专利名称：一种低温解烃的红平红球菌t7-3及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物生物技术和环境生物技术领域，具体地说，它涉及一株红平红球菌Rhodococcus erythoropolis T7_3菌株,及其在低温环境下石油污染生物修复中的应用。
背景技术：
随着工业的迅猛发展，水污染日益严重，而海洋污染更成为令人关注的世界性环境问题。在海洋各种污染物中，石油污染是最普遍和严重的一种。石油是当今支撑人类生活的主要能源，并且在可预见的将来其主导地位很难被动摇，因此石油在存储、运输和加工过程中造成的环境污染也必将·日趋严重。据联合国国际海事组织(ΙΜ0)统计，全球每年通过各种途经流入海洋的石油及其制品已达1. OX IO8-L 5Χ IO8吨。海洋石油污染主要来源于海上石油生产、海洋运输、城市污染废水排放等。其中，造成海洋石油污染的主要途径是沿海地区含油废水的排放和海洋石油开发、钻井泄漏等突发事故的发生。据联合国有关组织统计，每年海上油井井喷事故和油轮事故造成的溢油量高达2. 2 X IO7吨。石油进入水体后，造成水体污染，改变局部生态环境，使水生生物死亡，给水资源、生物资源和养殖、旅游业带来巨大损失，造成的污染已引起国家海洋局、国家环保总局和各级地方政府的高度关注。目前，治理海洋石油污染已成为当今世界各国环境专家的研究热点。在海洋滩涂石油污染生物修复处理的过程中，经常会用到烃降解菌株，它们以自己的方式摄取烃类，然后参与自身代谢，最终生成小分子有机酸。目前所知的微生物细胞对于烷烃的摄取机制有以下几个方面一是细胞与烃液滴直接作用微生物细胞可吸附到比自己大得多的烃液滴表面，物质的运输主要靠被动扩散和主动运输。这些细胞对烷烃具有很高的亲和力。通过相差和扫描电镜可以观察到不动杆菌可附着于烷烃小液滴的表面，絮凝物的形成也使得细胞可与烷烃保持紧密接触，从而造成一种微生态环境。当然并非依靠烷烃生长的微生物种群都会附着于烃类，有的细胞与烃的接触可能是依靠一种非特异性疏水作用引起的。二是细胞与“拟增溶”的小液滴互相作用微生物所产生的胞外的生物表面活性剂和生物乳化剂有增加油水界面之间接触面积的作用。1895年，日本三好学博士观察到灰绿色葡萄霉菌能分解葡萄果实表皮的蜡质，被认为是人类第一次发现微生物分解烃，迄今已有百余年历史。目前国外石油污染水体的生物修复方面研究较为深入并且已将其运用于现场修复。相继有学者从被石油污染的土壤与海滩中分离出芽孢杆菌、假单胞菌、诺卡氏菌、链球菌和红球菌，其中从被石油污染的土壤中分离得到一株假单胞菌，2天后对石油中的十六烷降解率为95%，对原油的降解率可达60%，在37°C添加碳氮源的情况下好氧培养60d，浙青质的最高降解率为40%。此外，将不同烃类降解菌混合培养形成混合菌群，便可降解多种烃类。如Baltic General Investment公司的一项专利为利用混合菌群(Azotobacter vinelandi1、Pseudomonas sp. >Pseudomonassp.、Pseudomonas sp.和 Acinetobacter calcoaceticus)来促进石油经类的生物降解。同时，利用微生物对一些石油组分的降解是由遗传物质-质粒所控制的，通过基因工程手段将降解不同组分的质粒整合到一个细胞内，便可构建成“超级细菌”，所得菌株可同时降解直链烷烃、轻质芳烃。我国相关研究起步较晚，2003年，中国农业大学从辽河油田的渣油中分离出8株降解能力强的菌株，其中两株对浙青质的降解率达53%，具有良好的应用前景，经鉴定这两株分别为微杆菌和假单胞菌。暨南大学从广州石化污水处理厂废水中分离出30株除油菌，除油率约在70%左右，最高为83. 67%，且实验菌株在消除石化废水的异味方面也有一定的效果。随着石油工业的发展，石油污染将会日趋严重。而面对一些特殊环境，如低温环境下的石油污染治理，需要使用低温解烃菌。海洋石油污染治理面临的是一种低温的极端环境。近年来，有关嗜冷微生物解烃方面的研究却并不多见。研究开发以烷烃为碳源的低温解烃菌，并使其适用于海洋环境等石油污染修复领域，具有很好的发展前景。
发明内容
