SYBRGreen荧光染料DNA定量检测方法和试剂盒的制作方法

SYBR Green 荧光染料DNA定量检测方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及DNA定量检测方法和检测试剂盒。本发明建立了SYBR?Green?I荧光染料法对DNA定量的条件，得到了该方法的线性范围和灵敏度，可以快速、准确的得到DNA样品的精确含量。本发明还构建制备了质粒分子和基因组DNA标准品，采用数码PCR法对两种DNA标准品进行准确定量，利用该标准质粒或基因组DNA进行梯度稀释，得到SYBR?Green?I荧光染料法定量DNA的标准曲线，根据标准曲线得到待测DNA样品的准确含量。
【专利说明】SYBR Green荧光染料DNA定量检测方法和试剂盒
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种检测基因组DNA和质粒DNA的方法和检测试剂盒，特别是涉及一种SYBR Green I荧光染料DNA定量检测试剂盒。
【背景技术】:
[0002]在分子生物学领域进行DNA分析时常常需要对基因组DNA和质粒DNA进行准确定量。
[0003]采用Pic0Green荧光染料法对核酸进行定量，因其方法的灵敏度高、线性范围广，因此应用非常广。然而，PicoGreen荧光染料价格昂贵，且在对DNA进行定量时的局限性表现在方法的准确度高低取决于试剂盒中DNA标准品含量的准确度，而目前市售的试剂盒中DNA标准品的含量值均为厂家提供的一个参考值，这个值一般是通过紫外吸收(0D260)确定的，没有相关的不确定度信息和溯源性。其次，由于PicoGreen对不同分子大小的DNA结合效率会有差异，如果依据定量的DNA标准和所测定的DNA样本分子大小差异很大时，会导致对样本定量结果的偏差很大，而目前商业化的试剂盒中均只有一个分子大小的LambdaDNA标准。有报道称:以Lambda为标准，如果对分子量<23kb的DNA进行定量，测定结果会比真实结果偏低。因此，如果对质粒DNA采用PicoGreen法定量，由于质粒DNA标准品的缺乏，现有的商业化的试剂盒还无法满足要求。
[0004]SYBR Green I荧光染料的与PicoGreen相比价格低。经我们的研究发现SYBRGreen I对双链DNA结合具有很好的效率，而结合单链DNA效率很低。目前，SYBR Green I荧光染料法普遍用于定量PCR扩增过程中与DNA结合或者通过染胶进行定量，还没有SYBRGreen I直接与质粒DNA或基因组DNA结合进行定量的方法与试剂盒。研制SYBRGreen I对DNA定量的试剂盒，需要具有准确量值的DNA标准物质，目前并没有含有准确量值的DNA标准可用作SYBR Green I法定量质粒的标准。由于该量值直接关系到试剂盒定量方法的准确度高低。基于单分子扩增的数字PCR方法可对DNA进行绝对定量，从而为SYBR GreenI荧光染料法提供DNA标准。

【发明内容】
:
[0005]本发明的目的是提供一种DNA荧光染料定量检测方法和检测试剂盒，该方法灵敏度高，线性范围广，准确度高，精密度好。
[0006]为达到上述发明目的，本发明人进行了如下研究工作:
[0007]1、SYBR Green I荧光染料对不同分子大小的DNA定量的线性关系
[0008]选择了分子大小分别为5k，9k，48k的质粒/基因组分子作为研究对象，将DNA进行梯度稀释，稀释后的DNA与PicoGreen荧光染料结合后，测定荧光信号；
[0009]结果发现:荧光信号不仅与DNA浓度成正比(相关系数>0.99)，还与DNA分子大小相关，即分子量越大，线性相关曲线的斜率越大。
[0010]2、SYBR Green I荧光染料法对质粒DNA定量的线性范围[0011]将质粒DNA稀释至0.01ng/mL~10000ng/mL，与荧光染料结合后，测定荧光信号值；
[0012]结果发现DNA浓度在0.05ng/mL~1000ng/mL之间时，荧光强度与DNA浓度成正t匕。因此，SYBR Green I对质粒DNA定量的线性范围为0.25ng/mL~1000ng/mL。
[0013]3、SYBR Green I荧光染料法对质粒DNA的检测灵敏度
[0014]由于最低检测到的荧光信号对应的DNA浓度为0.01ng/mL，加样量100 μ L ;
[0015]因此计算出该方法的灵敏度为lpg。
[0016]4、SYBR Green I荧光染料法对质粒DNA的定量限
[0017]根据最低定量的线性范围，定量限为5pg。
[0018]5、SYBR Green I荧光染料法对Lambda基因组DNA定量的线性范围
