专利名称：棉花植物事件a2-6以及用于其检测的引物和方法
棉花植物事件A2-6以及用于其检测的引物和方法技术领域
本发明属于植物分子生物学领域，尤其是农业生物技术研究中的转基因农作物育种领域，特别是涉及具有棉铃虫抗性的棉花转化事件A2-6，以及检测该转化事件的特有方法。
背景技术：
在世界范围内，虫害给农业生产带来了较大的损失。传统采用化学杀虫剂的防治技术，在传统农业实践中发挥了巨大的作用。但是，这种虫害防治技术存在很大的弊端，一方面，大量有毒化学农药的使用，不仅污染环境，而且易残留，严重威胁人们健康；另一方面，化学农药长期大量使用还能够造成害虫的抗药性，导致虫害的爆发。例如，上世纪90年代初，由于棉铃虫抗药性的发展，导致我国棉铃虫的大爆发，使我国各大棉区大幅度减产甚至绝产。
目前，转基因技术为解决虫害给棉花生产造成严重危害这一世界性难题提供了可行方案。人们也通过选择种植转基因抗虫作物防治某类虫害。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thurigiensis，下文简称为Bt)是一种能形成芽孢的革兰氏阳性芽孢杆菌，已知其可产生对多种昆虫，如鳞翅目(Lepidopterans)、鞘翅目(Coleopterans)和双翅目(Dipterans)等作 物害虫有毒性的伴孢结晶蛋白质(Aronson,Microbiol. Rev. 50 :1-14,1968) 由于Bt毒素杀虫的专一性和高度选择性，所以对植物和包括人在内的动物没有毒害，而且是环境可以接受的。因此，目前商业化应用的抗虫转基因农作物所使用的抗虫基因主要是Bt杀虫蛋白基因。
1995年，郭三堆等人采用植物优化密码子，人工合成了 GFM CryIA杀虫基因 (ZL95119563. 8)，随后导入到数个中国主产棉区的主栽品种中，获得抗虫棉，并在1997年进行了产业化应用。孟山都公司获得的Mon531抗虫棉花转化事件在1996年进行了商业化；随后孟山都公司又获得的Monl5985双Bt抗虫棉花转化事件(中国专利申请号 02802047. 2，审中)，已经在全球进行了商业化。通过转化事件专利对转基因农作物进行知识产权保护是目前国际上的一个新趋势，因为一个进入商业化的转化事件是发明人通过筛选鉴定而获得的生物类的独特创造，外源基因与受体作物基因组特定位置的整合，不仅使转化事件具备独特的分子特征，而且具有独特的外源基因表达规律，区别于研究过程中获得的其它转化事件，具有相比较更适合商业化应用的特征特性，因此具有明显的新颖性、实用性和创造性。目前，国际上已有商业化的转化事件获得了知识产权保护，均为跨国公司所拥有，部分在中国也申请了专利。
在我国早期的抗虫棉研究中，由于转化手段的限制，所获得的抗虫棉存在整合拷贝数和整合位置不确定的情况，在育种中转基因性状不容易把握，不同育种家选育的抗虫棉品种抗虫性差异较大。同时，由于不能获得转化事件基因整合侧翼序列的分子特征，不便于进一步新的转基因性状聚合，使其进一步应用出现局限性。因此，本发明创造出GFM CrylA杀虫基因新型棉花转化事件，不仅抗虫性强，遗传稳定，单拷贝整合，而且整合侧翼序列分子特征清楚，该转基因材料不但本身在抗虫棉育种中具有重要应用价值，而且由于具有独特的检测方法，可方便地通过杂交聚合的方式聚合不同的商业化转化事件。发明内容
本发明人通过转基因方法获得了棉花转化事件A2-6。该转化事件具有稳定的高抗棉铃虫性状。其代表性种子已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5965。
本发明第一方面提供棉花转化事件A2-6，其特征DNA序列如SEQ ID No 22所示， 其由第576-6164bp的T-DNA插入序列、第l_575bp上游侧翼棉花基因组序列和第6165 6586bp的下游侧翼棉花基因组序列构成。