本发明的目的在于针对海洋滩涂石油污染日益严重的问题，提供一种适用于低温极端环境的低温解烃红平红球菌(Rhodococcus erythoropolis)T7-3和该菌在生物修复领域的应用。本发明提供的红平红球菌(Rhodococcus erythoropolis)T7-3菌株,于2012年5月11日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏号为CGMCC No. 6104，建议分类命名为红平红球菌(Rhodococcus erythoropolis)。本发明提供的红平红球菌(Rhodococcus erythoropolis) T7-3菌株，是从渤海被石油污染的海底区域采集泥样中分离得到(纬度坐标为东经118° 26' 36"及北纬38° 50' 30")。以液体石蜡为唯一碳源的石蜡培养基中(液体石蜡含量2%)在15° C反复驯化培养十代而获得。红平红球菌(Rho dococcuserythoropolis) T7-3CGMCC No. 6104 的菌落特征在LB平板上培养菌落大小直径3 5_，菌落圆形，较粘稠，不透明，凸起，有光泽，橙色。红平红球菌(Rhodococcuserythoropolis) T7-3CGMCC No. 6104 的细胞形态特征革兰氏染色阳性，菌体呈短杆状，不运动，具有典型的八字型排列特征，细胞大小为
0.8 1. O μ mX 2 3 μ m。红平红球菌(Rhodococcusery thoropo lis )T7-3CGMCC No. 6104 的生理生化特征耐冷菌，生长温度4 一 34°C，最适15 — 25摄氏度，生长pH范围5_10，NaCl耐受性0-7. 5%。触酶，硝酸盐还原，脲酶，七叶灵水解，2，3_ 丁二醇，天冬氨酸实验均为阳性，氧化酶，M. R.，V-P,吲哚，亚硝酸盐还原，反硝化，明胶液化，淀粉水解，腺嘌呤水解实验皆为阴性，能够利用甘露醇，肌醇产酸。降解烷烃和原油，产生生物乳化剂。红平红球菌(Rhodococcuserythoropolis) T7-3CGMCC No. 6104 的 16S rRNA 基因序列特征CGMCC No. 6104接种于LB培养基，15°C摇床培养(130rpm)10小时，离心收集菌体，重新悬浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因组DNA，并采用正相引物27F(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)和反向引物 1541R(5’_AAGGAGGTGATCCA GCC-3’)，用这对引物对其16S rDNA基因进行PCR扩增，将扩增引物送北京三博公司进行测序。PCR条件为94°C, IOmin ;94°C，45s，55°C，45s，72°C 90s，30 个循环；72°C 10min，4°C保存。16S rDNA 基因序列长度为 1377bp,在 GenBank 中的登录号为 DQ855406,与 Rhodococcus erythoropolis(GenBank accession No. AY168586)序列相似性为 99. 93%。其 16S rDNA 的序列如序列表所示。参照《Bergey’sMannual of Systematic Bacteriology》Vol. VIII 的内容，根据其形态特征和生理生化特征，以及根据其16S rDNA基因序列在GenBank中的搜索结果，经多项分类鉴定T7-3为红平红球菌。红平红球菌(Rhodococcuserythoropolis) T7-3CGMCC No. 6104 可以在营养培养基，如普通牛肉汁、LB、营养琼脂中生长，也可以在添加葡萄糖或蔗糖的无机盐培养基中生长，也可以以烷烃或原油为碳源生长。菌株在4 34°C之间均可生长。该菌具有很高的降解石油烃的能力，可降解C12 C36的正构烷烃和原油。用T7-3生长细胞进行降解实验结果表明，该菌在15°C温度条件下，通过基础培养基生长繁殖过程能同时降解加入的lg/L的烷烃或5g/L的原油，其基础培养基组成为(g/L):KH2P043. 5，Na2HPO4L 5,MgSO4O. 7，(NH4) 2S044，酵母粉 0. 01，ρΗ7· 0-7. 2。往复摇床 130rpm转速培养 72h，降解率均可达70%以上，对不同碳数的烷烃降解率有较好的降解效果，如图2所示。该菌在海水培养基中以5g/L柴油作为唯一碳源，25 °C，振荡培养7d降解率为85%。以5g/L原油作为唯一碳源，25°C，振荡培养7d，对稀油作用7d后降解率97. 05% ;对稠油降解率61. 08%，因此具有很好的海洋生物修复的应用前景。本发明的优点和积极效果本发明提供的CGMCC No. 6104菌在15 30°C最适温度条件下，能够以烃为碳源和能源生长，能够利用12碳 36碳的正构烷烃，对原油(5g/L)的降解率可达65%以上；该菌株及其发酵液在低温条件下能很好的 乳化烷烃或原油，进而对烷烃和原油进行降解。该菌株及其发酵液应用于海洋石 油污染生物修复试验，在天然海水配方中通过补加氮磷源，可以对柴油达到85%以上的降解率，对原油达到60%以上的降解率，因此具有海洋环境石油污染生物修复的潜力。
