专利名称：生物样本的预处理方法、rna的检测方法及预处理试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含RNA的生物样本的预处理方法、RNA的检测方法及预处理试剂盒。
背景技术：
作为检测血液等生物样本中的病毒的方法，有将病毒的基因进行扩增从而检测的方法。但是，生物样本中大多含有基因扩增的抑制物质，因此在基因扩增之前，实施对生物样本进行预处理而将抑制物质除去或钝化的操作。预处理方法例如有:通过表面活性剂、促溶剂、加热等对生物样本进行处理后，进一步通过固相载体或离子交换树脂进行纯化的方法(专利文献I 3)。然而，这些方法需要特殊的装置，并且需要多个操作步骤，因此繁杂。特别是在以RNA为基因的病毒的检测中，为了通过反转录酶使RNA基因成为DNA后进行扩增操作，需要将RNA分解酶(RNase)及反转录酶钝化物质也除去或钝化，因此在现有的预处理方法中，进一步需要繁杂的操作。例如作为包含RNA病毒的生物样本的预处理方法，已知添加多胺或硫酸化多糖(专利文献4)。然而，添加多胺或硫酸化多糖会使预处理更加繁杂化，并且多胺及硫酸化多糖可能和RNA基因及通过反转录酶而生成的DNA结合，反而也可能抑制基因扩增。另外，流感病毒为RNA病毒的一种，但是流感病毒是新型还是季节型的判断在临床上极为重要。另外，通常使用鼻粘膜作为用以检测流感病毒的生物样本。并且，流感病毒的检测需要在临床现场进行。因此，期望建立使用人类的鼻粘膜的流感病毒的迅速且简便的检测方法，这类需求并不限于流感病毒，也要求针对通常的RNA病毒的检测，而且不仅要求针对RNA病毒的检测，也要求针对基因以外的RNA本身的检测。现有技术文献专利文献专利文献1:特开2009-247250号公报专利文献2:国际公开W02007/094506号公开文本专利文献3:特开2006-87394号公报专利文献4:特开2001-29078号公报
发明内容
发明要解决的问题本发明的目的是提供能够由包含RNA的生物样本迅速且简便地检测RNA的生物样本的预处理方法、使用该生物样本的预处理方法的RNA的检测方法、及所述生物样本的预处理方法中所用的预处理试剂盒。解决问题的手段本发明的预处理方法是包含RNA的生物样本的预处理方法，其特征在于:所述生物样本包含乳铁蛋白(Lactferrin),并对所述生物样本实施乳铁蛋白的RNA分解活性抑制处理。
本发明的检测方法是生物样本中的RNA的检测方法，其特征在于所述生物样本包含乳铁蛋白(Lactferrin)，并且包括:对所述生物样本进行预处理的预处理步骤，及通过扩增而检测经所述预处理的生物样本中的所述RNA的RNA扩增检测步骤，所述预处理步骤通过所述本发明的生物样本的预处理方法而实施。本发明的预处理试剂盒是包含RNA的生物样本的预处理试剂盒，其特征在于:所述生物样本包含乳铁蛋白(Lactferrin),所述预处理试剂盒包含乳铁蛋白的RNA分解活性抑制剂。发明效果本发明者等人首先发现:抑制人类鼻粘膜样本中所含的以RNA为模板的反转录/DNA扩增反应的要素是乳铁蛋白的RNA分解活性。并且发现，通过仅对人类鼻粘膜样本实施乳铁蛋白的RNA分解活性抑制处理(例如乳铁蛋白的RNA分解活性抑制剂添加处理)，可以抑制RNA分解。进一步发现，作为人类鼻粘膜样本中所存在的其他反转录/DNA扩增反应抑制要素之一，溶菌酶C抑制通过反转录酶从RNA向DNA的反转录反应。并且发现，通过添加溶菌酶C的反转录酶抑制活性抑制剂，可以抑制反转录酶的抑制活性。并且通过这些反转录/DNA扩增反应抑制要素的抑制处理(添加包含抑制剂的试剂)而对人类鼻粘膜样本进行处理，其结果是，不经过特别的纯化步骤，便可以直接进行RNA基因的扩增，从而完成了本发明。根据本发明，可以迅速且简便地从包含RNA的生物样本检测RNA。