本发明第二方面提供本发明第一方面所述的棉花转化事件·的特征DNA序列的片段，所述片段至少包含部分所述T-DNA插入序列和部分所述侧翼棉花基因组序列。
本发明第三方面提供一种重组载体，其含有本发明第一方面所述的T-DNA插入序列。在一个实施方案中，所述载体为附图1中的T66-35S-0K-Bt-PS-Tnos-2300载体。
本发明第四方面提供一种重组细胞，其含有本发明第三方面所述的重组载体。在一个实施方案中，所述重组细胞为含有本发明第三方面所述的载体的重组农杆菌细胞。
本发明第五方面提供用于检测本发明第一方面所述的棉花转化事件的引物对，其由特异性识别本发明第一方面所述的任一侧的侧翼序列的第一引物和特异性识别本发明第一方面所述的T-DNA插入序列的第二引物组成。在一些实施方案中，所述第一引物的序列为 SEQ ID N0:18 或 SEQ ID NO :20，所述第二引物的序列为 SEQ ID N0:11 或 SEQ ID NO: 14。在另一些实施方案中，其中所述第一引物的序列为SEQ ID N0:19或SEQ ID N0:21，所述第二引物的序列为SEQ ID N0:12或SEQ ID NO 150
本发明第六方面提供一种鉴定棉花生物样品中A2-6转化事件的方法，其包括
(a)从待鉴定的棉花生物样品提取DNA样品；
(b)以提取的DNA样品为模板，使用本发明第五方面所述的引物对进行PCR扩增；
(c)检测PCR扩增产物，如果扩增产物长度与SEQ ID NO 22上所述PCR引物对的序列之间的理论长度一致，则表明所述棉花生物样品中A2-6转化事件的存在。
本发明第七方面提供了本发明第一方面所述的棉花转化事件向不同棉花育种材料中转移的方法，包括利用含有本发明第一方面所述的转化事件材料的棉花材料，与其它棉花育种材料进行杂交后，进一步进行回交，获得含有本发明第一方面所述的转化事件的新材料；在杂交及回交过程中，利用本发明第六方面的方法在后代群体中进行筛选鉴定，确认本发明第一方面所述的转化事件的存在。
本发明第八方面提供本发明第一方面所述的转化事件、本发明第二方面所述的片段、本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的重组细胞、本发明第六和第七方面所述方法用于提高棉花抗棉铃虫性状、进行棉花育种或用作分子标记的用途。
图1示出了植物表达载体T66-35S-0K-Bt-PS-Tnos-2300的构建流程。
图2示出了 Southern印迹分析技术与互补于Bt基因编码序列的地高辛标记的DNA进行杂交的结果。
图3示出了利用Southern杂交技术对转化事件A2-6拷贝数进行检测的实验结果。 M, marker, λDNA/HindIII+EcoRI ;1，CK+, T66-35S-0K-Bt-PS-Tnos-2300/EcoRI+HindI11 ； 2，CK-, J14/EcoRI ;3，A2_6/EcoRI ;4，A2_6/HindIII ;5，A2-6/EcoRI+HindIII。
图4是右边界(RB)旁侧序列示意图。
图5是左边界(LB)旁侧序列示意图。
图6示出了以受体材料冀棉14DNA为模板，使用序列分别为SEQ ID No 18和SEQ ID No 19的引物对，扩增得到大小为800bp左右的扩增产物，测序后与A2-6的旁侧序列比对的结果。
图7是A2-6事件的插入序列及鉴定引物的示意图。
图8 示出了利用引物对 GSPl-Hind III/A2-6-1 以及 GSPl-Hind III/A2-6-2 分别扩增A26-5事件、A2-6事件、冀棉14_1、冀棉14_2的棉花样品的结果。M, marker, λ DNA/ Hindlll+EcoRI ;1_4 =GSPl-Hind III/A2-6-1 扩增 A26-5，A2-6，冀棉 14-1，冀棉 14-2，阳性扩增条带 3. 5Kb 左右；5-8 =GSPl-Hind III/A2-6-2 扩增 A26-5，A2-6，冀棉 14-1，冀棉 14-2, 阳性扩增条带3. 5Kb左右。