图1是红平红球菌T7-3 (CGMCC No. 6104)对各链长单烷烃的降解效果；图2是红平红球菌T7_3(CGMCC No. 6104)对原油降解的气相色谱图(A为作用前，B为作用后)；图3是红平红球菌T7-3 (CGMCC No. 6104)在生长不同时期的乳化性能和油水界面张力变化曲线；图4是红平红球菌T7-3 (CGMCC No. 6104)发酵液对柴油和原油的乳化效果；图5是红平红球菌T7-3 (CGMCC No. 6104)所产乳化剂对不同底物的乳化指数E1-24 ；图6是红平红球菌T7-3 (CGMCC No. 6104)及混合菌群对柴油的降解情况；图中，A为未接菌的柴油对照；B是培养3山(是培养5(1，0是培养7(14是培养IOd的降解后柴油组分气相色谱图；图7是红平红球菌T7-3 (CGMCC No. 6104)降解稀油前后的气相色谱图(A为降解前；B为降解后)；
图8是红平红球菌T7-3 (CGMCC No. 6104)降解稠油前后的气相色谱图(A为降解前；B为降解后)。
具体实施例方式实施例1 :本发明提供的红平红球菌(Rhodococcus erythoropolis) T7-3菌株的筛选。取渤海被石油污染的海底区域泥样(纬度坐标为东经118° 26' 36"及北纬38° 50' 30")，取5g泥样于IOOmL以2%液体石蜡为唯一碳源的无机盐培养基中(液体石蜡含量2%)，置于200r/min低温摇床15°C富集培养7天，划线得到7株菌的混合菌群命名为T7。吸取5mL富集液移至新鲜的IOOmL液体石蜡培养基中，进行发酵培养，培养条件同上。经过三个周期富集后最终得到主体菌T7-3。将T7-3取一环接入装有5mL LB培养液的试管内，15°C震荡培养48h，作为种子液。取ImL种子液接入装有50mL柴油无机盐培养基的250mL三角瓶中，15°C震荡培养7d，检测菌株对柴油的降解作用。并通过测量乳化指数(E1-24)来验证对柴油乳化能力的强弱，最终得到一株乳化及降解液蜡和柴油效果最好的菌株红平红球菌(Rhodococcus erythoropolis) T7-3。其中无机盐培养基组成g/L KH2P043. 5，Na2HPO4L 5，MgSO4O. 7，(NH4) 2S044,酵母粉
O.05，ρΗ7· 0-7. 2。蒸馏水，1000ml，121°C灭菌 30min。在 15°C条件下，培养 3 天。乳化指数(E1-24)的测定方法如下取4个刻度试管，分别及加入柴油、原油、二甲苯和甲苯各3ml，每个试管中再加入7ml的发酵液，剧烈振荡I分钟，室温静置24小时后测量，以乳化层的高度除以有机相的总高度，再乘100%，即E1-24，如果E1-24>50%，则认为该乳状液是稳定的。实施例2 :本发 明提供的红平红球菌Rhodococcus erythoropolis T7-3菌株的形态特征和生理生化特征。参照《Bergey，sMannual of Systematic Bacteriology)) (Vol. VDD 的实验方法进行，检测其革兰氏染色，菌体大小和形态，有无鞭毛和芽孢，生长温度，生长pH范围，NaCl耐受性。触酶,硝酸盐还原,脲酶,七叶灵水解,2，3-丁二醇，天冬氨酸，氧化酶，M. R.，V-P,吲哚，亚硝酸盐还原，反硝化，明胶液化，淀粉水解，腺嘌呤水解实验以及利用甘露醇，肌醇实验。结果表明，该菌株革兰氏染色阳性，菌体呈短杆状，无鞭毛，不运动，好氧，不产生芽孢，细胞大小2. O 3. Oym(长)X 0.8 Iym(宽)，具有典型的八字形排列。生长温度