图1是表示本发明的检测方法的一个实例的图。图2是表示乳铁蛋白及溶菌酶C存在于人类鼻粘膜中的电泳照片。 图3是表示铁离子及碳酸根离子对乳铁蛋白的RNA分解活性的抑制效果的电泳照片。图4是表示铁离子及碳酸根离子的热处理效果的一个实例的电泳照片。图5是表示通过铁离子及碳酸根离子对溶菌酶C的反转录抑制活性进行抑制的一个实例的图。图6是表示铁离子及碳酸根离子和SDS的协同效应的一个实例的电泳照片。图7a是表示利用折回引物(turn-back primer)及折叠引物(foldingprimer)的核酸扩增反应的机理的一个实例的图。图7b是表示利用折回引物及折叠引物的核酸扩增反应的机理的一个实例的图。图8是表示因添加氧化铝而对SDS除去的影响的一个实例的图。图9是表示因铁离子浓度的增加及超滤而对SDS除去的影响的一个实例的图。图10是表示Triton X-100对核酸扩增反应中的SDS的核酸扩增抑制的缓和效果的一个实例的图。图11是表示可以通过RT-SmartAmp法检测人类鼻粘膜所含的RNA病毒的图。
具体实施例方式
本发明的预处理方法中， 优选通过在所述生物样本中添加乳铁蛋白的RNA分解活性抑制剂，来对所述生物样本实施乳铁蛋白的RNA分解活性抑制处理。
本发明的预处理方法中，优选所述生物样本包括:动物的鼻粘膜、鼻窦粘膜、气管粘膜、唾液、来自口腔或咽喉的分泌液、泪、乳汁、胆汁、血液(白细胞)、子宫颈管的粘膜、内外生殖器的粘膜、羊水、或尿。本发明的预处理方法中，优选所述动物为人类。本发明的预处理方法中，优选所述生物样本包括人类鼻粘膜。本发明的预处理方法中，优选对所述生物样本进一步实施溶菌酶C (LysozymeC)的反转录抑制活性抑制处理。在这种情况下，优选通过在所述生物样本中添加溶菌酶C (Lysozyme C)的反转录抑制活性抑制剂,而对所述生物样本实施溶菌酶C (Lysozyme C)的反转录抑制活性抑制处理。本发明的预处理方法中，优选所述RNA分解活性抑制剂及所述反转录抑制活性抑制剂的至少一种包含铁离子剂及碳酸根离子剂。另外，本发明中，“铁离子剂”是指可以对所述生物样本供给铁离子的物质。同样，本发明中，“碳酸根离子剂”是指可以对所述生物样本供给碳酸根离子的物质。
本发明的预处理方法中，优选对添加了所述铁离子剂及所述碳酸根离子剂的所述生物样本进行加热处理。这是因为通过该加热处理，可以有效地抑制RNA分解活性及反转录抑制活性。本发明的预处理方法中，可以在所述生物样本中进一步添加表面活性剂，例如优选添加极性表面活性剂。为了使基因从病毒粒子中露出，必须使用非离子性表面活性剂除去病毒的被膜，但非离子性表面活性剂有可能抑制本发明的所述铁离子剂及所述碳酸根离子剂的功能。但是如果是极性表面活性剂，则不会抑制本发明的所述铁离子剂及所述碳酸根离子剂的功能，而可以除去病毒的被膜。所述极性表面活性剂优选为SDS。另外，SDS可能会抑制基因扩增时的DNA聚合酶，因此优选在基因扩增之前，将钾盐或氧化铝添加至生物样本使SDS凝聚，并通过离心分离或过滤将SDS除去。本发明的检测方法中，优选通过使用反转录酶的基因扩增方法来实施所述RNA的扩增。所述基因扩增方法优选为使用链置换DNA聚合酶的等温扩增方法。本发明的检测方法中，使用表面活性剂从病毒粒子使RNA基因流出例如可以使用以下2个步骤中的任一个步骤。步骤B是在基因扩增步骤中添加非极性表面活性剂，通过非极性表面活性剂和基因扩增反应时的加热的效果，使RNA基因从病毒粒子中溶出的方法。