具体实施方式
在本发明中，“转化事件”是指将外源目的基因通过农杆菌介导遗传转化方法(本领域技术人员公知)，转化到棉花细胞中，并进一步获得的转基因棉花植株中外源DNA序列在棉花基因组中的特定位置插入并整合的事件；“转化事件”并不是一种植物细胞或植株， 植物细胞或植株是转化事件存在的载体；转化事件的核心特征是外源基因在植物基因组中特定位点的插入所形成的外源插入序列和特定棉花基因组序列连接的一段 特征DNA序列。
实施例
下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1.植物表达载体构建
从载体pCambia2300扩增含双增强子的35S启动子，两端分别带Xba I和BamH I， 引物序列如SEQ ID No :1及SEQ ID No :2所示，PCR产物经酶切后克隆到pMD_18T中，得到 PMD-35S重组载体。为了增加表达框的重组率，克隆来自棉花基因具有大量拓扑异构酶II 识别位点的SSR序列TMB0066，构建以TMB0066为MAR序列的植物表达载体，增加插入序列的整合效率。TMB0066序列如SEQ ID No :3所示。其两端分别引入Hind III和Xba I位点，克隆到PMD-35S，得到重组载体pMD-TMB0066-35S。
将含OK (Omega&Kozak)-Bt-PS (Processing&Splicing sequence)片段(三者序列已在专利号为95119563. 8的中国专利中公开，该专利公开以引用的方式全文纳入本文)组合的质粒，利用BamH I和Sac I酶切OK-Bt-PS片段，将其克隆到pMD_18T中，获得重组质粒 pMD-0K-Bt-PS。将终止子Tnos序列通过Sac I+EcoR I克隆到PS下游。利用Hind III+BamH I 将 TMB0066-35S 克隆到 35S 上游，得到重组质粒 pMD-TMB0066-35S-0K-Bt-PS_Tnos。利用 Hind III 和 EcoR I，将 TMB0066-35S-0K-Bt-PS_Tnos 克隆到载体 pCambia2300 中，获得重组植物表达载体T66-35S-0K-Bt-PS-Tnos-2300，构建流程见图1。
实施例2.陆地棉(Gossypium hirsutum)的遗传转化
利用农杆菌介导的遗传转化方法，用T66-35S-0K-Bt-PS-Tnos_2300载体转化冀棉14(国家棉花中期库，获取单位中国棉花研究所，统一编号ZM-30270)下胚轴。挑取含有T66-35S-0K-Bt-PS-Tnos-2300载体的农杆菌LBA4404，接种至含卡那霉素(kanamycin，km) 50mg/L、利福平(rifampicin，rif) 50mg/L 及链霉素(streptomycin, S/Sm) 50mg/L的LB液体培养基中，28°C振荡暗培养过夜到细菌生长对数期。以菌液培养基1: 50 1: 100的比例用LB或YEB液体培养基稀释菌液，再振荡培养4 6h，将菌液稀释至0D600值O. 8 1.0。转基因受体材料为冀棉14，取生长3 4天的无菌苗下胚轴，切成O. 6 O. 8cm的段，浸染10 15min，取出下胚轴段，置共培养培养基(MSB+KT O. lmg/L+2,4-DO. lmg/L)，22°C 25°C共培养 2 天。