4- 340C，生长pH范围5-10，NaCl耐受性0-7. 5%。触酶，硝酸盐还原，脲酶，七叶灵水解，2，3-丁二醇，天冬氨酸实验均为阳性，氧化酶，M. R.，V-P，吲哚，亚硝酸盐还原，反硝化，明胶液化，淀粉水解，腺嘌呤水解实验皆为阴性，能够利用甘露醇，肌醇产酸。实施例3 :本发明提供的红平红球菌Rhodococcus erythoropolis T7-3菌株的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定。将该菌株接种于LB培养基，15°C摇床培养(130rpm) 10小时，离心收集菌体，重新悬浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因组DNA，并采用正相引物27F(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)和反向引物 1541R (5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)，用这对引物对其16S rDNA基因进行PCR扩增，将扩增引物送北京三博公司进行测序。PCR条件为94°C，IOmin ;94°C，45s，55°C，45s，72t 90s，30 个循环；72°C 10min，4°C保存。16S rRNA 基因序列长度为 1470bp,在 GenBank 中的登录号为 DQ855406,与 Rhodococcus erythoropolis(GenBank accession No. AY168586)序列相似性为 99. 93%。其 16S rRNA 基因的序列如序列表所示。实施例4 :本发明提供的Rhodococcus erythoropolis T7-3菌株在30°C对烧烃和原油的降解。将菌株在LB平板上进行活化，取单菌落接入IOOml以乙醇为唯一碳源的无机盐液体培养基中，30°C振荡培养24h至对数生长期，以2%接种量接种至装有IOOml含有不同烷烃或原油为碳源的无机盐培养基(培养基组成同实施例1)的三角瓶中，15°C培养7天，用气相色谱法分析，该菌株对不同碳数烷烃的降解率，用红外测油仪测定原油的降解率并用高压气相色谱法进行残留原油的气相色谱分析，结果如图1，图2和图3所示。该菌株在72h乳化活性达到最高值，72h能使油水界面张力降到最低，对C12 C36烷烃的降解率均有一定程度的降解，对原油(5g/L)的降解率可达87. 05%。检测原油降解率的方法如下将菌落接种至乙醇培养基培养3天左右，作为种子以2% (v/v)比例接入液接入到IOOmLO. 5%原油的无机盐培养基中，30°C震荡培养7d后测定原油降解率。油类测定方法采用红外法，即发酵液用IOOml四氯化碳萃取，用红外测油仪测定剩余原油的量，降解率(％ ) = (1-剩余原油的量/加入原油的量)X 100%。并采用高压气相色谱方法检测原油的降解情况。实施例5 :本发明提供的Rhodococcus erythoropolis T7-3菌株发酵液在15°C条件下对柴油和原油的乳化。Rhodococcus erythoropolis T7-3菌株在以乙醇为碳源的培养基中(同实施例4)生长，15°C振荡培养3天，用其发酵液对柴油和不同底物进行乳化活性分析，如图4所示，以乙醇为碳源生长，该菌发酵液能很好的乳化柴油，E1-24为100%。如图5所示，该菌在以包括正己烷、正壬烷、正十 二烷、正十三烷、正十四烷、正十六烷、苯及二甲苯作为底物进行乳化性能实验，结果显示乳化剂对低碳数烷烃和芳香烃的乳化效果比中长链烷烃效果好。对中长链烷烃，除正十六烷较好外，其它正十二到正十四烷基本相同，均为70% -80%。实施例6 :本发明提供的Rhodococcus erythoropolis T7-3菌株在25°C对烧烃和原油的降解。将菌株在LB平板上进行活化，取单菌落接入IOOml以乙醇为唯一碳源的无机盐液体培养基中，25°C振荡培养24h至对数生长期，以2%接种量接种至装有IOOml含有原油为碳源的无机盐培养基(培养基组成同实施例1)的三角瓶中，25°C培养7天，用气相色谱法分析，对原油(5g/L)的降解率可达80%。检测原油降解率的方法同实施例4。实施例7 :本发明提供的Rhodococcus erythoropolis T7-3菌株在20°C对烧烃和原油的降解。将菌株在LB平板上进行活化，取单菌落接入IOOml以乙醇为唯一碳源的无机盐液体培养基中，20°C振荡培养24h至对数生长期，以2%接种量接种至装有IOOml含有原油为碳源的无机盐培养基(培养基组成同实施例1)的三角瓶中，20°C培养14天，用气相色谱法分析，对原油(5g/L)的降解率可达72%。