步骤A:通过表面活性剂破坏预处理过程中的样品中所含的病毒粒子，使RNA从病毒中溶出，同时通过抑制处理来抑制乳铁蛋白及溶菌酶C的RNA分解活性及所述反转录抑制活性，而将该预处理液供给至核酸扩增的步骤。步骤B:不破坏样品中的病毒粒子(保持原样)，通过抑制处理来抑制乳铁蛋白及溶菌酶C的RNA分解活性及所述反转录抑制活性后，供给至包含非极性表面活性剂的核酸扩增反应，通过表面活性剂和热变性的效果，而使病毒粒子中的RNA基因组溶出，而实施来自病毒基因组的核酸扩增的步骤。所述步骤A中，所述表面活性剂优选使用极性表面活性剂。所述极性表面活性剂优选为SDS。所述步骤B中，所述表面活性剂优选使用不会抑制核酸扩增反应的非极性表面活性剂。本发明的预处理试剂盒优选进一步包含溶菌酶C (Lysozyme C)的反转录抑制活性抑制剂。本发明的预处理试剂盒中，优选所述RNA分解活性抑制剂及所述反转录抑制活性抑制剂的至少一种包含铁离子剂及碳酸根离子剂。优选以相互不接触的状态包含所述铁离子剂及所述碳酸根离子剂。接着，对本发明进行详细地说明。本发明中，生物样本所含的RNA并无特别限制，包括从生物中取得的全部的RNA、宿主RNA、细菌或真菌的RNA。可以是基因RNA，也可以是基因以外的RNA。在基因RNA的情况下，生物样本所含的基因RNA优选为RNA病毒，特别优选流感病毒。本发明中，所述生物样本是包含乳铁蛋白的样本。所述生物样本中，优选包含人类乳铁蛋白的样本。已知乳铁蛋白包含在生物的几乎所有的外分泌液中。因此，所述生物样本例如可以列举:包括动物的来自鼻腔、鼻窦、喉头、气管、支气管、或肺等的上呼吸道粘膜的分泌液、来自口腔或咽喉的分泌液(例如唾液等)、来自消化道粘膜的分泌液、来自内生殖器、外生殖器(例如子宫颈管等)的粘膜的分泌液、来自肾尿路系统的粘膜的分泌液、来自腹腔内粘膜的分泌液、来自胸腔内粘膜的分泌液、来自心包内粘膜的分泌液、来自皮肤的分泌液、泪腺分泌液、乳汁、胆汁、血液(白细胞)、羊水、尿、粪便等的生物样本。这些中，例如优选来自鼻腔、鼻窦等的粘膜的分泌液、唾液、泪、乳汁、胆汁、血液(白细胞)、来自子宫颈管的分泌液、羊水、尿等样本，已知这些样本实际上包含乳铁蛋白。其中特别优选人类鼻粘膜。另外，所述动物优选人类，但也可以是人类以外的动物。人类以外的动物的实例可以列举:牛、猪、羊、马、骆骑、大鼠等。乳铁蛋白不仅是在如上所述的鼻粘膜中，而且是在各种组织中发现、分泌的蛋白质。在人类的各种组织中，使用根据作为利用下一代序列发生器进行表达解析的方法之一的 CAGE 法(Kanamor1-Katayama M, et al.Genome Res.(2011)5 月 19)得到的数据，来获得将编码乳铁蛋白的蛋白质的RNA表达量为何种程度进行解析、比较的数据，因此作为参考示于表I。其结果可知，乳铁蛋白的表达量高的组织有各种组织，暗示本发明的预处理方法的可应用性宽广。
(表 I)
权利要求
1.物样本的预处理方法，其是包含RNA的生物样本的预处理方法，其特征在于: 所述生物样本包含乳铁蛋白(Lactferrin), 对所述生物样本实施乳铁蛋白的RNA分解活性抑制处理。
2.权利要求1的生物样本的预处理方法，其特征在于:通过在所述生物样本中添加乳铁蛋白的RNA分解活性抑制剂，来对所述生物样本实施乳铁蛋白的RNA分解活性抑制处理。
3.权利要求1或2的生物样本的预处理方法，其特征在于:所述生物样本包括:动物的鼻粘膜、鼻窦黏膜、气管粘膜、唾液、来自口腔或咽喉的分泌液、泪、乳汁、胆汁、血液(白细胞)、子宫颈管的粘膜、内外生殖器的粘膜、羊水、或尿。
4.权利要求3的生物样本的预处理方法，其特征在于:所述动物为人类。
