专利名称：一种基于位点特异性重组的抗生素生物合成基因簇的克隆方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基于ΦΒΤ1整合酶系统及同源重组技术实现大片段生物合成基因簇克隆的方法。
背景技术：
天然产物一直在药物的发现和发展过程中发挥着重要作用。在过去几十年里一直是人类治疗疾病的主要药物。然而，随着抗生素的广泛使用，细菌逐渐产生了耐药性，与此同时用传统的方法从自然界中筛选新型天然产物变得越来越困难，因而很难满足疾病治疗的需求。因此，发现新的具有生物活性的天然产物及其结构类似物，已经成为生物、化学和医药界的研究热点。化学合成作为增加天然产物结构多样性的传统方法，工艺繁杂，成本较高。随着分子生物学的发展，组合生物合成的理念被提出，并且正逐渐成为药物研发的重点。组合生物合成通过对天然产物代谢途径的遗传控制来生物合成新型的复杂化合物一方面，特异性地遗传修饰天然产物的生物合成途径，以此获得基因重组菌株，生产所需要的天然产物及其结构类似物；另一方面，将不同来源的天然产物生物合成基因进行重组，在微生物体内建立组合的新型代谢途径，由此重组微生物库所产生的新型天然产物构成了类似物库，有利于发现和发展更具有应用价值的药物。与化学合成相比，其目标产物可以由重组菌株发酵大量生产，因而降低了生产成本和环境污染。抗生素生物合成途径及生物合成基因簇的研究已经有近三十年历史，在这期间，许多较为重要的抗生素合成基因簇均已被注释。发现其中较多抗生素生物合成基因簇都有类似的结构基因和排列特征，特别是PKS，NRPS类抗生素，都以模块式的顺序进行排列。这一特征为基因簇的克隆奠定了基础。然而，抗生素合成基因簇较大，能够达到几十甚至几百kb, Fosmid等载体不能完整的克隆这样大的基因族，因而在对抗生素合成基因族的改造过程中，只涉及到个别基因的缺失和替换。此外，有相当多的微生物遗传操作背景并不被人们所熟知，即便是研究相对较多 的链霉菌，也只有少数菌可以方便的进行遗传操作。而众多的产生一些重要的次生代谢物的稀有放线菌都缺乏有效的转化手段，在原宿主中进行遗传改造十分繁琐且不易成功。本发明利用噬菌体ΦΒΤ1整合酶的作用，使插在抗生素合成基因簇两端的位点特异性重组位点aiii 和ai#发生位点特异性重组反应，基因簇自身环化，进而完成靶标基因簇的克隆。由于在位点attB和ai#之间包含有BAC载体和抗性筛选标记，可以很方便的实现大片段基因簇的克隆操作。
发明内容
本发明的目的是要克服大片段的生物合成基因簇难以用传统方法克隆的问题，提供一种基于链霉菌噬菌体ΦΒΤ1整合酶系统的克隆抗生素合成基因簇的方法。提供的克隆抗生素合成基因簇的方法，首先构建靶标基因簇上下游的两个同源重组载体，将ΦΒΤ1整合酶所识别的位点aiii 和ai#分别插在靶标基因簇的两侧；再通过ΦΒΤ1整合酶介导的位点特异性重组反应，就可以使基因簇自身环化，从而完成基因簇的克隆。本发明以erythromycin基因簇的克隆为例,具体步骤如下
(I)erythromycin基因簇上游同源重组载体pEry-up的构建
以红色糖多孢菌e/yiAraea的基因组为模板,用引物SEQ ID No.2和引物SEQ ID No. 3扩增大小为1993bp的erythromycin基因簇上游同源臂片段，与PMD19-T载体(TAKARA公司)做T-A克隆，得到质粒T-ery-up，选取MunI位点和T载体上的XbaI位点邻近的方向。质粒pTARBAC2.1 [I]和质粒pDZYlOl [2]分别用Nhe1、EcoRI和XbaKEcoRI进行双酶切，产生大小为7478bp和4178bp的两条片段，连接目的片段，得到质粒pBAC-DZYlOl。质粒pBAC-DZYlOl再用NheI和EcoRI进行消化，产生大小为9500bp的目的片段；质粒T-ery-up用MunI和XbaI进行消化，产生大小为4683的目的片段，连接两条目的片段，得到质粒pEry-up,序列如SEQ ID No. 4所示。(2)载体pEry-up的同源插入
将构建好的载体pEry-up转化至大肠杆菌ET12567，挑取阳性转化子与红色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea进行接合转移，30 °C培养16 20h后,在平板表面覆盖Iml含萘啶酮酸(终浓度为50 mg/ml)和卡那霉素(终浓度为30 mg/ml)的无菌水，30°C培养5天以上挑取接合子。(3) erythromycin基因簇下游同源重组载体pEry-down的构建