检测原油降解率的方法同实施例4。实施例8 :本发明提供的Rhodococcus erythoropolis T7-3菌株在15°C对烧烃和原油的降解。将菌株在LB平板上进行活化，取单菌落接入IOOml以乙醇为唯一碳源的无机盐液体培养基中，15°C振荡培养24h至对数生长期，以2%接种量接种至装有IOOml含有原油为碳源的无机盐培养基(培养基组成同实施例1)的三角瓶中，15°C培养14天，用气相色谱法分析，对原·油(5g/L)的降解率可达65%。检测原油降解率的方法同实施例4。实施例9 :本发明提供的Rhodococcus erythoropolis T7-3菌株在海水培养基中对柴油的降解。将单菌株Π-3以2%接种量或混合菌群按比例接种至IOOmL优化后的天然海水培养基中，并加入5g/L柴油作为唯一碳源，250C，振荡培养7d,选择不接菌作为对照，在3d、5d和7d利用气相色谱法分析菌株T7-3降解柴油的变化。其中，天然海水培养基的配方如下由陈化 7d 的天然海水加入 0. 04% 的(NH4)2SO47O. 204% 的 KH2PO4 和 0. 01% 的 MgSO4, ρΗ7· 2。根据实验需要加入不同碳源。气相色谱法使用角鲨烷作为内标。具体方法如下将菌株培养后的培养液或者对照样品，加入适量正己烷，完全密闭条件下充分振荡混匀萃取，静置分层后取出大部分有机相，再向混合体系中加入正己烷进行二次萃取，重复萃取3次，萃取的有机相合并在一起加入角鲨烷至终浓度为0. 006%(w/v)作内标，定溶至所需体积后用Agilent6820气相色谱仪系统进行分析,色谱柱为SPB _5capillary column(30mX0. 53mm1. d. ,1. 5 μ m thickness) (Supelco)。色谱程序如下进样口28(TC ；柱温150°C,5min,15°C /min 程序升温至 280°C,停留 30min ；检测器(FID)温度350°C；载气(N2):35mL/min ;空气400mL/min；氧气(H2):30mL/min ;尾吹(N2):20mL/min。根据未接菌对照和降解后残余峰面积与加入的角鲨烷内标峰面积的比值来表征底物的降解情况。
对照峰面积/内标峰面积_降解后峰面积/内标峰面积
底物降解率=---^ --X 100%
对照峰面积/内标峰面积结果见图6所示，图中A为未接菌柴油对照；B是培养3d时柴油降解情况，可以看到由于刚刚进入对数期，柴油只有少量降解；C是培养5d时柴油的降解情况，可以看到柴油C16以下的低碳数烷烃几乎降解完全，只有长链烷烃仍有较多残余；D和E是培养7d和IOd的气相色谱图，其中低碳链烷烃几乎降解完全，只有姥鲛烷、植烷及一些长链烷烃仍有少量残余。经过7d的降解实验，菌株T7-3对柴油降解率为85%左右。实施例10 :本发明提供的Rhodococcus erythoropolis T7-3菌株在海水培养基中对原油的降解。将单菌株T7-3以2%接种量接种至IOOmL优化后的天然海水培养基中，并加入5g/L原油作为唯一碳源，250C，振荡培养7d,选择不接菌作为对照，在7d后将培养基用20ml正己烷萃取后进行气相色谱分析。结果见图7和图8，菌株T7-3对稀油作用7d后降解率97. 05% ;对稠油降解率 61. 08%，具有很好的海洋生物修复的应用前景。
权利要求
1.一种红平红球菌(Rhodococcus erythoropolis) T7-3 菌株，保藏号为 CGMCCNo. 6104ο
2.如权利要求1所述的红平红球菌(Rhodococcuserythoropolis) T7-3菌株在海洋环境石油污染生物修复中的应用。
全文摘要
一种低温解烃的红平红球菌T7-3及其用途。本发明红平红球菌T7-3(CGMCC No.6104)，是从渤海被石油污染的海底区域采集泥样中分离得到，为耐冷菌，生长温度4-34℃，最适15-25℃，生长pH范围5-10，氯化钠耐受性0-7.5％；可以烷烃或原油为唯一碳源生长。该菌具有很高的降解石油烃的能力，可降解C12-C36的正构烷烃和原油。对加入的1g/L的烷烃或5g/L的原油，降解率均可达70%以上。在25℃，振荡培养7d，以5g/L柴油作为唯一碳源降解率为85％，以5g/L原油作为唯一碳源，对稀油作用7d后降解率97.05%，对稠油降解率61.08％，因此具有很好的海洋生物修复的应用前景。
文档编号C12R1/01GK103045502SQ20121050880
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者马挺, 黄磊, 李国强 申请人:南开大学