[0019]将基因组DNA稀释至0.001ng/mL~10000ng/mL，与荧光染料结合后，测定荧光信号值，结果发现DNA浓度在0.01ng/mL~1000ng/mL之间时，荧光强度与DNA浓度成正比；
[0020]因此，SYBRGreen I 对 Lambda DNA 定量的线性范围为 0.01ng/mL ~1000ng/mL。
[0021]6、SYBR Green I荧光染料法对Lambda基因组DNA的检测灵敏度
[0022]由于最低检测到的荧光信号对应的DNA浓度为0.005ng/mL，加样量100 μ L，因此计算出该方法的灵敏度为0.5pg。
`[0023]7、SYBR Green I荧光染料法对Lambda基因组DNA的定量限
[0024]根据最低定量的线性范围，定量限为lpg。
[0025]根据以上研究，本发明首次建立了质粒和基因组SYBR Green I DNA荧光染料法定量检测方法，可对质粒或基因组DNA进行准确定量。本方法的步骤为:
[0026]I)将待测样品稀释至DNA浓度为0.01~Ing/ μ L，与荧光染料混匀，用酶标仪读取所得到的荧光信号强度值；
[0027]2)将标准品进行梯度稀释，得到4~8个DNA浓度的稀释液；取每一种浓度的标准品稀释液分别与荧光染料混匀后，用酶标仪分别读取每一种浓度所得到的荧光信号强度值；
[0028]3)根据步骤2)得到的不同浓度DNA标准品的荧光强度值绘制标准曲线，根据此标准曲线计算待测样品DNA的浓度；
[0029]其特征为:所用的标准品为用数字PCR法准确定量的环状质粒分子DNA或基因组DNA ;荧光染料是SYBR Green I。
[0030]本方法中，用酶标仪读取荧光信号前，设置所述酶标仪激发波长480nm，吸收波长为 520nm。
[0031]所述稀释用以下成分的工作液进行:10mM Tris-HCl，含ImM EDTA, pH=8.0 ；
[0032]进行步骤I)之前，采用紫外法测定待测DNA样品大致的浓度范围。
[0033]步骤I)和步骤2)中，所用的荧光染料根据需要进行稀释，比如，在实施例中，规格10000X的SYBR Green I。使用前按照1:10000进行稀释。
[0034]测定荧光信号强度时，稀释的待测样品与染料等体积混匀；每一种浓度的标准品稀释液分别与染料等体积混匀。
[0035]本方法中，标准品稀释液的优选浓度分别为lng/μ L、0.5ng/y L、0.25ng/y L、
0.lng/ μ L 和 0.01ng/ μ L。[0036]所述数字PCR法的具体操作如下:
[0037]I)用紫外法测定待测物DNA的浓度，然后将此浓度根据分子量和阿伏加德罗常数从ng/ μ I换算成copy/ μ I,然后将DNA通过天平称量用ΤΕ0.1稀释至1200copies/ μ I备用；
[0038]2)配置dPCR反应体系:取DNA模板2 μ 1，与8 μ I的PCR master mix混匀；
[0039]3)将配置好的PCR体系加入芯片中对应的样品孔，转入芯片中的每个反应室；然后进行PCR扩增；
[0040]4)数据处理:得到的数据结果进行分析处理，根据得到的阳性分子个数，利用泊松分布计算DNA浓度。
[0041]根据上述方法，本发明提供了一种SYBR Green I荧光染料DNA定量检测试剂盒，包括:质粒DNA标准品，基因组DNA标准品，SYBR Green I荧光染料和工作液。所述工作液的成分是:10mM Tris-HCl，含 ImM EDTA，pH=8.0。
[0042]本方法的创新点和优点是:
[0043]1、首次采用标准质粒作为荧光染料法中的DNA标准对质粒样品进行定量；采用标准基因组DNA作为荧光染料法中的DNA标准对基因组DNA样品进行定量；
[0044]2、弥补了现有商业化荧光染料试剂盒中不能对质粒DNA进行定量的缺点；
[0045]3、方法灵敏度高:该方法可检测低至0.5pg的基因组DNA，低至Ipg的质粒DNA ；
[0046]4、方法线性范围广:可检测0.01ng/mL~1000ng/mL的DNA,跨越5个数量级；
[0047]5、标准品的量值:首次采用高准确度的数字PCR法对标准质粒和基因组DNA进行定量，得到的量值不确定度低，准确度高。
【专利附图】

【附图说明】:
[0048]图1为荧光染料法对不同分子大小的DNA定量的线性相关性；
[0049]图2为荧光染料法对质粒DNA定量的线性范围研究；
[0050]图3为荧光染料法对质粒DNA定量的线性范围；
[0051]图4为荧光染料法对基因组DNA定量的线性范围研究；
[0052]图5为荧光染料法对基因组DNA定量的线性范围；
[0053]图6为数字PCR方法对标准质粒和基因组DNA定值的热图
[0054]图7数字PCR方法对待侧质粒的定量的热图；