以质粒PSET152为模板，用引物`SEQ ID No. 5和引物SEQ No. 6扩增大小为2283bp的片段，与PMD19-T载体做T-A克隆得到质粒pT-SET152。以质粒pCY104[3]为模板，用引物SEQ ID No. 7和引物SEQ ID No. 8扩增大小为847bp的片段，与pMD19_T载体做T-A克隆，得到质粒pT-CY104，挑选PCR产物片段上NheI位点离T载体上HindIII位点较远的方向。再用限制性内切酶HindIII, XbaI和HindIII, NheI分别对质粒pT_SET152和质粒PT-CY104进行双酶切，产生大小为2315bp和870bp的两条目的片段，连接后得到质粒pCY104_SET152。以红色糖多孢菌erythraea的基因组为模板，用引物SEQ ID No. 9和引物SEQ ID No. 10扩增大小为2194bp的erythromycin基因簇下游同源臂片段，与pMD19-T载体做T-A克隆,得到质粒pT-ery-down。质粒pT-ery-down和PCY104-SET152再进一步用限制性内切酶Xba1、MunI和Xba1、EcoRI分别进行双酶切，产生大小为2200bp和3129bp的两条目的片段,连接后得到质粒pEry-down,序列如SEQ ID No.11所示。(4)载体pEry-down的同源插入
将构建好的载体pEry-down转化至大肠杆菌ET12567,挑取阳性转化子与插入了上游同源载体pEry-up的红色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea进行接合转移,30°C培养16 20h后，在平板表面覆盖Iml含萘啶酮酸(终浓度为50 mg/ml)和阿泊拉霉素(终浓度为30 mg/ml)的无菌水，30°C培养5天以上挑取接合子。(5)红色糖多孢菌染色体基因组的抽提及体外ΦΒΤ1整合酶所介导的erythromycin合成基因簇的克隆
抽提插入了同源载体pEry-up和pEry-down的红色糖多孢菌基因组，确保基因组片段包含全部的erythromycin基因簇序列。将基因组片段与ΦΒΤ1整合酶在特定的buffer中30° C温育过夜。在ΦΒΤ1整合酶的作用下,erythromycin基因簇两侧的aiii 和aii/M立点发生位点特异性重组反应，进而得到包含erythromycin合成基因簇的全序列，记为质粒PZB201，其序列如SEQ ID No.1所示。本发明方法简单并且高效，可广泛的应用于链霉菌中抗生素合成基因簇的克隆操作。另外，针对其它的能够产生重要次生代谢物的生产菌，例如粘细菌、霉菌等，只要在骨架载体上进行相应的修改，加入相应实验对象所需的元件，获得相应的同源重组载体，即可实现相应基因簇的克隆操作，并不受宿主种类的限制。
图1 :质粒pZB201的结构图。图2 Erythromycin基因簇上游同源重组载体pEry-up的结构图。
权利要求
1.质粒PZB201，其序列如SEQID No.1所示。
2.一种抗生素合成基因簇的克隆方法，其特征在于具体步骤为首先构建靶标基因簇上下游的两个同源重组载体，将ΦΒΤ1整合酶所识别的位点aiii 和ai#分别插在靶标基因簇的两侧；再通过ΦΒΤ1整合酶介导的位点特异性重组反应，使基因簇自身环化，从而完成基因族的克隆。
3.根据权利要求2所述的抗生素合成基因簇的克隆方法，其特征在于，抗生素合成基因簇为erythromycin,具体步骤如下 (1)erythromycin基因簇上游同源重组载体pEry-up的构建 以红色糖多孢菌e/yiAraea的基因组为模板,用引物SEQ ID No.2和引物SEQ ID No. 3扩增大小为1993bp的erythromycin基因簇上游同源臂片段，与PMD19-T载体做T-A克隆，得到质粒T-ery-up，选取MunI位点和T载体上的XbaI位点邻近的方向，质粒PTARBAC2.1和质粒pDZYlOl分别用Nhe1、EcoRI和Xba1、EcoRI进行双酶切，产生大小为7478bp和4178bp的两条片段，连接目的片段，得到质粒pBAC_DZY101 ;质粒pBAC-DZYlOl再用NheI和EcoRI进行消化，产生大小为9500bp的目的片段；质粒T-ery-up用MunI和XbaI进行消化，产生大小为4683的目的片段，连接两条目的片段，得到质粒pEry-up，序列如 SEQ ID No. 4 所示； (2)载体pEry-up的同源插入 将构建好的载体pEry-up转化至大肠杆菌ET12567，挑取阳性转化子与红色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea.进行接合转移，30 °C培养16 20h后,在平板表面覆盖Iml含萘啶酮酸和卡那霉素的无菌水，30°C培养5天以上挑取接合子； (3)erythromycin基因簇下游同源重组载体pEry-down的构建 以质粒PSET152为模板，用引物SEQ ID No. 5和引物SEQ No. 6扩增大小为2283bp的片段，与PMD19-T载体做T-A克隆得到质粒pT-SET152 ;以质粒pCY104为模板，用引物SEQID No. 7和引物SEQ ID No. 8扩增大小为847bp的片段，与pMD19_T载体做T-A克隆，得到质粒pT-CY104，挑选PCR产物片段上NheI位点离T载体上HindIII位点较远的方向；再用限制性内切酶HindII1、XbaI和HindII1、NheI分别对质粒pT_SET152和质粒pT_CY104进行双酶切，产生大小为2315bp和870bp的两条目的片段，连接后得到质粒pCY104_SET152 ；以红色糖多孢菌e/yiAraea的基因组为模板,用引物SEQ ID No. 9和引物SEQ ID No. 10扩增大小为2194bp的erythromycin基因簇下游同源臂片段，与pMD19_T 载体做 T-A 克隆，得到质粒 pT-ery-down ;质粒 pT-ery-down 和 pCY104_SET152 再进一步用限制性内切酶Xba1、MunI和Xba1、EcoRI分别进行双酶切，产生大小为2200bp和3129bp的两条目的片段,连接后得到质粒pEry-down,序列如SEQ ID No. 11所示； (4)载体pEry-down的同源插入 将构建好的载体pEry-down转化至大肠杆菌ET12567,挑取阳性转化子与插入了上游同源载体pEry-up的红色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea进行接合转移,30°C培养16 20h后，在平板表面覆盖Iml含萘啶酮酸和阿泊拉霉素的无菌水，30°C培养5天以上挑取接合子； (5)红色糖多孢菌染色体基因组的抽提及体外ΦΒΤ1整合酶所介导的erythromycin合成基因族的克隆抽提插入了同源载体pEry-up和pEry-down的红色糖多孢菌基因组，确保基因组片段包含全部的erythromycin基因簇序列；将基因组片段与ΦΒΤ1整合酶在特定的buffer中·30° C温育过夜；在ΦΒΤ1整合酶的作用下，erythromycin基因簇两侧的aiii 和<3(#位点发生位点特异性重组反应，进而得到包含erythromycin合成基因簇的全序列，记为质粒PZB201，其序列如SEQ ID No.1所示。
全文摘要
本发明属于生物技术和基因工程领域，具体为一种基于位点特异性重组系统实现抗生素生物合成基因簇克隆的方法。本发明是基于链霉菌噬菌体φBT1自身编码的整合酶所介导的位点特异性重组反应，先通过同源重组的方式对抗生素产生菌株进行遗传改造，在靶标基因簇的两端分别插入BAC载体、抗性基因和φBT1整合酶所识别的位点特异性重组位点attB和attP，抽提染色体基因组片段，在φBT1整合酶的作用下于体外使attB和attP位点之间发生位点特异性重组反应，靶标基因簇自身环化，从而实现几十甚至几百kb的大片段抗生素生物合成基因簇的克隆，为生物合成基因簇进一步进行遗传修饰奠定了基础，具有很好的应用前景。
文档编号C12N15/66GK103060362SQ201210508069
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者张渤, 丁晓明, 赵国屏 申请人:复旦大学