基母液配方
权利要求
1.一种分离的启动子PBnRab⑶13，其序列为SEQ ID No. I所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求I所述的一种分离的启动子，其特征在于所述的启动子含有重组载体 PBI- PBnRab⑶I3。
3.权利要求I所述的一种甘蓝型油菜启动子PBnRabGDI3的制备方法，其步骤是 (O油菜启动子PBnRab⑶13的引物序列 根据油菜全基因组测序获得的Bn Rab⑶13基因上游2kb序列设计一对引物进行PCR扩增，扩增获得油菜BnRab⑶13的5’上游启动子序列，所用引物为PBnRab⑶I3S 5丨CAGaagcttGAGTAAATACAGAACAGTGTTAC-3 '和 PBnRab⑶I3A :5' - GACAtctagaTGTTGCAACCAATCTCTATTATC-3 '; (2)油菜启动子PBnRab⑶13的制备 根据油菜全基因组测序获得的BnRab⑶13的5’上游2kb序列设计所用的引物PBnRab⑶I3S和PBnRab⑶I3A，利用SDS裂解法提取油菜叶片基因组DNA，以此为模板进行PCR扩增，步骤是提取油菜基因组DNA 25 μ 1，以此为模板进行扩增，反应体系为50 μ I,分别添加 IOXEx Taq buffer 5 μ 1，dNTP 4 μ 1，5’ 引物 I μ 1，3’ 引物 I μ 1，ExTaq0.5 μ 1，DNA模版I yl50ng，ddH20 37. 5μ I,扩增产物大小为2064 bp，PCR反应程序为940C 5分钟，94°C I分钟，60°C I分钟，72°C 2分钟，33个循环，72°C 10分钟，16°C 3小时，PCR产物经I. 0%质量体积比琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒纯化回收后，连接到PMD18-T载体，热激法转化gold菌株的感受态细胞，挑取阳性克隆，PCR检测阳性和酶切验证后测序，得到目的基因上游2kb侧翼序列，经过生物信息学分析此序列为BnRab⑶13的启动子全长序列，命名为PBnRab⑶13。
4.权利要求I中所述的一种分离的启动子PBnRabGDI3在拟南芥花药中的应用。
5.权利要求I中所述的一种分离的启动子PBnRabGDI3在拟南芥花粉粒中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种甘蓝型油菜BnRabGDI3启动子的制备方法及应用。其步骤1、获得启动子PBnRabGDI3扩增的引物序列根据油菜全基因组测序获得的PBnRabGDI3基因上游2kb序列设计引物进行PCR扩增；2、利用SDS裂解法提取油菜叶片基因组DNA，进行PCR扩增，凝胶回收试剂盒纯化回收后，连接到pMD18-T载体，热激法转化gold菌株的感受态细胞，挑取阳性克隆，得到目的基因上游2kb侧翼序列，序列为PBnRabGDI3。GUS染色结果表明PBnRabGDI3在油菜花药、花粉粒中高效表达，在根、茎、叶、角果和种子等组织中不表达。该启动子在油菜转基因食用油安全性，提高作物品质和人工创建种质资源等方面，具有良好的应用潜力。
文档编号C12N15/113GK102965374SQ20121049138
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月27日 优先权日2012年11月27日
发明者刘胜毅, 董彩华, 黄军艳, 李振波, 刘越英, 程晓辉 申请人:中国农业科学院油料作物研究所