转至愈伤诱导培养基(MSB+KT O. lmg/L+2,4-DO.1mg/L+Kan50mg/L)20 30天继代一次，90天后转接至愈伤增殖培养基(MSB+KT O. lmg/L+2,4-DO. 05mg/L+Kan50mg/L), 20 30天继代一次，待长出胚性愈伤后，将胚性愈伤继代至萌发培养基(MSB+KT O.1mg/L+Kan50mg/L)，40天左右挑取萌发的绿芽至生根培养基(SH+Kan50mg/L) 进行筛选，进而获得小苗和可嫁接抗性植株268株。抗性植株经过PCR鉴定后嫁接并移栽，获得A系列棉花共210株。实施例3. TO代转基因材料的筛选鉴定分别对苗期、花期、蕾期及铃期进行抗虫蛋白的Elisa检测及抗虫试验。根据苗期Elisa检测，抗虫蛋白高表达的转基因棉花有125株。经过抗虫试验，对棉铃虫有抗性的有94株，其中对棉铃虫抗性较强的有25株。
虫试次数抗虫性
权利要求
1.棉花转化事件A2-6，其特征DNA序列如SEQID No :22所示，其由第576_6164bp的 T-DNA插入序列、第l-575bp的上游侧翼棉花基因组序列和第6165 6586bp的下游侧翼棉花基因组序列构成。
2.权利要求1所述的棉花转化事件的特征DNA序列的片段，所述DNA片段至少包含部分所述T-DNA插入序列和部分所述侧翼棉花基因组序列。
3.—种重组载体，其含有权利要求1所述的T-DNA插入序列；例如，所述载体为附图1 中的 T66-0K-Bt-PS-Tnos-2300 载体。
4.一种重组细胞,含有权利要求3所述的载体；例如,所述重组细胞为含有权利要求3 所述的载体的重组农杆菌细胞。
5.用于检测权利要求1所述的棉花转化事件的引物对，其由特异性识别权利要求1所述的任一侧的侧翼序列的第一引物和特异性识别权利要求1所述的T-DNA插入序列的第二引物组成。
6.权利要求5所述的引物对，其中所述第一引物的序列为SEQID N0:18或SEQ ID NO: 20，所述第二引物的序列为SEQ ID N0:11或SEQ ID NO 140
7.权利要求5所述的引物对，其中所述第一引物的序列为SEQID N0:19或SEQ ID NO: 21，所述第二引物的序列为SEQ ID N0:12或SEQ ID NO 150
8.一种鉴定棉花生物样品中A2-6转化事件的方法，其包括(a)从待鉴定的棉花生物样品提取DNA样品；(b)以提取的DNA样品为模板，使用权利要求5-7任一项所述的引物对进行PCR扩增；(c)检测PCR扩增产物，如果扩增产物长度与SEQID NO 22上所述PCR引物对的序列之间的理论长度一致，则表明所述棉花生物样品中A2-6转化事件的存在。
9.一种获得转基因抗虫棉花材料的的方法，包括利用含有权利要求1转化事件的棉花材料，与其它棉花育种材料进行杂交后，进一步进行回交，获得含有权利要求1所述的转化事件的新材料；在杂交及回交过程中，利用权利要求8所述的方法在后代群体中进行筛选鉴定，确认权利要求1所述的转化事件的存在。
10.权利要求1所述的转化事件、权利要求2所述的片段、权利要求3所述的载体、权利要求4所述的重组细胞、权利要求8或权利要求9所述的方法用于提高棉花抗棉铃虫性状、 进行棉花育种或用作分子标记的用途。
全文摘要
本发明提供了抗棉铃虫的棉花转化事件及其特征序列以及用于其检测的引物和方法。携带A2-6转化事件的棉花植物在第一组染色体上包含所述事件即外源插入DNA序列和棉花基因组DNA序列的接合。利用外源插入DNA序列及其侧翼棉花基因组上接合区的DNA序列，可设计检测引物，用于针对A2-6事件的特异性检测。针对A2-6事件的检测方法可为利用该植物事件进行育种的应用提供便捷的追踪该特定基因插入事件的手段，该特定基因插入事件可作为分子标记使用以提高育种工作效率。
文档编号C12N1/21GK103003429SQ201280001638
公开日2013年3月27日 申请日期2012年5月16日 优先权日2012年5月16日
发明者崔洪志, 何云蔚, 王君丹, 陈文华, 王建胜, 宋辉平 申请人:创世纪转基因技术有限公司