5.权利要求1至4中任一项的生物样本的预处理方法，其特征在于:所述生物样本包括人类鼻粘膜。
6.权利要求1至5中任一项的生物样本的预处理方法，其特征在于:进一步对所述生物样本实施溶菌酶C (Lysozyme C)的反转录抑制活性抑制处理。
7.权利要求6的生物样本的预处理方法，其特征在于:通过在所述生物样本中添加溶菌酶C(Lysozyme C)的反转录抑制活性抑制剂,来对所述生物样本实施溶菌酶C(LysozymeC)的反转录抑制活性抑制处理。
8.权利要求7的生物样本的预处理方法，其特征在于:所述RNA分解活性抑制剂及所述反转录抑制活性抑制剂中的至少一种包括铁离子剂及碳酸根离子剂。
9.权利要求8的生物样本 的预处理方法，其特征在于:对添加了所述铁离子剂及碳酸根离子剂的所述生物样本进行加热处理。
10.权利要求1至9中任一项的生物样本的预处理方法，其特征在于:进一步在所述生物样本中添加极性表面活性剂。
11.权利要求10的生物样本的预处理方法，其特征在于:所述极性表面活性剂为SDS。
12.测方法，其是生物样本中的RNA的检测方法，其特征在于: 所述生物样本包含乳铁蛋白(Lactferrin), 并且包括:对所述生物样本进行预处理的预处理步骤，及 通过对经所述预处理的生物样本中的所述RNA进行扩增而进行检测的RNA扩增检测步骤， 所述预处理步骤通过权利要求1至11中任一项的生物样本的预处理方法实施。
13.权利要求12的检测方法，其特征在于:所述预处理步骤通过权利要求1至9中任一项的生物样本的预处理方法实施， 在所述RNA扩增检测步骤中，在经所述预处理的生物样本中进一步添加表面活性剂。
14.权利要求13的检测方法，其特征在于:所述表面活性剂为非极性表面活性剂。
15.权利要求12至14中任一项的检测方法，其特征在于:所述RNA的扩增通过使用反转录酶的基因扩增方法而实施。
16.权利要求15的检测方法，其特征在于:所述基因扩增方法是使用链置换DNA聚合酶的等温扩增方法。
17.处理试剂盒，其是包含RNA的生物样本的预处理试剂盒，其特征在于: 所述生物样本包含乳铁蛋白(Lactferrin),并且所述预处理试剂盒包含乳铁蛋白的RNA分解活性抑制剂。
18.权利要求17的预处理试剂盒,其特征在于:进一步包含溶菌酶C(Lysozyme C)的反转录抑制活性抑制剂。
19.权利要求18的预处理试剂盒，其特征在于:所述RNA分解活性抑制剂及所述反转录抑制活性抑制剂中的至少一种包含铁离子剂及碳酸根离子剂。
20.权利要求19的预处理试剂盒，其特征在于:以相互不接触的状态包含所述铁离子剂及所述碳酸根离子剂。
21.权利要求17至20中任一项的预处理试剂盒，其特征在于:进一步包含极性表面活性剂。
22.权利要求21的预处理试剂盒，其特征在于:所述极性表面活性剂为SDS。
23.权利要求17至20中任一项的预处理试剂盒，其特征在于:进一步包含非极性表面活 性剂。
全文摘要
提供能够迅速且简便地检测RNA的预处理方法。通过在包含人类鼻粘膜的生物样本中添加例如铁离子及碳酸根离子，来抑制存在于人类鼻粘膜的乳铁蛋白的RNA分解活性。如果使用经预处理的生物样本，则可以使用反转录酶扩增RNA病毒的基因。铁离子及碳酸根离子也可以抑制人类鼻粘膜中的溶菌酶C的反转录酶抑制。另外优选通过在包含人类鼻粘膜的生物样本中添加SDS，来除去RNA病毒的被膜。
文档编号C12N9/36GK103097531SQ201280001834
公开日2013年5月8日 申请日期2012年6月28日 优先权日2011年6月29日
发明者林崎良英, 臼井健悟, 合田砂织, 野村和仁, 川井雄辉 申请人:达纳福股份有限公司