[0055]图8为两种方法(SYBR Green荧光染料法与数字PCR法)测定结果比较。
【具体实施方式】
[0056]以下所用的实验材料来源如下:
[0057]荧光染料SYBR Green I，I X 10000，购自北京华迈科生物技术公司；
[0058]PCR master mix, 2 X,购自 Life technology 公司。
[0059]实施例1对不同分子大小DNA采用SYBR Green I荧光染料法进行定量
[0060]一、材料与方法:
[0061]1.不同分子大小的 DNA:lambda基因组DNA,大小48kb,购置Takara公司；9kbDNA:采用EcoRI限制性内切酶将Lambda基因组DNA进行酶切，通过琼脂糖凝聚电泳回收纯化得到 ;质粒DNA:5kb ；PCR产物:200bp。
[0062]2.SYBR Green I荧光染料用IxTE按照1:10000进行稀释。
[0063]3.将I中提到的四种不同分子大小的DNA配置成10000ng/mL的保存浓度，然后用IxTE 稀释至 2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、20ng/mL、2ng/mL、0.5ng/mL。
[0064]4.取稀释好的DNA溶液0.1mL与0.1mL的稀释好的SYBR Green I染料混合，转移至96孔酶标板。
[0065]5.将酶标板至于酶标仪上,选择激发波长480nm,发射波长520nm进行突光信号的米集。
[0066]6.标准曲线的绘制:以DNA浓度为横坐标，以荧光信号为纵坐标进行曲线绘制，各分子量大小的DNA得到的标准曲线见图1。
[0067]二、实验结果
[0068]1、SYBR Green I荧光染料对不同分子大小的DNA定量的线性相关性:
[0069]表1
[0070]
【权利要求】
1.一种SYBR Green荧光染料DNA定量检测方法，步骤为:1)将待测样品稀释至DNA浓度为0.01~Ing/yL，与荧光染料混匀，用酶标仪读取所得到的荧光信号强度值；2)将标准品进行梯度稀释，得到4~8个DNA浓度的稀释液；取每一种浓度的标准品稀释液分别与荧光染料混匀后，用酶标仪分别读取每一种浓度所得到的荧光信号强度值；3)根据步骤2)得到的不同浓度DNA标准品的荧光强度值绘制标准曲线，根据此标准曲线计算待测样品DNA的浓度；其特征为:所用的标准品为用数字PCR法准确定量的环状质粒分子DNA或基因组DNA ；荧光染料是SYBR Green I。
2.权利要求1所述的方法，用酶标仪读取荧光信号前，设置所述酶标仪激发波长480nm,吸收波长为520nm。
3.权利要求1所述的方法,所述稀释用以下成分的工作液进行:IOmMTris-HCl，含ImMEDTA，pH=8.0。
4.权利要求1所述的方法，进行步骤I)之前，采用紫外法测定待测DNA样品大致的浓度范围。
5.权利要求1所述的方法，步骤I)和步骤2)中，所用的荧光染料的工作浓度为0.1uM,测定荧光信号强度时，稀释的待测样品与染料等体积混匀；每一种浓度的标准品稀释液分别与染料等体积混匀。
6.权利要求1所述的方法，得到的标准品稀释液浓度分别为lng/yL、0.5ng/yL、0.25ng/ μ L、0.lng/ μ L 和 0.01ng/ μ L。
7.权利要求1所述的方法，所述数字PCR法的具体操作如下:O用紫外法测定待测物DNA的浓度，然后将此浓度根据分子量和阿伏加德罗常数从ng/ μ I换算成copy/ μ I,然后将DNA通过天平称量用ΤΕ0.1稀释至1200copies/ μ I备用； 2)配置dPCR反应体系:取DNA模板2μ 1，与8 μ I的PCR master mix混匀；3)将配置好的PCR体系加入芯片中对应的样品孔，转入芯片中的每个反应室；然后进行PCR扩增；4)数据处理:得到的数据结果进行分析处理，根据得到的阳性分子个数，利用泊松分布计算DNA浓度。
8.—种DNA定量检测试剂盒，试剂盒中包括荧光染料、工作液和标准品，其特征为:所述荧光染料是SYBR Green I ;所述标准品为浓度有准确量值环状质粒分子DNA和/或基因组 DNA。
9.权利要求8所述的试剂盒，量值确定的方法为数字PCR法，具体操作如权利要求7。`
10.权利要求8所述的试剂盒，所述工作液的成分为IOmMTris-HCl，含ImM EDTA,pH=8.00
【文档编号】C12Q1/68GK103865984SQ201210540389
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月13日 优先权日:2012年12月13日
【发明者】王泽广, 吴立娟, 董杰 申请人:王泽广